nghiên cứu chọn chủng bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn cần giờ có hoạt tính diệt sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------

Nguyễn Thiện Phú

NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG
BACILLUS THURINGIENSIS
TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------

Nguyễn Thiện Phú

NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG
BACILLUS THURINGIENSIS
TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. TRẦN THANH THỦY

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2013


LỜI CẢM ƠN
 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình
hướng dẫn, luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến hành đề tài.
 Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm
TP. Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.
 Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Hữu Phúc, TS. Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới),
cô Tâm, chị Trang, anh Nghĩa (Công ty Vipesco) đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành đề tài.
 Tôi xin cảm ơn chị Trần Thị Minh Định, chị Phùng Ngọc Thùy Linh, chị Hồ Thị
Mỹ Linh, bạn Phạm Thị Lịch đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi.
 Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên
cạnh, động viên và ủng hộ tôi.
Nguyễn Thiện Phú

1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu
tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thiện Phú

2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... 1
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. 2
MỤC LỤC ......................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 6
MỞ ĐẦU............................................................................................................................ 7
1. Lí do chọn đề tài.................................................................................................................. 7
2. Mục tiêu ............................................................................................................................... 7
3. Nhiệm vụ .............................................................................................................................. 8
4. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................... 8
5. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................... 8
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 9
1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ ............................................................................................... 9
1.2. Tổng quan về Bt ............................................................................................................. 12
1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt ............................................................................................... 12
1.2.2. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 13
1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt .............................................................. 16
1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc ........................................................................................... 17
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể độc.... 21
1.2.6. Đối tượng tác động của Bt ......................................................................................... 22
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Bt ......................................................................... 24
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................... 24
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ........................................................................................ 26
1.3.3. Các hướng phát triển của thuốc trừ sâu Bt ................................................................ 27
1.4. Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt ............................................................................ 28
1.4.1. Tuyển chọn chủng ...................................................................................................... 28

1.4.2. Lên men chìm ............................................................................................................ 29
1.4.3. Thu hồi sản phẩm ....................................................................................................... 30
1.4.4. Tạo chế phẩm ............................................................................................................. 30
1.4.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm ................................................................................... 30
3


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 32
2.1. Vật liệu ............................................................................................................................ 32
2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................... 32
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 32
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................... 32
2.1.4. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng ..................................................................... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................. 33
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt ............................................................................ 33
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống bằng dầu khoáng ........................................................ 34
2.2.3. Định danh đến loài các chủng Bacillus bằng sinh học phân tử ................................. 34
2.2.4. Phương pháp nhân giống ........................................................................................... 35
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt ........................ 36
2.2.6. Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc ..................................................... 37
2.2.7. Định lượng mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang .................................... 37
2.2.8. Phương pháp nuôi và nhân giống sâu tơ .................................................................... 38
2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu ........................................................................... 39
2.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh
thể độc .................................................................................................................................. 40
2.2.11. Phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của Bt ........................ 41
2.2.12. Phương pháp tạo chế phẩm Bt ................................................................................. 43
2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .................................................................. 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 44

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ ........................... 44
3.2. Khảo sát hoạt tính diệt sâu của các chủng VK có tinh thể độc ................................. 49
3.2.1. Kết quả xác định số lượng BT, tinh thể ..................................................................... 50
3.2.2. Kết quả hoạt lực diệt sâu ............................................................................................ 51
3.3. Định danh bằng sinh học phân tử chủng P14 ............................................................. 54
3.4. Đặc điểm sinh học của chủng đã tuyển chọn .............................................................. 54
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành
bào tử, tinh thể độc ............................................................................................................... 56
3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào
tử, tinh thể độc ..................................................................................................................... 56

4


3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành BT,
tinh thể độc ........................................................................................................................... 58
3.6. Bước đầu khảo sát so sánh khả năng sinh trưởng và sinh tinh thể độc của chủng
Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan ...................... 60
3.6.1. So sánh khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc ....................................................... 60
3.6.2. So sánh hoạt tính diệt sâu .......................................................................................... 62
3.7. Kết quả kiểm tra sự hiện diện gen sinh nội độc tố của Btk14 ................................... 64
3.8. Tạo chế phẩm và thử nghiệm hoạt tính chế phẩm ..................................................... 66
3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của chủng Btk14 trong chế phẩm ................................ 68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 70
4.1. Kết luận........................................................................................................................... 70
4.2. Kiến nghị......................................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 72
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 78

5


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BT

Bào tử

Bt

Bacillus thuringiensis

Btk

Bacillus thuringiensis var. kurstaki

CFU

Colony forming unit
(Số đơn vị khuẩn lạc)

kDa

kiloDalton

KHV

Kính hiển vi

KL

Khuẩn lạc

NXB

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang

PBS

Dung dịch đệm

RNM

Rừng ngập mặn

TB

Tế bào

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

6


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Sinh vật hại cây trồng là một trong những nguyên nhân lớn nhất làm giảm năng suất,
gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp. Trung bình mỗi năm lượng nông sản bị mất mát
do sinh vật hại khoảng 22% (Khan, 2008). Vì vậy, việc tiêu diệt chúng trở nên vô cùng cấp
thiết.
Trong giai đoạn đầu, thuốc hóa học bảo vệ thực vật được sử dụng rộng rãi vì có nhiều
ưu điểm nổi trội. Tuy nhiên, thuốc hóa học cũng có nhiều nhược điểm như gây ra những tác
dụng không nhỏ với môi trường và sức khỏe con người, gây mất cân bằng sinh thái và tạo nên
hiện tượng kháng thuốc ở sinh vật hại. Vì vậy, việc tạo ra thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học
(từ VSV), sẽ khắc phục các nhược điểm của thuốc hóa học, và tạo nên một bước tiến mới trong
công tác bảo vệ thực vật. Các sinh vật như: virus, VK, nấm, tuyến trùng… được ứng dụng rộng
rãi để hạn chế tác hại của các sinh vật hại cây trồng.
Trong số hàng loạt những VK có khả năng tiêu diệt sâu hại, Bt là tác nhân sinh học đầu
tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới, đồng thời là sản phẩm
thuốc trừ sâu sinh học nổi tiếng nhất hiện nay.
RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, độ đa dạng sinh học được đánh giá
cao trong khu vực Đông Nam Á. Ngoài hệ động thực vật, rừng ngập mặn Cần Giờ còn chứa
đựng một tài nguyên sinh vật khác – đó là thành phần khu hệ VSV nơi này. Các chủng VSV
phân lập từ RNM được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nông nghiệp, nhờ khả năng
sinh ra các chất có hoạt tính sinh học cao. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học thuộc
Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện trong đất nơi này có Bt có khả năng diệt
sâu.
Từ những lí do trên, tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chọn chủng Bacillus
thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu”.

2. Mục tiêu
- Thu nhận các chủng Bt có hoạt lực mạnh trong diệt sâu hại cây trồng làm cơ sở khoa học
trong việc tạo chế phẩm.

7


3. Nhiệm vụ
1. Phân lập các chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ.
2. Tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp cải.
3. Phân loại chủng VK tuyển chọn đến loài bằng sinh học phân tử.
4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng Bt được tuyển chọn.
5. Khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc của chủng Bt nghiên cứu và so sánh
với chủng phân lập từ chế phẩm nước ngoài.
6. Kiểm tra sự hiện diện của gen sinh độc tố của chủng Bt nghiên cứu.
7. Bước đầu tạo chế phẩm diệt sâu và thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm.

4. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ.
- Chủng Bt phân lập từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan.
- Sâu tơ hại bắp cải nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam - Vipesco.

5. Ý nghĩa của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần tìm hiểu khả năng diệt sâu tơ gây hại bắp cải của Bt ở RNM Cần Giờ.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Dựa vào kết quả thu được của đề tài có thể ứng dụng tạo chế phẩm để phòng trừ sâu tơ
hại bắp cải.

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ
Chí Minh.

8


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ
Theo Phan Nguyên Hồng (1999) RNM Việt Nam chia thành 4 khu vực với 12 tiểu khu.
Khu vực I: Ven biển Đông Bắc, từ Mũi Ngọc đến mũi Đồ Sơn.
Khu vực II: Ven biển đồng bằng Bắc Bộ, từ mũi Đồ Sơn đến mũi Lạch Trường.
Khu vực III: Ven biển Trung Bộ, từ mũi Lạch Trường đến mũi Vùng Tàu.
Khu vực IV: Ven biển Nam Bộ, từ mũi Vùng Tàu đến mũi Nai - Hà Tiên.[12]

Địa điểm thu mẫu
Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ
( />Trong số các RNM ở Việt Nam, RNM Cần Giờ có độ đa dạng sinh học được đánh giá
cao ở khu vực Đông Nam Á. RNM Cần Giờ được phát triển dựa trên sự lắng đọng và bồi tụ

9


phù sa từ sông Sài Gòn, hạ lưu là sông Lòng Tàu, Ngã Bảy, sông Đồng Tranh và Soài Rạp,
nằm ở cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh.
RNM Cần Giờ có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha với đặc điểm tự nhiên như sau:
• Khí hậu: có hai mùa, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng
4 năm sau. Nhiệt độ trung bình là 25,8oC. Lượng mưa thấp từ 1,300 – 1,400mm/năm.
• Địa hình: tương đối bằng phẳng, cao trung bình 1,5m.

• Thổ nhưỡng: gồm các loại đất mặn, đất mặn ít phèn, đất mặn phèn nhiều, đất cát mịn có
pha ít bùn ven biển.
• Chế độ thủy triều: có chế độ bán nhật triều không đều, mực triều trung bình là 2m, khi
triều cao có thể dâng đến 4m.
• Độ mặn: độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Vào khoảng tháng
4, nước mặn chiếm ưu thế hơn trong mối tương tác sông – biển, nước mặn xâm nhập sâu
hơn vào trong vùng đất liền. [56]
RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú. Tuy nhiên, những nghiên cứu về
RNM Cần Giờ chủ yếu tập trung vào hệ động, thực vật. VSV là đối tượng phân bố rộng rãi và
được xem là “kho báu” của hệ sinh thái RNM Cần Giờ nhưng chỉ mới được quan tâm gần đây.
Những nghiên cứu về vi sinh vật RNM cho thấy chúng có tính thích nghi cao với điều kiện khí
hậu khắc nghiệt ở đây và chúng có khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so
với điều kiện môi trường khác.
Nhiều công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước cho thấy RNM là nơi lưu giữ và
phân huỷ các chất thải từ nội địa chuyển ra. Nhờ các VSV mà các chất này trở thành chất dinh
dưỡng cho nhiều sinh vật khác và môi trường được trong sạch [60]. VSV trong đất RNM bao
gồm VK, nấm sợi, nấm men và xạ khuẩn đều có khả năng khả năng sinh các enzym ngoại bào
mạnh như cellulase, amylase, protease, chitinase giúp phân huỷ các hợp chất ở lớp đất mặt như tinh
bột, cenlulose, pectin, gelatin, casein, chitin có trong xác động vật và thực vật và một số hợp chất
phức tạp hơn như carboxyl methyl cellulose (CMC), các chất lignocellulose ở các mức độ khác
nhau. Một số nấm sợi phân giải được các hợp chất phospho khó tan. Chúng phân huỷ các mùn
bã cây ngập mặn tại chỗ, cung cấp nguồn thức ăn cho khu hệ động thực vật RNM rất phong
phú ở các kênh rạch và vùng biển nông. [59]

10


Theo Aksornkoae (1993), VK cùng với nấm là những sinh vật quan trọng nhất tham gia
vào quá trình phân hủy thực vật rụng của cây ngập mặn. Trong thời gian phân hủy lá, sinh khối
của nấm giảm trong khi sinh khối VK ổn định hoặc tăng trong suốt giai đoạn phân hủy. Hieber

& Gessner (2002) cho rằng thời gian tạo ra thế hệ mới của VK ngắn hơn so với nấm nên sinh
khối VK tạo ra là rất lớn, vì vậy VK có vai trò vô cùng quan trọng khi tham gia vào quá trình
phân hủy xác thực vật. VK dị dưỡng là nhóm có số lượng nhiều nhất trong các nhóm vi sinh
vật có vai trò chủ chốt trong quá trình phân hủy vật chất hữu cơ, khép kín chu trình sinh địa hóa
hệ sinh thái RNM. Chúng tham gia phân hủy xác động thực vật và chất rơi rụng trong RNM tạo
nguồn thức ăn phế liệu phong phú cung cấp cho các loài động vật ăn phế liệu. Chúng cũng
tham gia phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo nguồn thức ăn khoáng cho cây ngập mặn trong hệ
sinh thái. Bản thân VK cũng là nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu
trùng của một số loài. Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ thường gặp trong hệ sinh thái
RNM của các chủng VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM mới phục hồi cũng như RNM tự nhiên
là tương đối cao. [60]
Trong số VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM, có rất nhiều chủng là VK hiếu khí không
bắt buộc, chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong cả điều kiện môi trường có oxy và
thiếu oxy. Chúng có vai trò không nhỏ trong quá trình phân hủy xác động thực vật RNM, bên
cạnh nấm và các sinh vật phân hủy khác, khi những sinh vật này chỉ có thể phát triển tốt trong
điều kiện môi trường có sẵn oxy tự do. Đại đa số VK dị dưỡng ở đất RNM và trong lá đang
phân hủy có hình que, có khả năng di động và số VK Gram âm (-) chiếm tỷ lệ tương đối lớn.
Phần lớn chúng là VK chịu mặn và ưa ấm. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 22-37oC, khi độ mặn
trong môi trường nuôi cấy lên đến 5% thì đa số các chủng bị ức chế sinh trưởng. [60]
Sự phân bố về số lượng cũng như thành phần loài của VSV trong các thủy vực khác
nhau là rất khác nhau, trong đó các yếu tố có tính chất quyết định là hàm lượng muối, chất hữu
cơ, pH, độ đục, nhiệt độ. Trong các vùng ven biển nước lợ với nồng độ muối thường dưới 3%
ngoài các VK biển thật sự và các VK nước ngọt chịu mặn, còn tìm thấy các VK nước lợ ưa
mặn. Nồng độ muối tối ưu của chúng thường nằm trong khoảng 0,5% đến 2%. Các VK nước lợ
thường phát triển rất yếu hoặc hoàn toàn không phát triển được trong các môi trường nước ngọt
và rất hay bị ức chế sinh trưởng ở các nồng độ muối trên 3%. [56]
11


Khả năng sinh kháng sinh của nhiều loài VK, nấm men, đặc biệt là nấm sợi. Các chủng

VSV có hoạt tính kháng sinh mạnh thuộc các chi Trichoderma, Penicillium, Cephaloporium,
Paecilomyces. Các VSV sinh kháng sinh này còn có tác dụng ức chế các VSV gây bệnh cho
động, thực vật, làm sạch môi trường bị ô nhiễm ven biển.[59]
Các nghiên cứu VSV trong RNM vùng ven biển cho thấy có tới 83/199 chủng nấm sợi
có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau như các loài nấm sợi thuộc một số chi
Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela (Trang và cs, 2003)
làm cho môi trường nước biển trong sạch, tạo điều kiện thuận lợi cho các tảo phù du quang
hợp, cung cấp O2 cho nhiều loài hải sản. Sự phát triển của chúng cũng làm tăng nguồn thức ăn
cho các động vật ở vùng biển. [59]
Qua phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ (TP.HCM), các nhà khoa học đã phát hiện
những chủng Bt sinh nhiều tinh thể có khả năng diệt trừ đặc hiệu một số loài côn trùng gây hại
cho người và động, thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi… Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh độc lực của chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ là rất cao với ấu
trùng sâu và muỗi. [59]
Như vậy, việc nghiên cứu các chủng VSV trong đó có VK từ RNM là một hướng đi
đúng đắn.

1.2. Tổng quan về Bt
1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt
Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt ra đời và phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ
thuật của nhân loại. Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. [7],
[53]
Năm 1870, Louis Pasteur, khi nghiên cứu về bệnh trên dâu tằm, đã phát hiện ra một loại
VK gây bệnh cho tằm và đặt tên là Bacillus bombycos.
Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật, khi đang thực hiện một
cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto làm chết đột ngột nhiều quần thể tằm, đã
phân lập được một loại VK đặt tên là Bacillus sotto.
Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức, đã phân lập được VK giết
hại mối Mediterranean flour. Ông phát hiện ra đây chính là loài VK mà Ishiwatari Shigetane đã
12

công bố, và đặt tên lại cho loài VK này là Bacillus thuringiensis. Tên gọi này được xuất phát
từ địa danh Thuringia, là một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó.
Năm 1915, Matter khi phân lập từ ấu trùng bướm – mọt bột (Anagasta keuehmella) đã
tái phát hiện ra VK gây bệnh này và chính thức được đặt tên là Bacillus thuringiensis. Cũng
trong thời gian này, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố có bản chất là
protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính là nguyên nhân khiến các con
mối bị giết hại. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt động của loại protein này vẫn chưa được
khám phá.
Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước phát triển bắt đầu sử
dụng sinh khối Bt phun cho cây trồng như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh. Pháp là nước sử
dụng Bt sớm nhất (1938), đồng thời đã chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác
sâu nhiễm Bt, gọi là Sporine dùng để diệt mọt bột.
Năm 1956, Hannay, Fitz - James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân chính
quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân tử protein, được sản sinh trong
cơ thể Bt. Những kết quả nghiên cứu trên đã mở ra cho các nhà khoa học hướng nghiên cứu
mới về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt.
Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu được sử dụng
rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Đến năm 1961, Bt được đánh giá là một loại thuốc trừ sâu thân
thiện với con người và môi trường trong chiến lược phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ
môi trường EPA (Environmental Protection Agency) ở Mỹ. Năm 1977, đã có 13 loài Bt được
phát hiện và công bố. Các nghiên cứu về phổ kháng cho thấy Bt không chỉ gây độc với một giai
đoạn nhất định trên ấu trùng của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh
cứng.
Từ năm 1980 trở đi, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả
các loại cực độc như DDT và 666,… ngày càng gia tăng. Để giải quyết những vấn đề đó, các
chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thể độc
do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng trong môi
trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi. [8], [18], [23], [27].

1.2.2. Đặc điểm phân loại
Vị trí phân loại của Bt
13


- Lớp Shyzomycetes
- Bộ Eubacteriales
- Họ Bacillaceae
- Giống Bacillus
- Loài Bacillus thuringiensis [5]
Bt được chia làm nhiều loài phụ dựa trên các đặc điểm sau:
- Khả năng hình thành enzyme leucitinase.
- Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng.
- Đặc tính huyết thanh học.
- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng. [6]
Đến nay, phương pháp phân loại Bt được sử dụng phổ biến là dựa trên các đặc tính
huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định chủ yếu dựa trên kháng
nguyên tiên mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với các
kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên, việc phân loại chỉ dựa trên type huyết thanh chưa
phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển
chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị
đưa ra phương pháp phân loại mới. Phương pháp này dựa trên kết quả xác định type huyết
thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể. [3]
Bảng 1.1. Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng
Type huyết
thanh

Chủng đại diện

Viết tắt

Người nghiên cứu

1

Bt. var.
thuringiensis

THU

Bliner (1915), Heimpel & Angus
(1958)

3a, 3b

Bt var. kurstki

KUR

De Barjac & Lemill (1970)

4a, 4b

Bt var. sotto

SOT

Ishiwata (1905), Heimpel & Angus
(1958)

5a, 5b

Bt var. candensis

CAN

De Barjac & Bonnefoi (1972)

8b, 8d

Bt var. nigeriensis

NIG

Weiser & Prasertphon (1954)

14

Bt var. israelensis

ISR

De Barjac & cộng sự (1992)

30

Bt var. medellin

MED

Orduz & cộng sự (1992)

33

Bt var. leesis

LEE

Lee &cộng sự (1944)
14


46

Bt var. chanpansis

CHA

Chainpaisang (1994)

48

Bt var. balearica

BAL

Iriate Garcia (1995)

49

Bt var. muju

MUJ

Park (1995)

50

Bt var. navarrersis

NAV

Iriate Garcia

15


1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt
Bt là trực khuẩn Gram (+) sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, kích thước 1 - 1,2 x 3 - 5
µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể
độc có khả năng diệt sâu. Tinh thể protein được hình thành trong giai đoạn tạo bào tử, kích
thước 0,6 – 2 µm. Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ 15 - 450C nhưng thích hợp nhất 290C –
300C. Bào tử dạng hình oval, hình trứng dài 1,6 – 2 µm.

Hình 1.2. Hình thái tế bào của Bt
( />Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt bao gồm:
 Làm ngưng kết sữa, làm trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose…,
hình thành acid.
 Không hình thành indol, có phản ứng dương tính với methyl đỏ, phản ứng VP dương
(ethiryl methyl methanol)

 Có tác dụng hòa tan môi trường huyết thanh ngựa agar, có thể mọc trên môi trường
cianate, khử muối nitrate thành nitrite, không khử muối sulphate, sản sinh enzyme
phospholipase.[1], [26], [27].

16


Hình 1.3. Tinh thể protein của Bt
( />1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc
1.2.4.1. Các độc tố của Bt
Bt có khả năng tạo 4 loại độc tố:
 Ngoại độc tố α (α - exotoxin): được phát hiện giữa những năm 1950 từ VK Bacillus
thuringiensis vanenlesti bởi C.Toumaroff. Ngoại độc tố α còn gọi là enzyme leucintinase, có
hoạt tính phospholipase, tác động chủ yếu lên gốc phospholipid của màng tế bào sâu, giúp cho
VK gây bệnh dễ xâm nhập vào các xoang trong cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme leucintinase
đã trực tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột của sâu. [5], [28]
 Ngoại độc tố β (β - exotoxin): do Hall và Arkavc phát hiện vào năm 1959 khi nuôi ấu
trùng muỗi bằng thức ăn chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi
độc tố này được xử lý ở 120oC trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Cơ chế tác động của ngoại
độc tố β là cạnh tranh ATP với các enzyme RNA polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động của
enzyme, ngừng tổng hợp RNA, gây rối loạn sinh tổng hợp protein. Mặt khác, khi ngoại độc tố
β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiến côn trùng chết nhanh chóng. Ngoại độc tố
δ làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột giữa côn trùng, còn ngoại độc tố β xâm nhập vào
huyết tương và máu gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng. Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại
côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non.

17


Ngoại độc tố β gây cản trở sự lột xác của côn trùng. Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β

còn tiêu diệt cả trứng côn trùng. [28]
 Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin): là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn
và một số amino acid tự do. Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không khí, ánh sáng,
nhiệt độ và oxy nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ chế tác dụng của ngoại độc tố γ
cũng tương tự như ngoại độc tố α. [30], [39]
 Nội độc tố δ (δ - endotoxin) còn được gọi là tinh thể Cry hay ICPs. So với 3 nhóm ngoại
độc tố trên, tinh thể độc Cry được tạo ra với lượng lớn hơn nhiều và có hiệu quả gây độc cho
côn trùng hơn.
Tinh thể Cry được tạo thành trong giai đoạn tạo BT, tác dụng độc đặc hiệu với các loài
côn trùng. Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng. Tinh thể có thể ổn
định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 – 12), có thể bị biến tính trong acid
trichloacetic, chlorua thủy ngân. Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhất
định (ở 65oC có thể giữ được 1 h, 80oC có thể giữ được 20 phút). Những nghiên cứu gần đây về
cấu trúc nội độc tố δ cho thấy protein này có 3 vùng chức năng:
 Vùng I là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α. Một vài chuỗi hoặc tất cả các chuỗi có thể
cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ, từ đó các ion có thể qua lại tự do.
 Vùng II chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng nguyên của
globulin miễn dịch. Vùng này có vai trò gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu
mô ruột.
 Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa không bị phân hủy bởi
protease ở ruột.
Với cấu trúc phúc tạp như vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên màng tế
bào biểu mô ruột của sâu, gây ra tác động dây chuyền. Chính điều này làm nên tính đặc hiệu rất
cao trong hiệu quả tác động của Bt lên sâu hại. Đã có hơn 50 gen mã hóa cho protein tinh thể
độc đã được giải mã cho phép phân loại các chất độc này thành 15 nhóm dựa trên sự giống
nhau trong trình tự gen. [26], [31], [34]

18

Hình 1.4. Nội độc tố δ của Bt
( /> Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại côn trùng và
được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốc trừ sâu không độc hại với môi
trường, con người và động vật. [3], [4]
1.2.4.2. Cơ chế gây độc
Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào biểu mô ruột giữa
của côn trùng ở pH kiềm. Tinh thể tan vào môi trường kiềm của ruột giải phóng ra protein tinh
thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease. Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một
nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ 60 kDa bền với protease. Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein
135 kDa chưa bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc với côn trùng gọi là “protoxin",
còn lõi 60 kDa gây độc với côn trùng gọi là “toxin”. Quá trình biến đổi từ tinh thể độc protoxin
thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể độc. Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể
độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và hệ enzyme. Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc
không giải phóng ra protoxin. Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme không phù
hợp thì toxin cũng không được tạo ra. Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạt hoá thành
toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu mô ruột, độc tố vô tác
dụng.
Những nghiên cứu về hình thái của côn trùng sau khi bị chết bởi Bt cho thấy ruột của
côn trùng bị tổn thương. Nguyên nhân chủ yếu là do hình thành các lỗ hổng trên các tế bào biểu
19


mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của ruột. Có ba mô hình giải thích cơ
chế hoạt động của toxin như sau:
 Mô hình 1 thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấu keo” bao gồm sự
tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố. Khi độc tố liên kết với các receptor
trên màng sẽ hình thành một phức hệ. Phức hệ này tạo nên một lỗ xuyên qua màng tế
bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của nhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn
đến gây rối loạn chức năng của ruột [30], [35].
 Mô hình 2 cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất cao đối với

ion K+. Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển amino acid phụ thuộc
K+ bị ức chế bởi độc tố tinh thể. Cụ thể, những lỗ này dễ cho K+ đi vào, sau đó làm giảm
gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận chuyển amino acid trong cơ thể sâu. [35],
[42]
 Mô hình 3 cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của tế bào biểu mô ruột.
Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K+ tràn vào không giới hạn từ đó
làm ức chế sự hấp thụ amino acid. [46]
Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thể độc sau khi xâm
nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì phải được hoạt hoá thành toxin và
toxin phải gắn được lên tế bào biểu mô ruột.

Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của tinh thể độc tố diệt côn trùng
( />
20


1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể
độc
1.2.5.1. Các yếu tố vật lý, hóa học
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của Bt bao gồm: nhiệt độ, nguồn C, N,
các ion kim loại... Điều kiện tối ưu cho Bt sinh trưởng là 28 – 30oC. Nếu nhiệt độ là 15oC thì
bào tử không hình thành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể. Ngoài các thành phần
là protein chiếm phần lớn, trong tinh thể còn có mặt các nguyên tố kim loại như Mn, Mg, Ni,
Zn, Al, Ca, Fe…. Trong đó, Mn và Mg ảnh hưởng mạnh đến quá trình hình thành tinh thể độc.
Một số amino acid như leucine, isoleucine gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn
nên giảm lượng tinh thể độc. Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình
thành BT, tinh thể độc. Các chủng đột biến mất khả năng sinh protease ngoại bào thì không có
khả năng sinh tinh thể độc và bào tử.[33]
1.2.5.2. Bacteriophage
Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm

nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào
chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế
bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Bt cũng là một đối tượng rất dễ bị xâm
nhiễm bởi thực thể. Một số nghiên cứu cho thấy, trong quá trình lên men, Bt bị thực khuẩn thể
xâm nhiễm làm hỏng mẻ cấy, phá hủy tế bào, dẫn đến chế phẩm Bt có hiệu quả thấp. [51]

Hình 1.6. Các loại bacteriophage xâm nhiễm trên Bt
( />
21


1.2.6. Đối tượng tác động của Bt
Các tinh thể độc của Bt có thể diệt được côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh
cứng (Coleoptera), bộ Cánh vảy (Lepidoptera) và một số côn trùng khác. Trong đó, sâu tơ
(Plutella xylostella) được quan tâm nhiều hơn cả. [52]
1.2.6.1. Phân loại sâu tơ
Sâu tơ (còn gọi là sâu dù) hại rau cải. Sâu có tên khoa học là Plutella xylostella Curtis,
còn có tên khác là Plutella maculipennis Curtis, thuộc họ Yponomeutidae, bộ Lepidoptera
(cánh vảy). [52]
1.2.6.2. Phân bố và ký chủ của sâu tơ
Sâu tơ đầu tiên được ghi nhận có nguồn gốc từ Thổ Nhĩ Kỳ; sau đó phát triển ở hầu hết
các quốc gia trồng rau cải trên thế giới. Sâu tơ có thể sống được ở hầu hết các quốc gia trồng
rau cải, ôn đới lẫn nhiệt đới và là mối lo ngại lớn nhất cho các nhà trồng rau cải hiện nay.
Sâu được ghi nhận là phá hại trên rất nhiều loại rau cải khác nhau như cải bắp, cải bẹ
xanh, cải bẹ trắng, cải ngọt, cải bông, cải rổ; nhưng trầm trọng nhất là trên cải bắp, cải bông.
Ngoài ra, sâu tơ còn gây hại trên một số loại cây họ Cà như khoai tây, cà chua... [52]
1.2.6.3. Đặc điểm hình thái và sinh học của sâu tơ
Sâu có 4 tuổi, phát triển từ 7 - 15 ngày tùy điều kiện thức ăn và thời tiết. Mình sâu nở to
chính giữa, hai đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng. Sâu có
ba cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, mình sâu dài từ 8 - 11 mm. Chi tiết ở từng giai đoạn tuổi

như sau:
•

Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2
- 1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2 - 4 ngày.

•

Tuổi 2: mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5 3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1 - 3 ngày.

•

Tuổi 3: mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 - 5,5 mm và phát triển từ 1 - 3 ngày.

•

Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5 - 9 mm, phát triển từ 1 4 ngày. Ấu trùng tuổi 4 sau khi đạt kích thước tối đa, bắt đầu nhả tơ làm nhộng. Đầu

22


tiên, sâu quay đầu về phía sau đuôi nhả tơ bao phủ phần đuôi trước, dần dần tới phía trên
đầu. Sau khi nhả tơ xong sâu lột xác lần cuối cùng để thành nhộng.
Khi mới hình thành, nhộng có màu xanh nhạt, khoảng 2 ngày sau thành màu vàng nhạt,
chiều dài nhộng từ 5 - 7 mm, chung quanh nhộng có kén bằng tơ bao phủ. Thời gian của giai
đoạn nhộng từ 4 - 7 ngày. [52]
Bướm dài từ 6 - 10 mm. Sải cánh rộng từ 10 - 15 mm. Cánh trước màu nâu xám, trên có
nhiều chấm nhỏ màu nâu; từ chân cánh ra đến cạnh ngoài của cánh trước có một dải hình răng
cưa màu trắng trên bướm đực và màu vàng trên bướm cái, dải này gợn sóng, nhìn có cảm giác
óng ánh và lấp lánh. Hai cạnh của cánh sau có rìa lông rất dài. Khi đậu cánh xếp xuôi theo thân

và dựng đứng phía trên thân mình, đuôi cánh hơi nhô lên cao. Râu dầu dài từ 3 - 3,5 mm và
luôn đưa tới trước rất linh hoạt. Thời gian sống của bướm từ 4 đến khoảng 17 ngày tùy giống
cái hay đực và tùy điều kiện sống. Một bướm cái có thể đẻ đến 200 trứng, trung bình 90 trứng
và đẻ cao điểm vào đêm thứ nhất và thứ nhì.
Trứng hình bầu dục, dẹp, màu vàng nhạt, đường kính từ 0,3 - 0,5 mm. Thời gian ủ trứng
từ 3-8 ngày.
1.2.6.4. Tập tính sinh sống và cách gây hại của sâu tơ
Sâu tuổi 1 đục một lổ nhỏ ở mặt dưới lá, chui đầu vào ăn nhu mô lá, chỉ chừa lại biểu bì.
Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới lá để lại lớp biểu bì mặt trên lá tạo thành những đốm trong mờ.
Cuối tuổi 2 trở đi sâu gặm lủng lá. Trên một cây cải bắp bị hại nặng có thể có từ 100 - 300 sâu.
Khi bị động đến sâu thường nhả tơ buông mình xuống đất nên loài sâu này còn có tên gọi là
"sâu dù". [52]
Bướm thuộc loại bướm đêm nhưng ít bị quyến rũ bởi ánh sáng đèn. Ban ngày bướm
thường ẩn ở mặt dưới lá rau cải, khi bị động mới bay lên một quãng ngắn, chiều tối bướm bay
ra bắt cặp và đẻ trứng. Bướm hoạt động nhiều nhất khi trời bắt đầu tối đến nửa đêm. Bướm có
thể giao phối ngay sau khi vũ hóa và một đến hai ngày sau thì đẻ trứng. Trứng được đẻ phân
tán hay thành từng khóm từ 3 - 5 cái ở mặt dưới lá, gần gân hay chỗ lõm trên lá. [52]

23