nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi γ amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Hà Tú Trâm
NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI
γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN
VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Hà Tú Trâm

NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI
γ-AMYLASE VI SINH VẬT DẠNG HÒA TAN
VÀ DẠNG CỐ ĐỊNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PSG.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin trân trọng bày tỏ lời cám ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS. TS Đồng Thị Thanh Thu, người đã khơi gợi đề tài cũng như đã tận tình
hướng dẫn khoa học, luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá
trình thực hiện luận văn này.
Xin ghi nhớ công ơn các Thầy Cô Khoa Sinh học, các Thầy Cô Phòng Sau
Đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt
kiến thức quý báu cho học viên chúng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
tại trường.
Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô thuộc bộ môn Sinh hóa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp Trường THPT
Chuyên Lê Hồng Phong, quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Đặc biệt tôi trân trọng bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Ngọc Danh và Thầy Lê Văn Thanh đã luôn quan
tâm, động viên và trợ giúp cho tôi trong thời gian theo học lên thạc sĩ.
Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn Lê Hồng Phú, Phan Thị Phương Dung,
Trần Quốc Tuấn, em Trương Thị Quỳnh Trâm, Trần Thị Ngọc Diệp đã cùng chia sẻ
kiến thức, kinh nghiệm cũng như giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến ba mẹ, những người
đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con
trong cuộc sống. Xin được gửi lời tri ân đến những người thân yêu trong gia đình
luôn hỗ trợ, động viên tôi trong học tập và nghiên cứu.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012
Hà Tú Trâm

i

MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................ 4
1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger.................................................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7] .......................................................................... 4
1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12] ............................................ 4
1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12] ...................................................... 4
1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12] ................................................. 5
1.1.3. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18] .......................................................... 6
1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14] ............................................................... 6
1.2.1. Đặc điểm nấm men .......................................................................................... 6
1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14] ......................................................... 6
1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20] ..................... 6
1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14] ............................................ 7
1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase .......................................................................... 7
1.3.1. Giới thiệu về enzyme ....................................................................................... 7
1.3.1.1.Khái niệm chung về E[11][2] .................................................................... 8
1.3.1.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận E ................................................................. 8
1.3.1.3. Phương pháp thu nhận E [17] ................................................................... 9
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp E của vi sinh vật [20] .... 10
1.3.2. Giới thiệu về γ-amylase [37][13] ................................................................... 11
1.3.2.1. Cấu trúc γ-amylase [37] ......................................................................... 11
1.3.2.2. Đặc tính [30] ........................................................................................... 12
1.3.2.3. Nguồn nguyên liệu thu nhận [35][39] .................................................... 13
1.4. Enzyme cố định (immobilized enzyme) ............................................................. 13
1.4.1. Khái quát sự cố định E [19] ........................................................................... 13
1.4.2. Vật liệu cố định enzyme [19]......................................................................... 13
1.4.2.1. Vật liệu vô cơ [16][5] ............................................................................. 13

ii

1.4.2.2. Vật liệu hữu cơ [19][21] ......................................................................... 13
1.4.3. Một số phương pháp chủ yếu tạo E cđ [19][22][25] ....................................... 14
1.4.3.1. Phương pháp vật lí [19][4] ..................................................................... 15
1.4.3.2. Phương pháp hóa học [19][24] ............................................................... 15
1.4.3.3. Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel [19] ................................... 15
1.4.3.4. Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi) [19]..................... 16
1.4.3.5. Phương pháp siêu lọc [19] ...................................................................... 16
1.4.4. Lựa chọn phương pháp cố định ..................................................................... 17
1.4.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định E [19]............................................ 17
1.4.5.1. Ảnh hưởng của chất mang [19] .............................................................. 17
1.4.5.2. Ảnh hưởng của pH [19] .......................................................................... 18
1.4.6. Ứng dụng E cđ và các thành tựu nghiên cứu về E cđ [23][27][28][29] ............ 18
1.4.6.1 Ứng dụng trong y học [19] ...................................................................... 18
1.4.6.2. Ứng dụng trong kỹ thuật sinh hóa [19][36]............................................ 19
1.4.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp [19] .......................................................... 19
1.4.6.4. Ứng dụng trong bảo vệ môi trường [19] ................................................ 20
trước khi đưa ra môi trường bên ngoài. .............................................................. 20
1.5. Sự thủy phân tinh bột và ứng dụng sản phẩm sau thủy phân ........................ 20
1.5.1. Đại cương về tinh bột [31] ............................................................................. 20
1.5.2. Đặc tính tinh bột sắn và tinh bột bắp [1][10] ................................................. 22
1.5.2.1. Đặc tính tinh bột sắn [1][10] .................................................................. 22
1.5.2.2. Đặc tính tinh bột bắp [14][31] ................................................................ 22
1.5.3. Các phương pháp thủy phân tinh bột [1][10] ................................................ 23
1.5.3.1. Thủy phân tinh bột bằng acid [10][32]................................................... 23
1.5.3.2. Thủy phân tinh bột bằng enzyme [11][33] ............................................. 23
1.5.4. Các sản phẩm thủy phân tinh bột và ứng dụng [14] ...................................... 24

PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 26
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 26


iii

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 26
2.2.1. Phương pháp giữ giống Asp. niger [20]......................................................... 26
2.2.2. Quan sát các đặc điểm hình thái của chủng giống Asp. niger [12][20] ......... 27
2.2.2.1. Quan sát đại thể [12][20] ........................................................................ 27
2.2.2.2. Quan sát vi thể bằng kĩ thuật làm phòng ẩm[20] ................................... 27
2.2.3. Phương pháp định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
[9][12][20] .................................................................................................................... 28
2.2.4. Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy
Asp. niger thu γ – amylase [8]...................................................................................... 29
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp γ – amylase từ Asp. niger
[3][7][9] ........................................................................................................................ 30
2.2.5.1. Thời gian nuôi cấy .................................................................................. 30
2.2.5.2. Thành phần môi trường thay đổi ............................................................ 30
2.2.6. Phương pháp thu nhận γ – amylase từ Asp. niger [9][14][25] ...................... 30
2.2.7. Xác định hoạt độ γ – amylase theo phương pháp so màu với DNS [9]......... 31
2.2.7.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 31
2.2.7.2. Cách tính ................................................................................................. 31
2.2.8. Định lượng protein hòa tan trong CPE theo phương pháp Lowry [12][26] .. 31
2.2.8.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 31
2.2.8.2. Hóa chất .................................................................................................. 32
2.2.8.3. Cách tiến hành ........................................................................................ 32
2.2.8.4. Cách tính ................................................................................................. 32

2.2.9. Xác định hoạt độ riêng của các chế phẩm enzyme [9] .................................. 33
2.2.10. Lựa chọn phương pháp cố định γ-amylase [9][19]...................................... 33
2.2.10.1. Cố định γ-amylase lên màng chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị
...................................................................................................................................... 33
2.2.10.2. Cố định γ-amylase lên chất mang là Celite (Diatomite) bằng phương
pháp hấp phụ [14]......................................................................................................... 34


iv

2.2.11. Phương pháp sử dụng γ-amylase cđ từ Asp. niger và thương mại để thủy
phân các loại tinh bột [12][15] ..................................................................................... 35
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của CPE γ-amylase cđ ............ 35
2.2.13. Ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh khối nấm
men [6], [9], [12] .......................................................................................................... 36
2.2.13.1. Thu nhận và định lượng glucose tạo thành trong dung dịch sau thủy
phân tinh bột ................................................................................................................. 36
2.2.13.2. Lên men thu sinh khối giàu protein ...................................................... 36
2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm [12] .............................................. 37
2.2.14.1. Xác định giá trị trung bình ................................................................... 37
2.2.14.2. Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn .............................................. 37
2.2.15. Phương pháp xây dựng đường chuẩn và hệ số góc a dựa trên phần mềm
excel [4] ........................................................................................................................ 38
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................................... 39
3.1. Bảo quản giống và định danh nấm mốc Asp. niger .......................................... 39
3.2. Kết quả quan sát đại thể và vi thể chủng giống Asp. niger.............................. 39
3.3. Định lượng mật độ bào tử trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu ..................... 40
3.4. Xác định hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo phương pháp so
màu DNS ..................................................................................................................... 40
3.4.1. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo sự thay đổi thành phần

môi trường .................................................................................................................... 40
3.4.1.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột bắp ...... 41
3.4.1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường khi cơ chất cảm ứng là bột năng .... 42
3.4.2. Hoạt độ γ-amylase từ canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy ......... 43
3.5. Nuôi cấy nấm mốc theo điều kiện tối ưu tuyển chọn về thời gian và thành
phần môi trường chất cảm ứng ................................................................................. 44
3.6. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường Asp. niger trên môi trường bán rắn
(trong điều kiện tối ưu trên) ...................................................................................... 45
3.7. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ........ 45


v

3.7.1. Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger
...................................................................................................................................... 46
3.7.2. Hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp. niger ........ 46
3.8. Sử dụng CPE γ-amylase hòa tan từ canh trường Asp. niger để thủy phân các
loại tinh bột khác nhau .............................................................................................. 46
3.9. Xác định hoạt độ riêng γ-amylase thương mại Dextrozyme theo phương
pháp so màu DNS ....................................................................................................... 49
3.9.1. Xác định hoạt độ chung CPE - TM theo phương pháp so màu DNS ............ 49
3.9.2. Xác định hàm lượng protein của CPE - TM theo phương pháp Lowry ........ 50
3.9.3. Xác định hoạt độ riêng của CPE γ-amylase thương mại ............................... 50
3.10. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại Dextrozyme GA để thủy phân các loại
tinh bột khác nhau ..................................................................................................... 51
3.10.1. Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân tinh bột tan ........................... 51
3.10.2 Sử dụng CPE γ-amylase – TM để thủy phân bột năng ................................. 52
3.11. Cố định CPE γ-amylase từ Asp. niger lên chất mang là diatomite bằng
phương pháp hấp phụ và lên chất mang là chitosan bằng phương pháp cộng hóa
trị .................................................................................................................................. 53

3.11.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang ..................................................... 53
3.11.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase ................................................... 54
3.12. Cố định CPE γ-amylase thương mại lên chất mang là diatomite bằng
phương pháp hấp thụ và lên chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị ............... 55
3.12.1. Hiệu suất gắn protein lên các chất mang ..................................................... 55
3.12.2. Hiệu suất cố định hoạt độ CPE γ-amylase thương mại ............................... 56
3.13. Sử dụng CPE γ-amylase cố định để thủy phân các loại tinh bột khác nhau
...................................................................................................................................... 56
3.13.1. Sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định để thủy phân các loại tinh bột
khác nhau...................................................................................................................... 56
3.13.2. Sử dụng CPE γ-amylase thương mại cố định để thủy phân các loại tinh bột
khác nhau...................................................................................................................... 60


vi

3.14. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định ................................ 63
3.14.1. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định ......... 63
3.14.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng CPE γ-amylase cố định thương mại ........... 66
3.15. Kết quả ứng dụng sản phẩm sau thủy phân tinh bột để lên men thu sinh
khối giàu protein ........................................................................................................ 68
3.15.1. Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng tạo
dung dịch đường ........................................................................................................... 68
3.15.2. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dung dịch thủy phân
tinh bột.......................................................................................................................... 70
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 71
4.1. Kết luận ................................................................................................................ 71
4.1.1. Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho nấm mốc Asp.niger sinh tổng hợp
enzyme γ- amylase có hoạt tính cao là: ........................................................................ 71
4.1.2. Thu nhận CPE γ-amylase từ môi trường nuôi cấy Aspergillus niger ............ 71

4.1.3. Hoạt độ CPE γ-amylase – TM ...................................................................... 71
4.1.4. Xác định nồng độ glucose tạo thành khi thủy phân một số loại tinh bột bởi
CPE γ- amylase TM và từ Asp. niger hòa tan ............................................................. 72
4.1.4.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 72
4.1.4.2. CPE thương mại ..................................................................................... 72
4.1.5. Hiệu suất cố định CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM trên một số chất
mang ............................................................................................................................. 72
4.1.5.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 72
4.1.5.2. CPE thương mại ..................................................................................... 72
4.1.6. Xác định nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột bởi
CPE γ- amylase từ Asp. niger và TM cố định trên một số chất mang ........................ 73
4.1.6.1. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPE cđ từ Asp. niger ............................. 73
4.1.6.2. Thủy phân các loại tinh bột bởi CPE cđ TM............................................ 73
4.1.7. Xác định khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme γ- amylase từ Asp.
niger và TM để thủy phân bột năng ............................................................................ 73


vii

4.1.7.1. CPE từ Asp. niger ................................................................................... 73
4.1.7.2. CPE thương mại ..................................................................................... 74
4.1.8. Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger thủy phân bột năng tạo glucose ......... 74
4.1.8.1. CPE cđ từ Asp. niger ................................................................................ 74
4.1.8.2. CPE cđ TM ............................................................................................... 74
4.1.9. Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein từ dịch thủy phân bột năng
bởi CPE γ- amylase thương mại và từ Asp. niger ........................................................ 74
4.2. Đề nghị .................................................................................................................. 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 72
PHẦN 5: PHỤ LỤC ................................................................................................... 77

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CT

: Canh trường

CPE

: Chế phẩm enzyme

CPE ht

: Chế phẩm enzyme hòa tan

CPE cđ

: Chế phẩm enzyme cố định

CPE – TM

: Chế phẩm enzyme thương mại

DNS

: 3,5 – dinitrosalicylic axit

dd

: dung dịch

E

: Enzyme

E cđ

: Enzyme cố định

HL

: Hàm lượng

HS

: Hiệu suất

pH opt

: pH tối ưu

Pr

: Protein

OD

: Giá trị mật độ quang

OD 0

: Giá trị mật độ quang mẫu đối chứng

OD T

: Giá trị mật độ quang mẫu thật

OD TB

: Giá trị mật độ quang trung bình

t opt

: Nhiệt độ tối ưu

TN

: Thí nghiệm


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Tương quan giữa mật độ quang OD và mật độ bào tử ................................. 40
Bảng 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột bắp ......................................................................................................... 41
Bảng 3.3: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột năng ....................................................................................................... 42
Bảng 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy .. 44
Bảng 3.5: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger .................... 45

Bảng 3.6: Hiệu suất thu nhận CPE γ-amylase từ canh trường Asp. niger ................... 45
Bảng 3.7: Hàm lượng protein trong CPE γ-amylase thu được từ canh trường Asp.
niger ............................................................................................................. 46
Bảng 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 47
Bảng 3.9: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng CPE
γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan .......................................................... 48
Bảng 3.10: Hoạt độ chung của CPE γ-amylase - TM .................................................. 49
Bảng 3.11: Hàm lượng Protein trong CPE γ-amylase - TM ......................................... 50
Bảng 3.12: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase - TM dạng hòa tan .............................................................. 51
Bảng 3.13: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng
CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 52
Bảng 3.14: Lượng protein CPE γ-amylase cố định và hiệu suất gắn γ-amylase lên
diatomite và chitosan ................................................................................... 54
Bảng 3.15: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase cố định và hiệu suất hoạt độ γ-amylase cố
định .............................................................................................................. 54
Bảng 3.16: Lượng protein CPE γ-amylase – TM cố định và hiệu suất gắn cố định
protein γ-amylase lên diatomite và chitosan................................................ 55


Bảng 3.17: Tổng đơn vị hoạt độ γ-amylase - TM cố định và hiệu suất cố định γamylase ........................................................................................................ 56
Bảng 3.18: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang
chitosan ........................................................................................................ 57
Bảng 3.19: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
khác nhau bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng cố định trên chất mang
diatomite ...................................................................................................... 58
Bảng 3.20: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang chitosan ..... 60

Bảng 3.21: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
khác nhau bằng CPE γ-amylase - TM cố định trên chất mang diatomite ... 62
Bảng 3.22: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên chitosan....................... 63
Bảng 3.23: Hiệu suất sử dụng CPE từ Asp. niger cố định trên diatomite ..................... 64
Bảng 3.24: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại ........................................ 66
Bảng 3.25: Hiệu suất sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại ....................................... 67
Bảng 3.26: Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp. niger và thương mại thủy phân bột năng
tạo glucose .................................................................................................. 69
Bảng 3.27: Kết quả thu nhận sinh khối nấm men giàu protein .................................... 70


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc không gian γ-amylase .................................................................... 12
Hình 1.2: Quá trình thủy phân tinh bột của các enzyme amylase ................................ 12
Hình 1.3: Cấu tạo tinh bột ............................................................................................. 21
Hình 1.4: Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi E vi sinh vật .................................... 24
Hình 1.5: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men ............................. 25
Hình 3.1: Mặt trước của khuẩn lạc Asp. niger .............................................................. 39
Hình 3.2: Mặt sau của khuẩn lạc Asp. niger ................................................................. 39
Hình 3.3: Khuẩn ty của Asp. niger ................................................................................ 39
Hình 3.4: Hệ bào tử đính của Asp. niger ....................................................................... 39


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thị 3.1: Tương quan giữa mật độ OD và mật độ bào tử .......................................... 40
Đồ thị 3.2: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 47
Đồ thị 3.3: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng

CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan.................................................. 48
Đồ thị 3.4: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột
tan và bột năng bằng CPE γ-amylase từ Asp. niger dạng hòa tan ............... 49
Đồ thị 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột tan bằng
CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 51
Đồ thị 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân bột năng bằng
CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ............................................................. 52
Đồ thị 3.7: So sánh nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân tinh bột
tan và bột năng bằng CPE γ-amylase – TM dạng hòa tan ........................... 53
Đồ thị 3.8: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan và
trên diatomite ............................................................................................... 65
Đồ thị 3.9: Hiệu suất sử dụng CPE γ-amylase – TM cố định trên chitosan và trên
diatomite ...................................................................................................... 68


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột bắp ....................................................................................................... 41
Biểu đồ 3.2: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger với cơ chất cảm ứng là
bột năng .................................................................................................... 42
Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của hai loại môi trường nuôi cấy nấm mốc Asp. niger đến
hoạt độ γ-amylase ...................................................................................... 43
Biểu đồ 3.4: Hoạt độ γ-amylase từ các canh trường Asp. niger theo thời gian nuôi cấy44
Biểu đồ 3.5: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên chitosan ............................ 57
Biểu đồ 3.6: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
bởi CPE γ-amylase từ Asp. niger cố định trên diatomite .......................... 59
Biểu đồ 3.7: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột
bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên chitosan ............................ 61
Biểu đồ 3.8: Nồng độ glucose tạo thành của dung dịch sau thủy phân các loại tinh bột

bằng CPE γ-amylase thương mại cố định trên diatomite .......................... 62
Biểu đồ 3.9: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan từ canh trường Asp. niger ........... 64
Biểu đồ 3.10: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite từ canh trường Asp. niger ....... 65
Biểu đồ 3.11: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _chitosan thương mại ................................ 66
Biểu đồ 3.12: Khả năng tái sử dụng CPE cđ _diatomite thương mại .............................. 67
Biểu đồ 3.13: Kết quả sử dụng CPE cđ từ Asp .niger và TM thủy phân bột năng tạo
glucose ....................................................................................................... 67


Môû ñaàu


1

PHẦN MỞ ĐẦU
Enzyme (E) là một loại chất xúc tác sinh học, hiện nay E được sử dụng rộng
rãi trong nhiều quy trình công nghệ sản xuất công nghiệp như: công nghệ thực
phẩm, y học, dược phẩm, sản xuất thức ăn gia súc và bảo vệ thực vật, xử lý môi
trường,…Việc ứng dụng E đã trở thành một trong những chiến lược quan trọng nhất
nhằm đưa ra những quy trình phản ứng hóa học thân thiện với môi trường, đồng thời
giúp tiết kiệm nguyên liệu và năng lượng.
E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và
vi sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều đặc tính ưu việt hơn
enzyme từ động vật hay thực vật.
Mặc dù E được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì có nhiều đặc tính
ưu việt, nhưng trên thực tế sản xuất, việc sử dụng E vẫn còn những giới hạn nhất
định. Bên cạnh chi phí cao cho việc tách chiết và tinh sạch E, khó khăn lớn nhất là
tính kém bền vững và độ nhạy với nhiệt độ, pH,… của chúng, nên hiệu quả sử dụng
không cao. Vì vậy mà E có thời gian tồn tại ngắn, chi phí cao cho việc tách E ra
khỏi sản phẩm phản ứng và việc phục hồi các trung tâm hoạt động để tái sử dụng

gặp nhiều khó khăn.
Một trong những kỹ thuật thông dụng và hiệu quả nhất để khắc phục những
mặt hạn chế trên là sự cố định E. Kỹ thuật này giúp cố định cấu trúc không gian mà
không làm giảm hoạt lực của E. Từ đó tạo nhiều chế phẩm E không hòa tan có khả
năng tái sử dụng nhiều lần, phục vụ cho từng mục đích sản xuất cụ thể, đặc biệt
thích hợp cho các quá trình tự động hóa trong sản xuất liên tục. Nhìn chung, kỹ
thuật cố định E chắc chắn đã và đang là một hướng phát triển đầy tiềm năng của
ngành công nghệ E.
Trong các E có nhiều ứng dụng thực tiễn của lĩnh vực công nghệ thực phẩm
là hệ enzyme amylase. Đề tài của chúng tôi nhằm nghiên cứu tạo ra chế phẩm γ –


2

amylase cố định thủy phân tinh bột tạo sản phẩm là α-glucose có giá trị cao. γ –
amylase có khả năng cắt các loại liên kết 1, 4 hay 1, 6 – O – glycoside, khả năng
thủy phân triệt để tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu là glucose và sau phản ứng có thể
dễ dàng tách E ra khỏi sản phẩm.
Nhìn chung, qua nhiều nghiên cứu ứng dụng các E cđ trong sản xuất ở trong
và ngoài nước đó đã mở ra một câu hỏi, liệu rằng chế phẩm γ – amylase cố định có
thể trở thành một trong những nguồn chế phẩm E đầy tiềm năng cho ngành công
nghiệp sản xuất α – glucose từ nguyên liệu tinh bột không?
Do đó, để góp phần đánh giá thêm tiềm năng ứng dụng này của enzyme cố
định, chúng tôi xin được tiến hành đề tài “Nghiên cứu sự thủy phân tinh bột bởi
γ-amylase vi sinh vật dạng hòa tan và dạng cố định” với các nhiệm vụ cụ thể như
sau:
- Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy nấm mốc Asp. niger để thu γ – amylase có
hoạt tính cao.

- Sử dụng một phương pháp mới trong kỹ thuật sử dụng E đó là phương

pháp cố định E.
- Cố định γ – amylase trên chất mang vô cơ diatomite và chất mang hữu cơ

chitosan.
- Xác định hoạt độ các loại enzyme:

 γ - amylase hòa tan từ Asp. niger.
 γ – amylase hòa tan thương mại.
 γ – amylase cố định từ Asp. niger và thương mại.
- Nghiên cứu sự thủy phân một số loại tinh bột của các loại enzyme hòa tan và
cố định.


3

- So sánh hiệu quả sự thủy phân tinh bột bởi ba loại enzyme trên.
- Chứng minh hiệu quả sử dụng Ecđ qua sự tái sử dụng trong thủy phân tinh bột.
- Bước đầu tạo sinh khối nấm men trên dung dịch đường sau thủy phân.


Phan 1

Toồng quan
taứi lieọu


4

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm giống mốc Aspergillus và Asp. niger

Từ lâu nấm mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất tương,
chao, nước chấm,…hay được dùng để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột
trong sản xuất rượu, sản xuất sinh khối,… Trong đó, một số nấm mốc đường hóa
thường dùng như: Asp. oryzae, Asp. niger, Asp. awamori, Asp. usamii,…
Giống mốc Aspergillus có hệ sợi nấm không màu hoặc vàng nhạt. Sợi nấm
phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính bào tử
không phân nhánh dài và thẳng, đầu có cuống nhỏ. Tất cả cuống nhỏ có hình chai, khi
trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Những chuỗi đính bào tử xếp đối
xứng tỏa tròn trên chóp nang giống đóa hoa cúc.
1.1.1. Vị trí phân loại Asp. niger [7]
Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Eurotiomycetes –
Bộ: Eurotiales – Họ: Eurotia – Chi: Aspergillus – Loài: Aspergillus niger
1.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Asp. niger [12]
1.1.2.1. Đặc tính sinh học của Asp. niger [12]
Asp. niger thường gọi là mốc đen. Sợi nấm đa bào có vách ngăn, phân nhánh,
không màu, một số trường hợp trở nên nâu hay sẫm màu. Cuống sinh thể bình phình
ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 20-30 µm, màu nâu đen. Thể bình gồm 2
lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai. Thể bình mang bào
tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng.
Trên môi trường nuôi cấy thích hợp, Asp. niger cho khuẩn lạc với vô số bào tử
đính màu trắng, khi trưởng thành chuyển sang màu đen. Bào tử có hình cầu, kích
thước khoảng 4,0-5,0μm, xù xì không đều với những gờ rõ. Mặt trái khuẩn lạc màu
vàng nhạt, khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch.


5

Nấm mốc Aspergillus nói chung và Asp. niger nói riêng có mặt khắp nơi trong
tự nhiên do có khả năng phân giải nhiều nguồn cơ chất khác nhau nhờ hệ enzyme
phong phú như amylase, invertase, pectinase, maltase, gluco-oxydase,…

1.1.2.1. Đặc tính dinh dưỡng của Asp. niger [12]
* Nguồn carbon
A.niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide
như glucose, fructose, maltose, sucrose, hay polysaccharide như tinh bột,...
* Nguồn nitrogen
Khi sử dụng nguồn nitrogen từ NaNO3 và NH4NO3 để bổ sung vào môi trường
nuôi cấy bán rắn thì hoạt tính γ-amylase của nấm mốc cũng tăng đáng kể.
* Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của
A.niger. Chúng sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-80C và tối đa là 45-470C, tối
ưu ở 28-350C.
* Độ pH
Khoảng pH mà A.niger sinh trưởng tốt là ở môi trường hơi acid pH= 3,5- 5,5.
Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid,
trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp amylase cao nhất ở pH môi trường từ
4,8 – 5,0.
* Chất cảm ứng
Trong các môi trường nuôi cấy Asp. niger sinh tổng hợp amylase, người ta đều
bổ sung thêm cơ chất chứa nguồn cacbon như tinh bột, dextrin, maltose nhằm kích
thích khả năng sinh amylase của nấm mốc.
* Ngoài ra, cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy nấm mốc một số chất
vô cơ khác như MnSO4 0.05%, KH2PO4 1%, KCl 0.05% và độ ẩm môi trường khoảng
50-55% là thích hợp nhất cho mốc phát triển tốt.


6

1.1.2. Ứng dụng của nấm mốc Asp. niger [18]
Từ lâu, con người đã biết sử dụng A.niger để sản xuất acid hữu cơ. Đặc biệt
Asp. niger có khả năng tổng hợp acid citric rất mạnh, lượng acid citric sử dụng trên

thị trường hiện nay được sản xuất bằng phương pháp lên men tới 90%.
Ngoài ra, Aspergillus niger là chủng nấm mốc được sử dụng khá phổ biến trong
công nghệ sản xuất E. Tùy điều kiện nuôi cấy mà chủng nấm mốc này có thể sinh ra
các loại E như: amylase, invertase, maltase, protease, pectinase và cellulase,…
Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học để sản xuất
phụ gia thực phẩm, các enzyme dùng trong công nghiệp và dược phẩm, cũng như có
tiềm năng ứng dụng phân hủy sinh học.
1.2. Đặc điểm nấm men Sac. cerevisiae [14]
1.2.1. Đặc điểm nấm men
Nấm men luôn được xem là một trong những nhóm vi sinh vật gần gũi với con
người. Tế bào nấm men rất giàu protein – được coi là nguồn protein đơn bào rất quý
giá, là nguồn dinh dưỡng gián tiếp qua chăn nuôi tới con người. Ngoài ra, các sản
phẩm lên men từ nấm men như rượu, bia và các dạng đồ uống có cồn khác cũng rất
được ưa chuộng.
1.2.1.1. Vị trí phân loại Sac. cerevisiae [14]
Giới: Eumycophyta (Nấm) – Ngành: Ascomycota – Lớp: Ascomycetes – Bộ:
Endomycetes – Họ: Saccharomycetaceae – Chi: Saccharomyces – Loài:
Saccharomyces cerevisiae.
1.2.1.2. Đặc tính sinh học và dinh dưỡng Sac. cerevisiae [14] [20]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, hô hấp tùy tiện,
sinh sản bằng cách nảy chồi, dị dưỡng bằng các hydratcarbon, trước hết là đường.
Kích thước tế bào nấm men khoảng 8 - 15 μm, có hình thái đa dạng và cấu tạo
gồm: vỏ (hoặc thành), màng, tế bào chất, nhân, một hoặc 2 không bào và những giọt


7

mỡ, hạt glycogen. Ở một số nấm men, vỏ tế bào có khả năng kết dính giúp gắn kết các
tế bào với nhau, có ý nghĩa lớn trong sản xuất cồn vì thuận tiện cho quá trình lọc dịch
lên men và thu hồi chủng giống để tái sử dụng.

Trong giống Saccharomyses, quan trọng nhất là loài Sac. cerevisiae được dùng
nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Thành phần chất khô của tế bào nấm men có
nhiều chất dinh dưỡng có giá trị như: protein và các chất có nitơ khác chiếm 50% ,
chất béo 1,6%, hydratcarbon 33,2%, mô tế bào 7,6%, tro 7,6%. Nấm men được chú ý
nhiều, vì không những trong tế bào của chúng có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị mà
chúng còn có khả năng tăng sinh khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện
sản xuất công nghiệp [14]
Trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối, ngoài glucid từ 5-7% và chất khoáng
thường có đủ sẵn trong môi trường cũng cần bổ sung thêm nguồn Nitơ từ ure hay
amonsunfat với lượng từ 0.15-0.2g/lít canh trường. Nếu thiếu nitơ nấm men sẽ phát
triển chậm, thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm. Ngoài ra, có thể bổ
sung thêm nguồn phospho là diamonphosphate, nguồn K từ KCl, nguồn Mg –
MgSO 4 , nguồn chất sinh trưởng như cao ngô, cao nấm men,…Các thành phần môi
trường được hòa tan, lọc bỏ cặn, điều chỉnh pH tới 4,8 – 5,2 bằng HCl hay H 2 SO 4
[14]
1.2.2. Các ứng dụng của nấm men Sac. cerevisiae [14]
Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong lĩnh vực nghiên cứu nấm men
đã tạo ra nhiều chủng, giống mới mang đặc tính ưu việt như: tuyển chọn các chủng
nấm men bia có khả năng kết lắng cao, tạo chủng nấm men mới có hoạt tính phân giải
β-glucan cao, hay tạo một chủng nấm men có hoạt tính cellulase cao nhờ việc chuyển
một gene cellulase từ Trichoderma recset vào Saccaromyces,…Từ đó, những chủng
nấm men mới với những đặc tính ưu việt này được ứng dụng hiệu quả vào ngành
công nghệ thực phẩm.
1.3. Sơ lược về enzyme và γ-amylase
1.3.1. Giới thiệu về enzyme