nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng bacillus phân lập từ đất vườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thùy Dương

NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG
CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG
BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thùy Dương

NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG
CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS
PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. TRẦN THANH THỦY – Người
đã hết lòng dạy dỗ, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi
thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy, Cô khoa Sinh học đặc biệt là cô
Tuyến và Ths. Minh Định phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường
Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian theo học và tiến hành đề tài.

Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục – Đào tạo tỉnh Tiền Giang, Trường THPT Vĩnh
Bình – Tiền Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian đi học.
Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên
và luôn bên cạnh tôi.


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả
của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện và chưa từng
được ai công bố trong bất kì công trình nào.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thùy Dương

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Lời cam đoan ................................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt .............................................................................................. vi
Danh mục các bảng ....................................................................................................... vii
Danh mục các hình ....................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1. Vi khuẩn Bacillus .................................................................................................. 4
1.1.1. Đặc điểm chung ............................................................................................. 4
1.1.2.

Hệ enzyme của Bacillus.............................................................................. 6

1.1.3.

Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus .................................................. 7

1.2. Cellulose và enzyme cellulase ............................................................................... 9
1.2.1.

Cellulose ..................................................................................................... 9

1.2.2.

Sơ lược về enzyme cellulase ..................................................................... 10

1.2.3.

Phương pháp nuôi cấy VSV để thu nhận enzyme cellulase ..................... 20

1.3. Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme ..................................................................... 22
1.3.1.

Hiện tượng cảm ứng ................................................................................. 22

1.3.2.

Mô hình cảm ứng operon Lac ................................................................... 23

1.3.3.

Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng................................................................ 27

1.3.4.

Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme .................................................... 28

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30
2.1. Nguyên vật liệu.................................................................................................... 31
2.2. Hóa chất, thiết bị.................................................................................................. 31
2.2.1.

Hóa chất .................................................................................................... 31

2.2.2.

Thiết bị ...................................................................................................... 31

2.3. Các môi trường sử dụng ...................................................................................... 31


iv

2.4. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 33
2.4.1.

Phân lập vi khuẩn Bacillus ....................................................................... 33

2.4.2.

Phương pháp bảo quản giống ................................................................... 34

2.4.3.

Quan sát hình thái khuẩn lạc ..................................................................... 34

2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram .......................................................................... 34
2.4.5. Phương pháp nhuộm bào tử ........................................................................ 35
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính catalase ..................................................... 36
2.4.7.

Phương pháp định danh đến loài bằng sinh học phân tử .......................... 36

2.4.8.

Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK .. 37

2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng
thủy phân ................................................................................................................ 38
2.4.10. Xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS39
2.4.11. Phương pháp định lượng cellulose ........................................................... 41
2.4.12. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng ................ 42
2.4.13. Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy để thu nhận
cellulase .................................................................................................................. 42
2.4.14. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô ........................... 43
2.4.15. Phương pháp khảo sát một vài đặc điểm cellulase của chủng Bacillus
được chọn ............................................................................................................... 43
2.4.16. Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................... 44
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 45
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase ............................. 46
3.1.1.

Phân lập..................................................................................................... 46

3.1.2.

Tuyển chọn sơ bộ ...................................................................................... 47

3.1.3.

Tuyển chọn lần hai .................................................................................... 48

3.1.4.

Tuyển chọn lần ba ..................................................................................... 50

3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ................... 52
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của hai chủng Bacillus ................................................................................ 54
3.3.1.

Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng ................................................. 54


v

3.3.2.

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ................................................ 56

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp cellulase
của hai chủng Bacillus ............................................................................................... 58
3.4.1.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................................................ 58

3.4.2.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................... 59

3.4.3.

Ảnh hưởng của pH ban đầu ...................................................................... 63

3.4.4.

Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 65

3.5. Định danh chủng ĐM19.1 đến loài bằng sinh học phân tử ................................. 68
3.6. Thu nhận cellulase thô từ canh trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens ĐM19.1 69
3.7. Khảo sát một vài đặc điểm CPE cellulase của B. amyloliquefaciens ĐM19.1 ... 70
3.7.1.

Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzyme ........................ 70

3.7.2.

Khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzyme .............. 72

3.7.3.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme ...................... 73

3.7.4.

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên lượng glucose tạo thành75

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 77
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 77
4.2. Kiến nghị............................................................................................................. 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 79
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 89

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CPE

Chế phẩm enzyme

CPE B

Chế phẩm enzyme của chủng B. amyloliquefaciens

CMC

Carboxymethyl cellulose

DNS

Acid 3,5 – dinitrosalicylic

KL

Khuẩn lạc

KHV

Kính hiển vi

MT

Môi trường

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

NXB

Nhà xuất bản

OD

Mật độ quang

TB

Tế bào

STT

Số thứ tự

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus ...................................................... 6
Bảng 1.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ B. subtilis .............................................. 14
Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu với thuốc thử
DNS ........................................................................................................................... 40
Bảng 3.1. Vòng phân giải CMC của 69 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase ....... 48
Bảng 3.2. Tóm tắt khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .......... 50
Bảng 3.3. Hoạt độ cellulase của 8 chủng VK được chọn ......................................... 51
Bảng 3.4. Kết quả 3 lần tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase cao ........ 52
Bảng 3.5. Đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ........................... 52
Bảng 3.6. Hàm lượng cellulose trong các loại cơ chất ............................................. 54
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus ........................................................................................................... 55
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus ........................................................................................................... 56
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ..... 57
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng
Bacillus ...................................................................................................................... 62
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus .... 66
Bảng 3.14. Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp cellulase của 2
chủng Bacillus ........................................................................................................... 67

Bảng 3.15. Kết quả thu nhận enzyme thô từ Bacillus amyloliquefaciens ĐM19.1 .. 69
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B .......................................... 70
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B ..................... 71
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B .................................. 73
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B ................................. 74


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ......................................................... 11
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ...................................................... 11
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của β –glucosidase ....................................................... 12
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson ................................................. 12
Hình 1.5. Cấu trúc của operon lac ............................................................................. 23
Hình 1.6. Promoter của operon lac............................................................................ 24
Hình 1.7. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy không có chất cảm ứng .... 25
Hình 1.8. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy có chất cảm ứng ............... 26
Hình 1.9. Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược ................................ 29
Hình 3.1. Hình thái KL của một số chủng VK phân lập được .................................. 46
Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương
pháp cấy chấm điểm .................................................................................................. 47
Hình 3.3. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương
pháp đo đường kính vòng thủy phân ......................................................................... 49
Hình 3.4. Vòng phân giải CMC của 8 chủng VK có hoạt tính cellulase cao nhất ... 50
Hình 3.5. Hoạt độ cellulase của 8 chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải
lớn nhất ...................................................................................................................... 51
Hình 3.5. Hình thái KL của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 .................................... 53
Hình 3.6. Hình thái tế bào của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ................................ 53
Hình 3.7. Bào tử của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ............................................... 53

Hình 3.9. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus ........................................................................................................... 55
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus ........................................................................................................... 57
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ... 58
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60
Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng
Bacillus ...................................................................................................................... 62


ix

Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus ..... 66
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B .......................................... 70
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B ...................... 72
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B .................................. 73
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B ................................. 75


1

MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên, ở
Jerico người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, việc nấu
rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… đã được thực hiện. Ở các mức độ khác
nhau, đây là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh
nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế

phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong
các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm,
khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá
trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. So với nguồn
enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ VSV có nhiều ưu điểm như hoạt
tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ VSV rất ngắn, nguyên liệu sản xuất
rẻ tiền, có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp. Qua nhiều năm, việc sử dụng VSV
như một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản
phẩm được tạo ra nhiều hơn với giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng
kể và làm giảm tác động xấu tới môi trường.
Trong các VSV phải kể đến các loài VK thuộc chi Bacillus. Các ứng dụng
của Bacillus có liên quan đến enzyme ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao.
Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ
công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược
học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc
kim loại từ các phế liệu. Hệ enzyme của Bacillus rất phong phú và đa dạng gồm
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, pectinase. Trong đó,


2

cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme đã được sản xuất với
qui mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong trong nhiều ngành công nghiệp
như chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt, tẩy, sản xuất ethanol; trong nông
nghiệp, cellulase được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ.
Nhằm đa dạng hóa nguồn cung cấp enzyme cellulase từ VSV và nâng cao
hiệu quả sinh tổng hợp cellulase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng

hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn”.
Mục tiêu của đề tài
Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulase của các chủng Bacillus phân lập
từ đất vườn .
Nhiệm vụ của đề tài
1. Phân lập được một số chủng Bacillus sinh enzyme cellulase từ đất vườn. Từ
đó, tuyển chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao.
2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng đã
chọn.
3. Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase cao.
Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase cao.
4. Xác định các điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase.
5. Phân loại đến loài 1 chủng Bacillus sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao
nhất.
6. Xác định hiệu suất thu nhận của chế phẩm enzyme thô từ chủng cho hoạt
tính cellulase cao nhất.
7. Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzyme thô.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
− Thời gian: từ tháng 11/2011 đến tháng 09/2012
− Địa điểm: thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh-Sinh hóa, khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.


3

Chương 1. TỔNG QUAN
TÀI LIỆU


4

1.1.

Vi khuẩn Bacillus

1.1.1. Đặc điểm chung
Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Vibrio
subtilis”. Bacillus là VK Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 –
2,5)x(1,2 – 10)μm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại,
phóng xạ và nhiều độc tố, có khả năng tồn tại trong nhiều năm. Bào tử của VK
không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ hình thức thích nghi giúp VK vượt qua
những điều kiện sống bất lợi.
Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao
đổi năng lượng thông qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếu khí. Nhiều loài
Bacillus tiết enzyme ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hóa các hợp chất cao phân
tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào TB vì quá lớn) thành các
chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cacbon và năng lượng.
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như
Bacillus alcalophilus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus
acidocaldrius [5]. Có nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt độ cao (450C – 750C) hay ưa
lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 300C – 370C.
Phần lớn Bacillus là những VK dị dưỡng hóa năng, thu năng lượng do oxy
hóa các hợp chất hữu cơ. Một số VK ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc (B.
schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO 2 và CO là nguồn
cacbon duy nhất. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô
cơ, trong khi một số loài khác (B. sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ
(vitamin, acid amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B.
popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển
trong môi trường nuôi cấy thông thường như: NA, NB [46].

Các loài thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong nước,
không khí đặc biệt là trong đất do có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu
khí tùy tiện. Dưới đây là một số loài Bacillus thường gặp.


5

B. subtilis – KL khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, hơi nhăn, tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào MT thạch. Trực khuẩn
hình que, ngắn, nhỏ, TB đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Bào tử hình bầu dục, phân bố
lệch tâm.
B. amyloliquefaciens có hình thái KL và TB tương tự B. subtilis nhưng khác
nhau về đặc tính sinh hóa. Thành phần G + C của B. subtilis khoảng 41,5% - 43,5%,
còn trong chủng B. amyloliquefaciens là 43,5% - 44,9%. B. amyloliquefaciens có
khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm.
B. licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình oval, phát tán chủ yếu trong
đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. KL nhỏ, màu trắng đục,
bề mặt nhăn nheo.
B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B.
subtilis. KL nhỏ, TB gần giống tế bào B. subtilis.
B. megaterium – KL hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn
hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem. Tế bào B. megaterium dài, đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm.
B. simplex – KL có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi
trường. Tế bào B. simplex nhỏ, thường đứng riêng rẽ, không gắn thành chuỗi, bào tử
hình bầu dục nằm lệch tâm.
B. brevis – KL màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh,
mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc.Trực khuẩn đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành
chuỗi. Bào tử hình bầu dục, nằm cuối tế bào làm cho TB có một đầu hơi phồng.
B. polymyxa – KL vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép

đôi khi có thùy. Tế bào B. polymyxa đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn.
bào tử hình bầu dục, trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa TB.
B. aslersporus – KL nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày,
đồng chất. TB đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài,
nằm giữa TB. Khi hình thành bào tử TB phồng lên một chút giống như dạng
Clostridium.


6

1.1.2. Hệ enzyme của Bacillus
Bacillus có hệ enzyme ngoại bào rất đa dạng. Một số enzyme ngoại bào phổ
biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus [64], [68]
Tên chủng Bacillus

Enzyme
Amylase

B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. polymyxa, B.
stearothermophilus, B. caldolyticus, B. subtilis, B.
Licheniformis, B. megaterium, Bacillus spp.

Cellulase

B. subtilis, B. brevis, B. fimus, B. polymyxa, B. pumilus,
B. amyloliquefaciens.

Xylanase

B. amyloliquefciens, B. fimus, B. polymyxa, B. subtilis
var. amylosacchariticus.

Alkalophilic

Alkalophilic Bacillus spp.

protease
Serine-metal

B. licheniformis, B. pumilus.

protease
Serine protease B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. subtilis var.
amylosacchariticus.

Metal protease B. amyloliquefciens, B. cereus, B. licheniformis, B.
megaterium, B. polymyxa, B. subtilis, B. subtilis var.
amylosacchariticus,

B.

thermoproteolyticus,

B.

thuringiensis.

 Amylase là nhóm enzyme thủy phân tinh bột bao gồm nhiều enzyme khác
nhau về tính đặc hiệu tác dụng lên tinh bột (vị trí khác nhau trên mạch tinh bột)

như α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Amylase là một trong những enzyme
được ứng dụng rộng rãi hơn cả, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm.


7

Amylase của Bacillus có thể chịu được nhiệt độ cao, có thể giữ được hoạt lực
ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt này là một ưu
điểm lớn được sử dụng để xử lí nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt độ
cao hoặc MT nhiệt đới như ở nước ta. Ở Nhật, hàng năm sản xuất tới 7 000 tấn
amylase từ VK [21].
 Protase là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide của protein, polypeptide
đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Nhiều protease còn có thể xúc tác phản
ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc amin [3], [2].
Protease Bacillus có đủ loại, tùy theo pH thích hợp người ta chia ra protease acid
tính, kiềm tính và trung tính. Protease cũng như amylase có ứng dụng khá rộng rãi
trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm.
 . Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua
việc thủy phân liên kết β-1,4-D-glucosid trong cellulose. Cellulase là một trong
những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu
cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo
vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và
protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là không ít. Ngày nay,
nhiều nước đã sản xuất chế phẩm cellulase từ VSV trong công nghiệp ở qui mô lớn
và áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
1.1.3. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus
Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có
khả năng sinh các loại enzyme như protease, amylase, cellulase, lipase, urease…
Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide
acid, inosinic acid, guanilic acid, kháng sinh. Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng

Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin
có hoạt tính kháng khuẩn [49].
Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh
hóa khác như tổng hợp protein tinh thể (B. sphaericus, B. thurigiensis) hay tổng hợp
một số chất kháng khuẩn bản chất polypeptide (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin,


8

polymidin). Nhiều kháng sinh polypeptide được mô tả chi tiết về tính chất hóa học
và chức năng. Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng, người ta chia
kháng sinh polypeptide thành 3 lớp:
-

Adeine: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào VK.

-

Baxitraxin: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng TB.

-

Gramixidin, polymidin, tyroxidin: có tác dụng sửa đổi và cấu tạo chức
năng của màng [76].

Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất, được tổng hợp từ VK B. licheniformis
và B. subtilis. Baxitraxin có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải TB, tạo
TB trần, ngăn cản sự đồng hóa các acid amin tổng hợp mucopeptide thành TB.
Baxitraxin có hiệu lực chống các VK Gram dương như: Actinomyces, Clostridium,
Staphylococcus, Haemophilus, Diplococcus, Corynebacterium…

Baxitraxin được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quả
thịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong
bảy loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng
và phòng chống bệnh [19].
Hiện nay, một số chủng Bacillus như B. laterosporus, B. fimus và B. cereus
đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate). Bacillus
pasteurii được đưa vào đất ướt để tạo ra calcite – một chất xi măng liên kết đất,
chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các toà nhà và giúp chúng chịu được
động đất [77] .
Trong công nghệ thực phẩm, người ta ứng dụng VK Bacillus để sản xuất các
enzyme quan trọng. Chế phẩm amylase từ B. subtilis, B. diastaticus chịu nhiệt độ
cao được dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột trước khi đường hóa rất tốt, ở nhiệt
độ 80 – 900C/ 10 – 15 phút α-amylase của VK bị vô hoạt một phần rất nhỏ [22].
Chế phẩm protease từ B. subtilis có khả năng thủy phân tốt protein (gọi tên là
subtilizin), từ B. mensentericus thủy phân tốt protid đến acid amin và đông tụ được
sữa nên được ứng dụng để thay thế một phần renin sản xuất phomat, rút ngắn thời
gian trong trong quy trình sản xuất nước mắm và cải thiện hương vị của nước mắm.


9

Trong chế phẩm sinh học, B. thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ
sâu vi sinh, B. thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng
quăng. Do có khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và
khả năng đối kháng với các VSV gây bệnh (Streptococcus pyogenes, E. coli,
Samonella, Vibrio spp) nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic trong chăn
nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai
mũi họng ở người.
Trong công nghệ sinh học, Bacillus còn được dùng làm vật chủ biểu hiện gen
để sản xuất các loại enzyme, acid amin, vitamin và polysaccharide.

Các chủng B. brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng không tiết protease
vào MT nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector biểu hiện các protein tái tổ
hợp của người, động vật có vú và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu
mô, insulin, interleukin 1-β của bò, hormon tăng trưởng của cá bơn, antigen virus
viêm gan B,…[54], [68], [76].
1.2.

Cellulose và enzyme cellulase

1.2.1. Cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murahima,
2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm. Hàng
năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ quá trình
quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất
do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi cành lá rụng
xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác, giấy vụn, mùn cưa…Trong
số này có đến 30% là màng TB thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose.
Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ.
Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là disaccharid gọi là cellobiose
có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside.
Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các
microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, có những phần đặc biệt gọi là phần kết
tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình [30].


10

Cellulose không tan trong nước nhưng có thể trương lên do hấp thu nước.
Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm đặc ở nồng độ cao. Tuy
nhiên, cellulose sẽ bị phân hủy bởi enzyme cellulase ở nhiệt độ từ 40 – 500C [30].

Trong TB thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 –
40% trọng lượng khô). Đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide
như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất
không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết
chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất
nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ
trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết [30].
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ
chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên
liệu, thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy
[17]…
1.2.2. Sơ lược về enzyme cellulase
Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua
việc thủy phân liên kết β-1,4-D-glucosid trong cellulose.
1.2.2.1.

Phân loại và cơ chế hoạt động

Từ năm 1960, những quan sát đầu tiên về cellulase được tiến hành bởi
Seilliere. Sau đó, hàng loạt nghiên cứu của các tác giả đã được tổng kết một cách hệ
thống và toàn diện trong các công trình của Goksoyr và Eriksen, Bisaria và Ghose,
Enari, Tanaka và Matsuno…, đã cung cấp khá đầy đủ và chính xác về hệ enzyme
thủy phân cellulose. Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme
cellulase được chia làm ba loại:
 Exoglucanase (EC 3.2.1.91)
Enzyme này còn có các tên gọi khác như :1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase,
exo-1,4-glucanase,

cellulase

C1,

cellobiohydrolase,

CBH1,

avicellase, exo cellobiohydrolase, exo-β-glucancellobiohydrolase…

cellobiosidase,


11

Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucosid từ đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose, không thủy phân cellulose dạng kết tinh
và dạng hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng. Có lẽ vai trò
chính của enzyme này là giúp cho endoglucanase tác động lên cellulose kết
tinh.

Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của exoglucanase [78]
 Endoglucanase (EC 3.2.1.4)
Enzyme này còn có tên gọi khác như: β-1,4-endoglucan hydrolase,
endocellulase, CMCase, C x , β-1,4-glucanase, cellulosin AP, alkali cellulase,
cellulose A …
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucosid một cách ngẫn nhiên bên
trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose; nó tác
động mạnh đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến cellulose kết
tinh.

Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase [78]

 β –glucosidase (EC 3.2.1.21)
Enzyme này còn có tên gọi khác như:, p-nitrophenyl β-glucosidase,
salicilinase…; thủy phân cellobiose và các cello-oligosaccharide mạch ngắn tạo


12

thành glucose; β-glucosidase không tấn công cellulose hoặc các cellodextrin
khác

cellobiose

β-glucosidase

glucose

Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của β –glucosidase [78]
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại
enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Từ những
nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba
loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng
là glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của
cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson [34]

1.2.2.2.

Cấu trúc và tính chất

 Cấu trúc

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các
acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-. Ngoài ra trong cấu trúc


13

còn có những phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm
endoglucanase và exoglucanase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận
cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil
hóa, cuối đuôi là vùng liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain).
Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể.
Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng
xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của các enzyme này đối với
cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng
kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính
cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ enzyme cellulase
thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với
cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi
chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme
[14].
 Tính chất
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, lignin và cắt β-D-glucan của ngũ cốc.
Cellulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4 và 5.
Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 500C. hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong
10 – 15 phút [34].
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các

ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ.
Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 – 110KDa (Begunin, 1990;
Gilkes và ctv, 1991).
Enzym cellulase là hệ enzym khá phổ biến ở hầu hệt các loài VSV có trong
tự nhiên, bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và cả VK. Trichoderma là một trong những
giống nấm được nghiên cứu nhiều nhất và đặc biệt là T. reesei. Tính ưu việt là hệ


14

enzym của chúng hoạt động rất mạnh và có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose
tự nhiên. Trichoderma có khả năng tổng hợp một lượng lớn endoglucanase và
exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β –glucosidase. VK chủ yếu tổng hợp
endoglucanase

và

β-glucosidase,

gần

như

không

tạo

ra

exoglucanase.

Endoglucanase được tạo ra từ nhiều loại nấm mốc và VK, có trọng lượng phân tử
nằm trong khoảng từ 12.000 đến 50.000.
Bảng 1.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ B. subtilis [81]
Chiều dài chuỗi

499 AA.

Tình trạng trình tự

Hoàn chỉnh

Trọng lượng phân tử

55 287 Da

Sự tồn tại

Tồn tại ở dạng protein.

1.2.2.3.

Ứng dụng của cellulase

Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá
trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn
trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất
nhiều so với enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng
của cellulase là không ít.
 Trong công nghiệp giấy [89]

Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá
trình sản xuất giấy:
Trong giai đoạn nghiền bột giấy cơ học, bổ sung enzyme cellobiohydrolase
làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, từ đó làm tang khả năng nghiền và tiết
kiệm 20% năng lượng.
Trong giai đoạn nghiền bột giấy hóa học, ngoài enzyme cellulase, người ta
còn bổ sung thêm hemicellulose và pectinase nhằm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ,
giúp tăng cường khả năng khuếch tán của hóa chất vào bên trong gỗ nhằm làm tăng
hiệu quả khử lignin.