khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng bacillus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
__________________________

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
_________________________

Đỗ Thị Thu Nga

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THANH THỦY

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012


i

LỜI CẢM ƠN
 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã
tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến
hành đề tài.
 Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học
Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.
 Tôi xin cảm ơn em Nguyễn Thị Quỳnh Thương, em Lê Thị Thùy, bạn
Mỹ Nhung, Bích Phương, Tố Nga, Thoại Anh, Thùy Trang đã giúp đỡ và động
viên tôi.
 Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
luôn bên cạnh, ủng hộ tôi.


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực.
Tác giả luận văn

Đỗ Thị Thu Nga


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC

............................................................................................................. iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .............................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ ix
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................. ix
MỞ ĐẦU

...............................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Sơ lược về enzyme ...........................................................................................3
1.1.1 Khái niệm về enzyme ................................................................................3
1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme ..........................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme ....................................................................4
1.2. Protein và enzyme protease .............................................................................5
1.2.1. Protein.......................................................................................................5
1.2.1.1. Khái niệm ..........................................................................................5
1.2.1.2. Cấu trúc của protein .........................................................................5
1.2.1.3. Sự biến tính của protein ....................................................................6
1.2.2. Protease.....................................................................................................7
1.2.2.1. Khái niệm ..........................................................................................7
1.2.2.2. Phân loại ...........................................................................................7
1.2.2.3. Cơ chế tác dụng của protease .........................................................10

1.2.2.4. Nguồn thu protease .........................................................................10
1.2.2.5. Ứng dụng của protease ...................................................................13
1.3. Vi khuẩn Bacillus...........................................................................................16
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus .............................................................16
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của
Bacillus .............................................................................................................18


iv

1.3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng ......................18
1.3.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố MT lên khả năng sinh tổng hợp protease ...21
1.3.2.3. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy ...........................................22
1.3.3. Thu nhận và tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy .........................24
1.3.3.1. Thu dịch enzyme ..............................................................................24
1.3.3.2. Thu chế phẩm kỹ thuật ....................................................................25
1.3.3.3. Thu chế phẩm enzyme tinh khiết .....................................................25
1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme protease của Bacillus ở trong và
ngoài nước.............................................................................................................26
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................29
2.1. Vật liệu ...........................................................................................................29
2.1.1. Đối tượng ................................................................................................29
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................29
2.1.3. Hóa chất ..................................................................................................29
2.2. Môi trường nghiên cứu ..................................................................................29
2.3. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................30
2.3.1. Phương pháp phân lập ............................................................................30
2.3.2. Phương pháp cấy truyền giữ giống ........................................................31
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn ....................31
2.3.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc ....................................31

2.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram.............................................................32
2.3.3.3. Phương pháp nhuộm bào tử ............................................................32
2.3.3.4. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase. .............................33
2.3.4. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ...................33
2.3.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp mật độ quang.. ...................34
2.3.6. Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) ...........................................................35
2.3.7. Thu dịch enzyme thô ..............................................................................35
2.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính
thủy phân. . ......................................................................................................36


v

2.3.9. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. ...............37
2.3.10. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry .......................39
2.3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của các chủng VK .......................................................40
2.3.11.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy .........................................................40
2.3.11.2. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng ..................................................41
2.3.11.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ....................................41
2.3.11.4. Ảnh hưởng của pH môi trường. ....................................................41
2.3.11.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy. ................................................41
2.3.11.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc .............................................................41
2.3.11.7. Nghiên cứu động học của quá trình lên men ................................42
2.3.12. Tách và thu nhận chế phẩm protease [20], [28] ...................................42
2.3.13. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE
protease .............................................................................................................43
2.3.13.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ CPE protease ..............................43
2.3.13.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ CPE protease......................43
2.3.14. Phương pháp xác định đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ........43

2.3.15. Phương pháp xác định đạm formol bằng phương pháp Sorensen........44
2.3.16. Phương pháp khảo sát sự thủy phân của các cơ chất protein khác nhau
bởi CPE protease. .............................................................................................46
2.3.17. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ....................46
2.3.18. Phương pháp xử lí số liệu .....................................................................47
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................48
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao. ........48
3.2. Xác định hoạt độ protease của một số chủng VK đã chọn. ...........................50
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng CT3 và CT7 ..........................51
3.3.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................51
3.3.2. Xác định khả năng sinh enzyme catalase ...............................................53
3.3.3. Sơ bộ định danh ......................................................................................53


vi

3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp
protease của hai chủng Bacillus ............................................................................53
3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy......................................................54
3.4.2. Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng .....................................................55
3.4.2.1. Xác định hàm lượng nitơ tổng số của các chất cảm ứng ................55
3.4.2.2. Ảnh hưởng của loại cơ chất cảm ứng .............................................55
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng. .............................................57
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu ....................................................................58
3.4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ .........................................................................60
3.4.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc .......................................................................62
3.4.7. Động học quá trình lên men ...................................................................63
3.5. Định danh chủng CT3 đến loài bằng sinh học phân tử..................................67
3.6. Thu nhận CPE protease thô từ dịch nuôi cấy ................................................68
3.6.1. Tách CPE protease từ dịch nuôi cấy bằng tác nhân tủa khác nhau ........68

3.6.2. Hoạt độ protease thu nhận bởi các tác nhân tủa của CPE ......................69
3.7. Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease thô ...........70
3.7.1. Ảnh hưởng của pH .................................................................................70
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .........................................................................71
3.8. Khảo sát sự thủy phân của các cơ chất protein khác nhau bởi chế phẩm
protease. ................................................................................................................73
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................78
4.1. Kết luận ..........................................................................................................78
4.2. Kiến nghị........................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80


vii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CPE

Chế phẩm enzyme

CPE B

Chế phẩm enzyme của chủng B. amyloliquefaciens CT3

DNS

Acid 3,5 - dinitrosalicylic

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

IUBMB

International Union of Biochemistry and Molecular Biology

KL

Khuẩn lạc

KHV

Kính hiển vi

MT

Môi trường

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

NF

Nitơ formol

NS

Nấm sợi

NT

Nitơ tổng

OD

Mật độ quang

PMSF

Phenylmetysulfonyfuoride

TB

Trung bình

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc chung của acid amin .......................................................................... 5
Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme protease................................................................ 8
Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 9 chủng VK có hoạt tính protease cao nhất ........ 49
Hình 3.2. Hình thái KL của chủng CT3 và chủng CT7 ................................................. 52
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng CT3 và chủng CT7 ............................................. 52
Hình 3.4. Bào tử của chủng CT3 và chủng CT7 ............................................................ 52


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm và nguồn gốc thu nhận các nhóm protease ....................... 12
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng VK phân lập .................. 48
Bảng 3.2. Hoạt độ protease của các chủng VK .............................................................. 50
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của hai chủng CT3 và CT7 ............................................ 51
Bảng 3.4. Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CT3 và chủng CT7 ................ 53
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus .... 54
Bảng 3.6. Hàm lượng nitơ tổng số của các nguyên liệu ................................................ 55
Bảng 3.7. Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ........................................................................................................................... 56
Bảng 3.8. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ........................................................................................................................... 57
Bảng 3.9. Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ............. 59
Bảng 3.10. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ................ 61
Bảng 3.11. Ảnh hưởng chế độ lắc đến hoạt độ protease ................................................ 62
của 2 chủng Bacillus ...................................................................................................... 62
Bảng 3.12. Động học quá trình lên men của 2 chủng Bacillus ...................................... 64
Bảng 3.13. Hiệu suất thu hồi CPE B bởi các tác nhân tủa khác nhau .......................... 68

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt độ chung, hoạt độ riêng của
CPE B ............................................................................................................................. 69
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B ............................................... 70
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B ....................................... 72
Bảng 3.17. Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ
chất khác nhau ................................................................................................................ 74
Bảng 3.18. Hiệu suất thủy phân của CPE B theo thời gian trên các cơ chất khác
nhau ................................................................................................................................ 76


x

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Biểu đồ 3.1. Hoạt độ protease của một số chủng VK ...............................................50
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................54
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng loại cơ cất cảm ứng đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................56
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng
Bacillus ......................................................................................................................58
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ......59
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus ............61
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus .........63
Đồ thị 3.5. Động học quá trình lên men của chủng CT3 ..........................................65
Đồ thị 3.6. Động học quá trình lên men của chủng CT7 ..........................................65
Biểu đồ 3.4. Hiệu suất thu hồi của CPE B bởi các tác nhân tủa khác nhau ..............68
Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B ..........................................71
Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B ..................................72
Đồ thị 3.9. Hàm lượng nitơ formol tạo thành theo thời gian thủy phân trên các cơ
chất khác nhau ...........................................................................................................75

Đồ thị 3.10. Hiệu suất thủy phân của CPE B theo thời gian trên các cơ chất khác
nhau ...........................................................................................................................77


1

MỞ ĐẦU
 Lí do chọn đề tài.
Protease là một nhóm enzyme có khả năng thủy phân protein. Protease được
coi là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp quan trọng (Al Shehri et al.,2004) và
lớn nhất, chiếm 60% - 65% tổng lượng enzyme toàn thế giới (Genckel và Tari,
2006). Chúng được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm
và thức ăn gia súc, trong công nghiệp sữa, sản xuất bia, chế biến thịt cá, công
nghiệp thuộc da, trong y học, trong sản xuất mỹ phẩm và xử lý MT. Trên thế giới,
riêng ngành công nghiệp sản xuất xà phòng và các chất tẩy rửa sử dụng tới 50 – 60
ngàn tấn protease mỗi năm.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, VSV. Tuy nhiên nguồn protease ở
VSV phong phú nhất, có ở hầu hết các VSV như VK, nấm sợi và xạ khuẩn. Hầu hết
các protease thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm được sản xuất bởi các VK
thuộc chi Bacillus (Mabrouk et al., 1999; Mehrota et al., 1999) nhưng tiềm năng
hơn cả là các chủng B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, và B.
majovensis (R.Gupta et al., 2002). Trong số tất cả các protease, protease kiềm được
sản xuất bởi các loài thuộc chi Bacillus có tầm quan trọng lớn trong ngành công
nghiệp chất tẩy rửa do bền nhiệt, bền pH (Johnvesly và Naik, 2001). Các loài thuộc

chi Bacillus rất phổ biến trong không khí, trong mùn thực vật, đặc biệt là trong đất.
Chúng có nội bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất diệt khuẩn, chất hút
ẩm (E. M. El – Safey, U. M. Abdul-Raouf, 2004). Các loài này có khả năng thích
nghi cao, có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết trong quá trình sống để
thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT (E.El Mayday, 1989) như: amylase,

hemicellulase, glucanase, xylanase, protease,…
Ở Việt Nam ngành công nghiệp enzyme vẫn chưa thực sự phát triển, hàng
năm nước ta phải nhập một lượng lớn các enzyme để ứng dụng trong công, nông
nghiệp và giải quyết ô nhiễm MT. Cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu và sử
dụng prorease tập trung trên các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một số đặc
tính của enzyme, tuy nhiên vẫn còn hạn chế do giá thành chế phẩm enzyme còn cao.


2

Cần tiếp tục nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra giải pháp ứng
dụng phù hợp điều kiện sản xuất thực tế ở Việt Nam.
Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát
khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus.”
 Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp
protease cao.
 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng Bacillus phân lập từ các mẫu đất vườn khác
nhau ở phường Hiệp Bình Chánh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
 Nhiệm vụ của đề tài.
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh protease có hoạt độ cao
từ các mẫu đất vườn.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng
đã chọn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện MT đến hoạt độ protease của các
chủng. Chọn 1 chủng có hoạt độ protease cao để phân loại tới loài và thu nhận CPE
protease bán tinh khiết.
- Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố lý hóa lên hoạt tính của CPE protease.
- Bước đầu thử nghiệm tác dụng của CPE protease trong việc thủy phân các
cơ chất protein khác nhau: casein, bột cá và bột đậu nành.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về enzyme
1.1.1 Khái niệm về enzyme
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa
học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. Chúng có trong tất cả
các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. Chúng không những có khả năng xúc
tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng
vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học [1], [2],[3].
Enzyme là những phân tử protein có khối lượng phân tử lớn. Đa số enzyme
có khối lượng phân tử trung bình từ 6000 – 1000000 dalton do vậy enzyme không
đi qua được màng bán thấm [1], [6].
Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các
dung dịch đệm tạo thành dung dịch keo, nhưng enzyme không hòa tan trong các
dung môi không phân cực [6]. Enzyme bị kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein
như muối trung tính, dung môi hữu cơ nên các chất này được dùng thu chế phẩm
enzyme. Tuy nhiên, protein sẽ bị biến tính làm cho enzyme mất hoạt tính do tác
động của các tác nhân như: nhiệt độ cao, MT acid hay kiềm quá cao, các muối kim
loại nặng [2], [3].
Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế đã thống nhất phân loại các enzyme
thành 6 lớp chính dựa vào kiểu phản ứng do enzyme xúc tác [6].
1) Oxydoreductase: Xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử.
2) Transferase: Xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
3) Hydrolase: Xúc tác cho phản ứng thủy phân.
4) Lyase: Xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết không cần H 2 O hoặc loại
H 2 O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H 2 O vào nối đôi.
5) Isomerase: Xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
6) Ligase: Xúc tác cho phản ứng kết hợp 2 phân tử kèm theo cắt đứt liên kết

giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphotphase khác.


4

1.1.2. Cấu trúc phân tử enzyme
Enzyme là những protein được cấu tạo bởi các L- α amino acid kết hợp với
nhau qua liên kết peptid (- CO – NH -).
Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là
enzyme một thành phần, hoặc là protein phức tạp, gọi là enzyme hai thành phần hay
holoenzyme.
Enzyme một thành phần thì chỉ được cấu tạo bởi một thành phần hóa học
duy nhất là protein, những enzyme này thường xúc tác cho phản ứng thủy phân.
Enzyme hai thành phần gồm có:
- Phần protein gọi là apoprotein hay apoenzyme.
- Phần phi protein gọi là cofactor (yếu tố phối hợp) có vai trò thúc đẩy quá
trình xúc tác. Các cofactor có thể là các ion kim loại (Cu2+, Zn2+, Fe2+…) [6].
Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme
kết hợp với cơ chất biến đổi cơ chất thành sản phẩm phản ứng. Có những enzyme
có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt
động [3]. Mỗi trung tâm hoạt động thường gồm 2 vùng:
- Vùng gắn với cơ chất: còn gọi là trung tâm tiếp xúc hay trung tâm cơ chất,
là vùng liên quan tới tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất.
- Vùng xúc tác: có nhiệm vụ tạo ra khả năng cần thiết nhằm biến đổi chuyển
hóa cơ chất đã được gắn vào enzyme, tạo điều kiện chuyển thành sản phẩm dễ dàng
hơn. Vùng xúc tác liên quan tới kiểu phản ứng.
1.1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các
đặc điểm của chất xúc tác nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau:
E + S  ES  P + E

Trong đó,

E: enzyme
S: Cơ chất
ES: phức hợp cơ chất
P: sản phẩm.


5

Enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp.
Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá. Giai đoạn này xảy ra sự
biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của
enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên
kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn III: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và tách
khỏi enzyme. Enzyme được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu [2].
1.2. Protein và enzyme protease
1.2.1. Protein
1.2.1.1. Khái niệm
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các
đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết
peptide. Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các
bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein [90], [30].
1.2.1.2. Cấu trúc của protein
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân
là các acid amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (NH 2 ), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất
của acid amin [10].

Hình 1.1. Cấu trúc chung của acid amin


6

 Có 4 bậc cấu trúc của protein
 Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình
thành nên chuỗi polypeptide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin
thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một
của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide.
Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên
chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ
đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai
trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến
sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.
 Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong
không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu
trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hydro giữa những
acid amin ở gần nhau.
 Cấu trúc bậc ba: các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau
thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không
gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc
này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm –R trong các mạch polypeptide.
Chẳng hạn nhóm –R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S), nhóm – R của
prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp hay
những nhóm – R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì
chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay điện hóa
trị có ở giữa các nhóm –R có điện tích trái dấu.
 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với

nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với
nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro [31].
1.2.1.3. Sự biến tính của protein [31]
Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy
cơ học... hay tác nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu


7

trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc
một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu. Đó
là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein thường có các tính chất
sau:
- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong
phân tử protein.
- Khả năng giữ nước giảm.
- Mất hoạt tính sinh học ban đầu.
- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện
các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease.
- Tăng độ nhớt nội tại.
- Mất khả năng kết tinh.
1.2.2. Protease
1.2.2.1. Khái niệm
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide
(- O – NH -) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thuỷ
phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều
protease còn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết ester, liên kết amid và phản
ứng chuyển vị gốc acid amin [2], [3]. Phản ứng theo sơ đồ sau:

1.2.2.2. Phân loại

 Dựa vào cơ chế xúc tác
Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm:


8

 Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầu
mạch. Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc
amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase.
 Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nội
mạch. Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptidase
[39], [2], [3].

Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của enzyme protease
 Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [16], [53]
Dựa vào cấu trúc nhóm chức ở trung tâm hoạt động, endopeptidase được
chia thành 4 nhóm:
 Serin – proteinase (EC 3.4.21): là những protease có nhóm (-OH) của
serine trong trung tâm hoạt động ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
 Cystein – proteinase (EC 3.4.22): là các protein có nhóm thiol (-SH) của
acid amin cystein ở trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease
thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng. Các cyteine protease
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
 Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo protease (EC 3.4.23): metallo protease là nhóm protease trong
cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở VK, nấm sợi cũng như các VSV bậc cao hơn.

9

Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt động giảm
mạnh dưới tác động của EDTA.
 Dựa vào pH hoạt động [3].
Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme
protease được chia làm 3 loại:
 Protease acid: pH opt trong khoảng 2 ÷ 5. Loại protease này thường được
thu nhận từ các loại NS đen như: A. niger, A. awmori, A. saitoi.
 Protease trung tính: có pH opt trong khoảng hẹp, từ 6 ÷ 7,5, không bền với
nhiệt độ cao. Thu nhận chủ yếu từ các loại NS vàng như: A. oryzae, A. flavus, A.
fumigatus, A. tericola.
 Protease kiềm tính: có pH opt trong khoảng 8 ÷ 11 thường được tổng hợp
nhiều bởi nấm men và VK. Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá
nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc
giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử lý chất thải MT.
 Dựa vào tính đặc hiệu của chúng với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi βinsulin bị oxy hóa [3]
Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốn nhóm
lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đối với chuỗi β
– Insulin đã bị oxy hóa.
 Nhóm I - Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về
phía

nhóm

–CO 2

của

liên

kết

peptide,

do

đó

còn

được

gọi

là

carbonxyendopeptidase.
 Nhóm II - Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặc điểm có
cấu tạo của trung tâm hoạt động.
 Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc amino acid về
phía nhóm –NH - của liên kết peptide, do đó còn được gọi là aminoendopeptidase.
 Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồn gốc
amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide.


10

1.2.2.3. Cơ chế tác dụng của protease

Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease VSV có khác nhau nhưng
chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng cơ chế chung
như sau:
E + S → ES → ES’ + P 1 → E + P 2
Trong đó:
E: enzyme
S: cơ chất
ES: phức chất enzyme – cơ chất.
ES’: phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa (Acyl enzyme).
P 1 : sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới
được tạo thành).
P 2 : sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới
được tạo thành) [16].
1.2.2.4. Nguồn thu protease
Enzyme có trong mọi tế bào sinh vật. Sau khi tổng hợp enzyme có thể được
tiết ra ngoài tế bào, tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch MT gọi là enzyme ngoại bào.
Các enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hoà tan trong tế bào chất hoặc trong các
thành phần cấu tạo của tế bào chất, và chỉ có thể nhận được enzyme khi phá vỡ tế
bào. Đa phần enzyme thuỷ phân là enzyme ngoại bào. Trong những tế bào của các
cơ quan khác nhau hay các bộ phận dưới tế bào khác nhau thì các enzyme có hàm
lượng và thể loại khác nhau. Do đó enzyme mang tính đặc trưng [83]. Protease có
thể được thu từ các nguồn sau:
Ở động vật, protease thường có ở tuyến tiêu hóa: tuyến tụy, niêm mạc dạ
dày, niêm mạc ruột non [81], [12]. Ví dụ: pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của
động vật có vú, chim, bò sát, cá được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa và dịch vị. Rennin
chỉ có ở ngăn thứ tư của dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, có khả năng làm đông tụ
sữa, được sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat. Catalase có trong gan bò
được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm [12].

11

Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong quả
[71]. Ví dụ: papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ, bromelain thu từ quả,
chồi dứa, vỏ dứa [38]. Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả [81], [12].
Ở VSV, nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease như VK, xạ khuẩn,
NS. Protease có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào MT nuôi cấy [7], [10].
Các VK thông thường dùng trong tổng hợp protease là B. subtilis, B. cereus,
B. brevis, B. licheniformis…sinh các protease trung tính. B. thermophilus tổng hợp
protease chịu nhiệt. Xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S. griseus, S.
rimosus…NS tổng hợp protease gồm có A. oryzae, A. awamori, A. niger, một số
loài Penicilium và Rhizopus [17], [22].
Trong ba nguồn sinh vật dùng để khai thác và thu nhận enzyme, nguồn VSV
được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì có các ưu điểm sau:
- Có thể chủ động quá trình sản xuất enzyme từ VSV vì quá trình sinh
trưởng, phát triển và tổng hợp enzyme của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào
điều kiện ngoài.
- Chu kì sinh trưởng và phát triển của VSV ngắn do đó việc sản xuất enzyme
từ VSV trong thời gian ngắn từ 36h – 60h.
- Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzyme từ VSV theo hướng sản
xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn.
- Giá thành của enzyme sản xuất từ VSV thấp. MT nuôi cấy VSV thường
đơn giản và rẻ tiền.
- Các enzyme thu được từ VSV có hoạt tính rất cao.
- VSV có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau.


12

Bảng 1.1: Tóm tắt đặc điểm và nguồn gốc thu nhận các nhóm protease

Carboxyl protease

Thiol protease

Protease kim

Serine

(Aspartic)

(Cystein)

loại

protease

3.4.23

3.4.22

3.4.23

3.4.24

30-45

34-35

19-37

18-35

pH tối ưu

3-5

2-3

5-7

6-11

nhiệt độ tối ưu

40-55

40-55

65-85

50-70

Ca2+

-

Ca2+, Zn2+

Ca2+

Loại protease
Mã số
Trọng lượng
phân tử (kDa)

Ion kim loại
thiết yếu
Amino acid
trung tâm
hoạt động

- Aspartate

- Aspartat

Phenyl-alanyl

- Cysteine

- Cysteine

hay leucine

- Serine
- Histidine
- Aspartate

PMSF, DIFP.
Các chất ức

chế chính

Pestatin

Các tác nhân

EDTA, chất ức

Indoacetanide p-

bắt giữ như

chế trysin đậu

CMB

EDTA,

nành, indole,

EGTA

phenol, aid
triamino acetic

Aspergillus,
Mucor, Endothia,
Nguồn thu

Rhizopus,

nhận chính

Penicilium,
Neurospora, dạ
dày động vật

Aspergillus, thân
cây dứa

Bacillus,

(Ananascomoru,

Arpergillus,

Bacillus,

mủ sung (Ficus.

Penicilium,

Arpergillus,

sp), cây đu đủ,

Pseudomonas,

ruột động vật

Streptococcus,

Streptomyces

Clostridium


13

1.2.2.5. Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [1],
[3], [12].
 Công nghiệp thực phẩm
 Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng [12]. Tuy nhiên, protease VSV có nhược điểm
là chúng còn có khả năng thủy phân sâu casein làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng
phomat [57]. Ở Nhật Bản, từ canh trường bề mặt của Mucor, người ta thu được chế
phẩm protease dùng trong sản xuất phomat. Một số nước cũng thu được chế phẩm
tương tự từ nấm mốc A. candidus, hoặc từ B. mensentericus.
 Trong sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn bột,
giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp và nở tốt hơn.
 Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, protease được dùng làm mềm
thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ
mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân
từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, … [25].
 Trong chế biến thuỷ sản, từ lâu người ta đã nghiên cứu và biết được tác
dụng của các enzyme tiêu hóa và các enzyme khác có sẵn trong nguyên liệu có tác
động tới quá trình thủy phân cá trong sản xuất nước mắm. Để tăng hiệu quả quá

trình thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, làm giảm độ mặn ban đầu
của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease và cá bằng cách xay
nhỏ cá. Thêm vào đó, người ta còn bổ sung thêm protease từ bên ngoài vào để làm
tăng tốc độ, hiệu quả thủy phân protein cá [61], [1]. Còn trong sản xuất bột cá nếu
sử dụng protease sẽ dễ dàng tách da thịt ra khỏi xương, bột cá mịn hơn, hiệu quả
kinh tế cao hơn [1].