khảo sát hoạt tính kháng phân bào in vitro của gossypol và plumbagin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH.
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA
GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN
MÃ SỐ: CS 2000-15

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11 năm 2002


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH.
KHOA SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
NĂM 2000-2001

ĐỀ TÀI:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH

KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA
GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN
MÃ SỐ: CS 2000-15

Nhóm thực hiện:
Dƣơng Thị Bạch Tuyết *
Nguyễn Đăng Quân **
Phan Kim Ngọc **
Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng *
* Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp. Hồ Chí Minh
** Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 11 năm 2002


MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 2
I. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ ...................................................... 2
1. Bản chất của bệnh ung thƣ ............................................................................................. 2
2. Sự khác nhau của mỗi loại ung thƣ: ............................................................................... 2
3. Có thể phòng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ .................................................................. 5
II. ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ ......................................................... 5
1. Đại cƣơng về khối u và lịch sử nghiên cứu ................................................................... 5
2. Tế bào ung thƣ ............................................................................................................... 6
3. Sơ lƣợc về cơ sở sinh học phân tử của ung thƣ ............................................................. 8
III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ .................................................................. 9
1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ ....................................................................... 9

2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ ................................................................................ 9
3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ ........................................................................... 10
IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ..................................................... 11
1. Đặc điểm của tế bào động vật ...................................................................................... 11
2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật ........................................................................... 12
PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP .............................................................................. 15
I. VẬT LIỆU ............................................................................................................................ 15
1. Gossypol ...................................................................................................................... 15
2. Plumbagin .................................................................................................................... 16
3. Các dòng tế bào ung thƣ .............................................................................................. 17
II. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................................. 18
1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào: ...................................................................................... 18
2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): .................. 18
3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay): ................................................................................ 19
4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay): .............................................................. 20
5. Phƣơng pháp xử lý thống kê ........................................................................................ 20
PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ..................................................................................... 21
I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ........................................... 21
II. TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 ...................................... 23
PHẦN V: KẾT LUẬN ............................................................................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 28


PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao trên thế giới
cũng nhƣ ở Việt Nam. Đây là dạng bệnh lý có liên quan đến hiện tƣợng rối loạn trong quá
trình điều hòa sự phân chia tế bào ở các mô trong cơ thể. Khối u hình thành do những tế bào
ung thƣ phân chia liên tục không đƣợc kiểm soát, ban đầu khối u định vị tại một mô nhƣng
sau đó tế bào ung thƣ có thể di căn khắp cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong. Ung
thƣ hiện vẫn là vấn đề nan giải của Y học, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra hoạt chất hay phƣơng

pháp nào điều trị hữu hiệu tất cả các dạng ung thƣ.
Nghiên cứu về bệnh ung thƣ và cách chữa trị ung thƣ là lĩnh vực rất đƣợc quan tâm
trên thế giới. Đã có nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thƣ đƣợc thành lập ở nhiều quốc gia
trên thế giới nhƣ: American Association Cancer Research, Australian Cancer Society, British
Association for Cancer Research, National Cancer Institute of Canada, European Association
for Cancer Research . . . Nhiều nghiên cứu về bệnh ung thƣ và cách chữa trị ung thƣ đƣợc
thực hiện trên thế giới và đã đạt đƣợc nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của sự phân bào, cơ
chế phân tử của bệnh ung thƣ, các phƣơng thức hữu hiệu để tiêu diệt hay ngăn cản sự phát
triển của tế bào ung thƣ và gần đây nhất là giải Nobel Sinh lý và Y học năm 2001 cũng là
những phát hiện liên quan đến các protein tham gia vào quá trình phân bào và ung thƣ.
Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đó
có thể sẽ có nhiều cây thuốc với những hoạt chất kháng ung thƣ mạnh có thể ứng dụng vào
điều trị. Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt chất kháng ung thƣ ở nƣớc ta không nhiều.
Trƣớc tình hình đó, việc phát triển những phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định
hoạt tính kháng ung thƣ của các chất chiết xuất từ thực vật là cần thiết, từ đó nâng cao hiệu
quả sử dụng của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam và làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu
hơn. Để bƣớc đầu thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng phân
bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin có nguồn gốc từ cây thuốc dân gian đƣợc biết là
có khả năng kháng ung thƣ [11,13] trên hai dòng tế bào ung thƣ của ngƣời trong điều kiện in
vitro.

1


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ
1. Bản chất của bệnh ung thƣ
Ung thƣ là bệnh lý ác tính của tế bào. Khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thƣ,
tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của
cơ thể.

Đa số ngƣời bị ung thƣ hình thành các khối u. Khác với khối u lành tính (chỉ phát
triển tại cho thƣờng rất chậm, có vỏ bọc chung quanh), các khối u ác tính (ung thƣ) xâm lấn
vào các tổ chức lành xung quanh giống nhƣ hình "con cua" với các càng cua bám vào các tổ
chức lành trong cơ thể hoặc giống nhƣ rễ cây lan trong đất. Các tế bào của khối u ác tính có
khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hay các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối
cùng dẫn đến tử vong.
Đa số ung thƣ có biểu hiện mãn tính, có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua
nhiều giai đoạn. Trừ một số nhỏ ung thƣ ở trẻ em có lẽ do đột biến gen ở giai đoạn bào thai,
còn phần lớn ung thƣ đều có giai đoạn tiềm tàng lâu dài, có khi hàng chục năm không có dấu
hiệu gì trƣớc khi phát hiện thấy dƣới dạng các khối u. Khi các khối u phát triển nhanh mới có
triệu chứng ung thƣ. Triệu chứng đau chỉ xuất hiện khi ung thƣ ở vào giai đoạn cuối.

2. Sự khác nhau của mỗi loại ung thƣ:
Ngƣời ta biết đƣợc có đến 200 loại ung thƣ khác nhau trên cơ thể ngƣời. Những loại
ung thƣ này tuy có những điểm giống nhau về bản chất nhƣng chúng có nhiều điểm khác
nhau nhƣ sau:
2.1. Khác nhau về nguyên nhân
Qua các nghiên cứu dịch tễ học của R.Doll và Petro trên 80% tác nhân sinh ung thƣ là
bắt nguồn từ môi trƣờng sống, trong đó có 2 tác nhân lớn nhất là: 35% do chế độ ăn uống gây
nhiều loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa và khoảng 30% ung thƣ do thuốc lá (gây ung thƣ phổi, ung
thƣ đƣờng hô hấp trên . . .).
Các tác nhân khác gồm:
- Tia phóng xạ: có thể gây ung thƣ máu, ung thƣ tuyến giáp.
- Bức xạ tử ngoại: có thể gây ung thƣ da.

2


- Virus Epstein - Barr: gây ung thƣ vòm họng, u lympho ác tính.
- Virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) dẫn đến ung thƣ gan . . .

- Các loại hóa chất đƣợc sử dụng trong công nghiệp, trong thực phẩm, trong chiến
tranh, các chất thải ra môi trƣờng nƣớc và không khí là tác nhân của nhiều loại ung thƣ khác
nhau.
2.2. Khác nhau về tiến triển
Ung thƣ thƣờng xuất phát từ 2 tổ chức chính của cơ thể:
- Từ các tế bào biểu mô của các tạng, các cơ quan (ung thƣ biểu mô: carcinoma)
- Từ các tế bào của tổ chức liên kết của cơ thể (sarcoma). Ung thƣ của cơ quan tạo
huyết (máu, hạch lympho) là một dạng đặc biệt của ung thƣ tể chức liên kết
(Hematosarcoma).
Mỗi loại ung thƣ có hƣớng tiến triển khác nhau. Trong từng loại, mỗi loại ung thƣ của
mỗi cá thể khác nhau, xu hƣớng tiến triển cũng rất khác nhau.
- Có loại ung thƣ tiến triển rất nhanh (ung thƣ máu, hạch, ung thƣ hắc tố, các ung thƣ
liên kết. . .).
- Có nhiều loại ung thƣ tiến triển chậm: ung thƣ da tế bào đáy, ung thƣ giáp trạng, ung
thƣ cổ tử cung . . .
- Loại ung thƣ biểu mô thƣờng di căn theo đƣờng bạch huyết đến các hạch khu vực.
- Loại ung thƣ liên kết (xƣơng, phần mềm) thƣờng di căn theo đƣờng máu tới các tạng
ở xa (vào gan, phổi, xƣơng).
Thông thƣờng ung thƣ càng ở giai đoạn muộn, càng hay có di căn ra hạch khu vực và
di căn xa nhƣng đôi khi có di căn rất sớm, thậm chí từ lúc chƣa phát hiện thấy u nguyên phát.
Tốc độ phát triển của ung thƣ cũng tùy thuộc vào từng giai đoạn của từng loại. Ở
những giai đoạn sớm (insitu, giai đoạn 1) ung thƣ thƣờng tiên triển lâu dài, chậm chạp, nhƣng
ở các giai đoạn muộn (giai đoạn 3,4) ung thƣ tiến triển thƣờng rất nhanh và gây tử vong.
Ung thƣ ở ngƣời càng trẻ, thƣờng tiến triển nhanh hơn ngƣời già.

3


2.3. Khác nhau về phƣơng pháp điều trị
Trong y văn có nói đến một tỷ lệ rất nhỏ ung thƣ tự khỏi (1/10.000). Có thể ở những

cơ thể cá biệt, có hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt đƣợc các tế bào ung thƣ sau khi
đã phát sinh. Nhƣng trên căn bản nếu không điều trị thì chắc chắn bệnh nhân sẽ sớm dẫn đến
tử vong. Càng điều trị ung thƣ ở giai đoạn sớm, bệnh nhân càng có cơ may trị khỏi bệnh ung
thƣ. Ở những giai đoạn muộn hơn cũng cần điều trị để tạm thời ổn định hoặc kéo dài thời
gian sống hoặc giảm các triệu chứng của ung thƣ.
Mỗi loại ung thƣ, mỗi giai đoạn bệnh có phƣơng pháp điều trị khác nhau.
- Điều trị phẫu thuật: thƣờng áp dụng cho ung thƣ ở giai đoạn sớm chƣa có di căn.
- Điều trị tia xạ: thƣờng áp dụng cho những ung thƣ ở giai đoạn tƣơng đối muộn hơn.
Thƣờng phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối u để dễ mổ hoặc diệt những tế bào u tại
chỗ và hạch khu vực mà khi mổ nghi ngờ chƣa lấy hết hạch, hoặc áp dụng tia xạ cho ung thƣ
ở các vị trí không thể mổ đƣợc.
- Điều trị hóa chất: trƣớc đây áp dụng cho những loại ung thƣ có tính chất toàn thân
hay ở giai đoạn muộn, có di căn, nhƣng ngày nay số ung thƣ ở giai đoạn sớm (trên lâm sàng)
nhƣng tính chất ác tính cao, dễ di căn hoặc nghi có vi di căn (ung thƣ vú, tinh hoàn, buồng
trứng, ung thƣ rau . . . ) ngƣời ta cũng sử dụng hóa trị để phòng ngừa và nâng cao hiệu quả
điều trị.
- Điều trị miễn dịch: là 1 trong 2 phƣơng pháp điều trị toàn thân, còn đang đƣợc
nghiên cứu và có nhiều hy vọng. Có nhiều thử nghiệm đã áp dụng nhƣ điều trị kích thích
miễn dịch không đặc hiệu, điều trị bằng interferon, các lymphokin và gần đây là các nghiên
cứu dùng kháng thể đơn dòng đã điều trị một số bệnh ung thƣ có kết quả tốt.
2.4.Khác nhau về tiên lƣợng bệnh
Tiên lƣợng ung thƣ phụ thuộc rất nhiều yếu tố trên từng bệnh nhân. Những yếu tố
chính là:
- Giai đoạn ung thƣ: càng sớm tiên lƣợng càng tốt và ngƣợc lại.
- Loại ung thƣ: những ung thƣ ở bề mặt có tiên lƣợng tốt hơn (dễ phát hiện, dễ điều
trị) nhƣ ung thƣ da, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ vú, ung thƣ giáp trạng, ung thƣ khoang
miệng, ung thƣ đại trực tràng . . .

4

Có những ung thƣ ở các tạng quan trọng khó phát hiện sớm, khó điều trị, tiên lƣợng
thƣờng xấu nhƣ ung thƣ phổi, gan, não, tụy, xƣơng . . .
- Tính ác tính của tế bào ung thƣ: cùng 1 loại ung thƣ, cùng giai đoạn lâm sàng nhƣng
độ ác tính của chúng khác nhau. Độ ác tính càng cao tiên lƣợng càng xấu.
- Thể trạng của ngƣời bị ung thƣ: ở ngƣời già ung thƣ thƣờng tiến triển chậm nhƣng
thể trạng yếu nên khó thực hiện đƣợc phác đồ điều trị 1 cách triệt để nên càng già yếu tiên
lƣợng càng xấu.

3. Có thể phòng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ
Nhƣ trên đã đề cập đến tác nhân sinh ung thƣ chủ yếu là từ môi trƣờng bên ngoài (trên
80%). Tác nhân nội sinh rất ít (chỉ khoảng 1%). Vì vậy, phòng bệnh ung thƣ có hiệu quả khi
ngăn chặn tốt các tác nhân do môi trƣờng tác động vào đời sống con ngƣời nhƣ: ngừng hút
thuốc lá, chế độ dinh dƣỡng vệ sinh an toàn hợp lý, chống lạm dụng các hóa chất công
nghiệp, chống ô nhiễm môi trƣờng, phòng bệnh nghề nghiệp ... sẽ làm giảm tỷ lệ mắc ung
thƣ.
Một số loại bệnh ung thƣ có liên quan đến virus đã đƣợc ngƣời ta áp dụng vaccin để
phòng ung thƣ nhƣ vaccin phòng viêm gan B, và ngƣời ta đang nghiên cứu vaccin phòng
Esptein-Barr gây ung thƣ vòm họng và u lympho . . .
Ngoài ra các biện pháp điều trị tổn thƣơng tiền ung thƣ, các biện pháp sàng lọc phát
hiện sớm một số ung thƣ hay gặp (vú, cổ tử cung, khoang miệng, đại trực tràng . . .) đã thiết
thực làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thƣ. [1]

II. ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ
1. Đại cƣơng về khối u và lịch sử nghiên cứu
Nghiên cứu cơ chế sinh bệnh ung thƣ cần phải đi sâu tìm hiểu về quá trình sinh học
của tế bào ung thƣ và sinh học phân tử của ung thƣ.
1.1. Phân biệt u lành và u ác tính theo đặc tính sinh học
U lành tính

U ác tính

Tế bào biệt hóa cao

Ít biệt hóa

Hiếm có phân bào

Luôn có phân bào

Phát triển chậm

Phát triển nhanh

Không xâm lấn

Xâm lấn lan rộng

5


Không có hoại tử

Hay có hoại tử trung tâm

Có vỏ bọc

Không có vỏ hoặc ranh giới

Rất ít tái phát

Luôn tái phát

Không di căn

Di căn

Ít ảnh hƣởng đến cơ thể

Ảnh hƣởng nặng tới cơ thể

1.2. Một số mốc lịch sử nghiên cứu về ung thƣ
- Xƣơng hóa thạch của loại khủng long cách đây 60 triệu năm có thƣơng tổn ung thƣ.
- Xác ƣớp ngƣời Ai cập ở Gaza cách đây 5000 năm thấy có ung thƣ xƣơng và ung thƣ
bàng quang.
- Thời Hypocrates đã để lại một số bản viết tay mô tả 2 loại ung thƣ: loại sùi ra ngoài
nhiều chân nhƣ loài tôm cua gọi là carcinoma và loại phát triển sâu trong thịt gọi là sarcoma.
- 1846 R.Virchop (ngƣời Đức) mô tả tế bào ung thƣ máu và đƣa ra giả thuyết về
nguồn góc ung thƣ tế bào.
- 1953 J.Watson và F. Crick dƣa ra mô hình chuỗi xoắn kép phân tử DNA mô phỏng
các loại gen của tế bào. Công trình nhận giải Nobel Sinh học.
- 1979 Richard Doll lãnh đạo nhóm nghiên cứu nguyên nhân gây ung thƣ trên ngƣời
từ môi trƣờng sống. Trong đó ông và Petro nhấn mạnh vai trò quan trọng của hút thuốc, dinh
dƣỡng và các ung thƣ nghề nghiệp.
- 1981 Cesar Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (nhận giải
Nobel 1987).
- 1981 S.D.Thomas đã thành công ghép tủy xƣơng trên ngƣời ứng dụng xạ trị toàn
thân và điều trị hóa chất mạnh trong bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel năm 1990).

2. Tế bào ung thƣ

2.1. Nguồn gốc tế bào ung thƣ
Có một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế bào ung
thƣ.
2.7.7. Thuyết đơn dòng tế bào

6


Là quan niệm kinh điển: khối u sinh ra từ 1 tế bào mẹ nhân lên.
Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất thƣơng tổn
nhiễm sắc thể 10. Các tế bào ung thƣ đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase.
2.7.2. Thuyết đa dòng tế bào
Khi quan sát về hình thái và chức năng ngƣời ta thấy:
- Tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chẩn đoán hình thái học dễ nhầm
lẫn.
- Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học.
2.1.3. Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thƣ
Có thể ban đầu là một dòng, do gen tế bào ung thƣ không ổn định nên có các tế bào
biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp.
Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ. Các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp,
ung thƣ liên kết hỗn hợp.
2.2. Các đặc tính tế bào ung thƣ
- Hình thái học: tăng kích thƣớc nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tƣơng, không còn ức
chế tiếp xúc.
- Chức năng:
+ Hai đặc tính tại cho: xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch di chuyển và đi căn do
hiện tƣợng phân bào mạnh.
+ Tế bào biệt hóa thấp, không làm đƣợc chức năng bình thƣờng, nếu bị thiếu dƣỡng
chất dễ bị hoại tử nhất là vùng trung tâm u.
+ Đôi khi tiết ra những hoạt chất lạ mà qua đó ta có thể gián tiếp thấy đƣợc sự hiện

diện của tế bào ung thƣ khá đặc hiệu:
αFP: trong ung thƣ gan
CA125: trong ung thƣ buồng trứng
CA25: trong ung thƣ vú
CEA: trong ung thƣ đại trực tràng

7


HCG: trong ung thƣ nhau, ung thƣ tinh hoàn
β2Microglobulin, Belcezol: trong đa u tủy xƣơng.

3. Sơ lƣợc về cơ sở sinh học phân tử của ung thƣ
3.1. Phần quy định sinh sản tế bào là DNA của nhân tế bào
Trong ung thƣ việc thay đổi DNA dẫn đến sinh sản vô tổ chức là hậu quả của quá
trình đột biến gen, chứng cớ mạnh mẽ nhất là:
- Những chất gây đột biến gen tế bào chính là những tác động hoá lý gây ung
thƣ.
- Những tác động gây ung thƣ cũng gây nên đột biến gen.
3.2.Các gen gây ung thƣ (Oncogen)
Cho đến nay đã tìm ra trên 40 loại. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành Oncogen.
- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng trƣởng (growth
factor). Do rối loạn cơ chế điều hành, yếu tố tăng trƣởng hoạt hóa mạnh kích thích Oncogen
sinh ung thƣ.
- Oncogen là những đoạn DNA bị thƣơng tổn bởi các tác nhân gây bệnh nhƣ hóa học,
sinh học, vật lý. Cơ thể đã sửa chữa những đoạn DNA này nhƣng không hoàn chỉnh, nên
cùng tác nhân gây ung thƣ, có ngƣời bị ung thƣ có ngƣời không bị ung thƣ.
- Oncogen là do các genome của virus đƣa vào cơ thể vì thấy các Oncogen này giống
với DNA của virus ví dụ: HPV (cổ tử cung, dƣơng vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thƣ
gan).

Một số gen gây ung thƣ

Gen

Vị trí

Apc

5q

Mcc

5q

Raa

1p

Loại ung thƣ

Sai lạc

Hội chứng Gadner, ung thƣ trực tràng
Khuyết đoạn

Đa polip trực tràng
Ung thƣ đại tràng, hội chứng lynch
Ung thƣ đại tràng

P53

Abl

9q

+(6; 14)

Bạch cầu cấp lympho, ung thƣ buồng trứng

Myl

6q

+(8; 14)

U lympho Burkitt, ung thƣ nguyên bào thần kinh,

Myc

8q

bạch cầu cấp.

8


Ras

11p

Fms

5q

Khuyết đoạn

p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể

U Wilm, carcinoma
Nhiều loại ung thƣ
q: Nhánh dài nhiễm sắc thể

+: Nối đoạn [1]

III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ
1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ
Các thuốc chữa ung thƣ có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng
hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng nhƣ quá trình tổng hợp protein ở các tế bào ung thƣ
vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào.
Ở các mô ung thƣ của ngƣời có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không phân chia
(G0). Sự phân chia của tế bào có thể phân thành 4 giai đoạn:
- Giai đoạn G1 là thời kỳ sau gián phân. Thời gian của giai đoạn này rất khác nhau tùy
theo loại tế bào. Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng hợp DNA.
- Giai đoạn s là giai đoạn tổng hợp DNA.
- Giai đoạn G2 là giai đoạn tiền gián phân. Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và
các protein đặc hiệu của ung thƣ.
- Giai đoạn M là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào). Giai đoạn này lại chia
thành prophase, metaphase, anaphase và telophase.
Các thuốc chữa ung thƣ không ảnh hƣởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động lên các
giai đoạn s, Gọ và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đó của giai đoạn M mà
thôi.

2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ
Các tế bào ung thƣ có thể kháng lại các thuốc chữa ung thƣ cũng nhƣ vi khuẩn kháng
kháng sinh.
Cơ chế tế bào ung thƣ kháng thuốc có thể là:
- Làm giảm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thƣ.
- Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đổi các phân tử thuốc.
- Làm biến đổi các protein mục tiêu và các yếu tố cần cho thuốc tác động lên tế bào
ung thƣ.

9


- Làm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo phân chia tế bào mặc dù bị
thuốc tác động.
Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu do một loại thuốc nhất định, nhƣng cũng nhƣ kháng
kháng sinh, các tế bào ung thƣ cũng có hiện tƣợng kháng chéo thuốc. Ví dụ: một dòng tế bào
ung thƣ đã kháng alcaloid của dừa cạn, cũng kháng cả anthracyclin. Hiện tƣợng này gọi là
kháng đa thuốc (multidrug resistance)

3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ
Các thuốc chữa ung thƣ có tác dụng độc, ngăn cản sự phân chia các tế bào ung; thƣ,
nhƣng đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đó chúng thƣờng khá độc.
Tác dụng của thuốc chữa ung thƣ không đặc hiệu nhƣ các hóa trị liệu kháng khuẩn. Vì
vậy trong điều trị ung thƣ bằng hóa trị liệu thƣờng có nhiều tác dụng phụ có hại nhiều khi khá
nặng, đặc biệt là tác hại lên tủy xƣơng, trên các tế bào sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự
phát triển của tóc, bào thai, trên khả năng sinh miễn dịch.
Một trong những cách hiện đại làm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung thƣ là gắn
chúng lên các kháng thể đơn dòng.
Các biểu hiện độc thƣờng là:

- Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa
- Rụng tóc
- Trên tủy xƣơng: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu.
- Ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến vô sinh.
- Làm chậm tăng trƣởng và phát triển ở trẻ em.
- Gây ung thƣ thứ phát do dùng thuốc.
- Gây tổn thƣơng mạch máu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị
một thời gian.
- Rối loạn tính cách, hành vi.
- Sút cân, ngƣời yếu, không còn khả năng làm việc.
- Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm. Vì vậy ngƣời đã dùng thuốc
chữa ung thƣ thì không nên có con nữa. [2]

10


IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Đặc điểm của tế bào động vật
1.1. Tính cơ học yếu
Tế bào động vật không vách nhƣng kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 μm) nên
tính bền cơ học yếu. Do đó khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi
khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v... Trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào động vật cần
khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút).
Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động; vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất,
thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ. Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào
cũng cố gắng thật nhẹ nhàng.
1.2. Tăng trƣởng và phân chia chậm
Thời gian tăng gấp đôi số lƣợng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40
giờ. Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm.
Do đó cần có thời gian dài và khối lƣợng tế bào lớn khi chúng ta muốn sản xuất chất có hoạt

tính từ tế bào động vật.
1.3. Cơ chế kìm hãm ngƣợc (negative feed-back)
Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trƣờng của một chất bởi sự gia tăng
nồng độ chất này trong môi trƣờng. Do đó, việc thay mới môi trƣờng sau một thời gian nuôi
cấy nhất định là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt động của cơ chế kìm hãm ngƣợc này. Trong
phòng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngƣợc còn có thể gây tổn thƣơng tế bào, thậm chí làm chết
hàng loạt.
1.4. Tính chất cần giá đỡ
Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào
động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thƣờng tế bào tăng trƣởng
tốt khi sắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên
bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào nhƣ tế bào ung thƣ hoặc dòng tế bào
liên tục từ mô bình thƣờng, sau khi đƣợc thuần hóa, có thể sinh trƣởng và phân chia trong
trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền.
1.5. Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung
hợp 2 tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma). Hoặc quá

11


trình biến nạp, ví dụ: chủng tế bào bình thƣờng có thể đƣợc cảm ứng thành tế bào có các tính
chất của tế bào ung thƣ thông qua quá trình biến nạp đƣợc thực hiện bởi một virus cảm ứng
ung thƣ hoặc bằng hóa chất.
1.6. Có thể đƣợc bảo quản lâu dài bằng phƣơng pháp lạnh sâu
Các dòng tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản lạnh sâu -70°C trong một thời gian vô
định. Khi đƣợc giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi lại khả năng tăng trƣởng và phân chia
nhƣ ban đầu.
1.7.Các đặc tính khác
Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác nhƣ kém thích nghi

với môi trƣờng, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh,
hormon... để tăng trƣởng và phân chia.

2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi
trƣờng nuôi cây vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các công trình đầu tiên về nuôi cây tế
bào động vật ngƣời ta dùng hỗn hợp dung dịch muôi sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi
gà làm môi trƣờng nuôi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phôi gà rất rất phức
tạp, khó ổn định nên ngƣời ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các môi trƣờng
tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trƣờng và ổn định
môi trƣờng trong những lần nuôi cấy khác nhau.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập đƣợc thuần hóa với môi trƣờng tổng hợp
hoàn toàn, đa số các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp có bổ sung 5 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Thông thƣờng huyết thanh
bê đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả, nhƣng có một số loại tế bào cần phải sử dụng huyết thanh
bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS).
Một vài loại môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động
vật:
- Môi trường EM (Basal Medium): đây là môi trƣờng cơ bản do H. Eagle thiết lập, khi
dùng phải bổ sung; 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lƣợng tùy
loại tế bào. Thƣờng sử dụng nuôi cây tế bào Hela, tế bào L.
- Môi trường E'MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi trƣờng tối
thiểu, do H.Eagle thiết lập. Đây là môi trƣờng BM có chứa nồng độ cao

12


hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.
- Môi trường D'MEM (Dulbecco - Modified Eagle Medium) là môi trƣờng E'MEM do
Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp
4 lần so với môi trƣờng khác để nuôi đƣợc nhiều loại tế bào hơn.

- Môi trường F10, F12: do R.G, Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi
trƣờng này huyết thanh thƣờng đƣợc thay bằng 20μg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.107 M acid linoleic.
- Môi trường Iscove: do N.N.Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến môi trƣờng
DMEM.
- Môi trường SA: do T.A. Mc.Coy thiết lập, thƣờng đƣợc dùng cho tế bào bệnh bạch
huyết.
- Môi trường RPMI-1640: đƣợc G.E. Moore thiết lập tại viện nghiên cứu Roswell Part
Memorial Institute, đƣợc dùng để nuôi tế bào và mô bạch huyết.
- Môi trường 199: do R,C.Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô cơ phôi gà trong
sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt.
Trong hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh vì
nó có những vai trò quan trọng nhƣ sau:
- Cung cấp chất dinh dƣỡng quan trọng cho tế bào nhƣ các amino acid thiết yếu, tiền
chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lƣợng...
- Cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, kích thích cho tế bào tăng trƣởng và phân
chia.
- Kích thích sự phục hồi các tổn thƣơng của tế bào khi cấy chuyền và các protein
trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thƣơng tế bào.
- Cải thiện tính tan của các chất dinh dƣỡng.
- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính
của tế bào lên giá đỡ.
- Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của
oxy.

13


Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng
giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trƣờng nuôi cấy). Ngoài ra
huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lƣợng của những lô môi

trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế
bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng
tế bào nuôi cấy). Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trƣờng nuôi cấy
tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lƣợng thấp.
Có 2 phƣơng pháp điều chế môi trƣờng không có huyết thanh là phƣơng pháp của G.
Sato và phƣơng pháp của R.G. Ham. Cả 2 phƣơng pháp này đều thay huyết thanh bằng
những yếu tố khác nhƣ: kích thích tố, nhân tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, nhân tố kết
dính và kéo dài, các chất dinh dƣỡng, khoáng ... [3]

14


PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP
I. VẬT LIỆU
1. Gossypol
Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium
hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C. Hàm lƣợng gossypol trong hạt
bông biến đổi từ 0.1 - 6.64% tùy theo giống.
Trong kỹ nghệ cây bông, gossypol đƣợc xem nhƣ là phế phẩm có độc tính và thƣờng
đƣợc khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thƣờng dùng làm thức ăn gia súc.
Nhƣng hiện nay, sossypol có tầm quan trọng đặc biệt. Vào năm 1950, một bác sĩ
Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thƣờng các cặp vợ chồng không có con trong vùng
dùng nhiều dầu bông còn chứa gossypol.
Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con ngƣời cho thấy gossypol có tính
diệt tinh trùng.
Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức
phenol và 1 chức aldehid. Công thức nguyên C30H30O8, trọng lƣợng phân tử là 518.54, có
nhiệt độ nóng chảy là 1820 C.

Tác dụng sinh học của gossypol:

Năm 1950, ngƣời ta phát hiện tác dụng lên tinh trùng của gossypol. Nhiều thử nghiệm
trên động vật sau đó cho thấy gossypol gây nên:
- Sự giảm bớt tính di động và số lƣợng của tinh trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tinh
trùng dị dạng.
- Giảm thiểu sự sinh sản.
- Làm ngƣng trệ testosteron (kích khích tố nam).

15


Năm 1970, những thử nghiệm lâm sàng đã đƣợc thực hiện trên con ngƣời tại Trung
Quốc cũng cho thây kết quả tƣơng tự. Tuy nhiên, sau khi ngƣng dùng thuốc 3 tháng thì tinh
dịch của ngƣời trở lại bình thƣờng về mặt định tính và định lƣợng.
Ngoài ra gossypol còn có nhiều tác dụng khác nhƣ :
- Gây co rút ở các loài gặm nhấm.
- Kháng khuẩn.
- Tác dụng gây độc cho cơ thể: LD50 heo: 550 mg/Kg, LD50 chuột: 2200 mg/Kg. Hiện
tƣợng ngộ độc gossypol là sự uễ oãi, nôn mửa, tiêu chảy và khó thở dẫn đến chết vì ngạt thở.
[5]
Gossypol đƣợc thử nghiệm trên bệnh nhân bị ung thƣ thận (adrenocortical cancer) di
căn, kết quả là có 15% trƣờng hợp có đáp ứng. Nghiên cứu tác động của gossypol lên tế bào
ung thƣ vú của ngƣời nuôi cấy cho thấy gossypol có thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự
biểu hiện của nhiều protein điều hòa chu trình tế bào (cell cycle). Một thử nghiệm trên bệnh
nhân hóa trị liệu chống ung thƣ vú di căn cho thấy gossypol, ở liều lƣợng phù hợp, có tác
động lên những protein điều hòa chu trình tế bào và tác dụng có lợi lên một số bệnh nhân.
[13]

2. Plumbagin
Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 -78oC, đƣợc
chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae.

Công thức phân tử :C11H8O3
Trọng lƣợng phân tử : 188,18

Tính chất hóa học của plumbagin:
- Không tan trong nƣớc.
- Tan tốt trong CHCl3, C6H6, AcOH, (CH3)2CO...

16


- Cho màu đỏ máu với FeCl3
- Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)2 trong alcol.
Tác dụng sinh học của plumbagin:
- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin đƣợc sử dụng để trị các bệnh đƣờng tiêu hóa,
phong ghẻ.
- Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm.
Plumbagin đƣợc sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả.
- Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn Gram (-),
nấm, vi khuẩn kháng acid. Ví dụ nhƣ: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis,
Escherichia coli. [4]
- Một số tài liệu cho thấy plumbagin có hoạt tính kháng ung thƣ. [11,12]

3. Các dòng tế bào ung thƣ
3.1. Dòng tế bào RD (Rhabdomyosarcoma)
Ký hiệu: ATCC CCL 136 RD (từ Catalogue of American Type Culture Collection,
ATCC).
Dòng tế bào RD đƣợc thiết lập bởi R.M. McAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một
bé gái 7 tuổi ngƣời Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968. Các tế bào mọc thành những
lớp đơn trong môi trƣờng lỏng và tạo thành cụm tế bào (coloni) trên môi trƣờng E'MEM
Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal

Bovine Serum). Tế bào nuôi cấy có 2 dạng, dạng tế bào gần giống tế bào mô ung thƣ ban
đầu, và dạng tế bào trãi rộng có nhiều nhân. Tế bào có myoglobin và hoạt tính myosinATPase. Dòng tế bào RD là dòng tế bào ung thƣ cơ đầu tiên của ngƣời đƣợc xác định đặc
tính và nghiên cứu chi tiết.
3.2. Dòng tế bào HEp2 (Epidermoid carcinoma)
Ký hiệu: ATCC CCL HEp2 (từ Catalogue of American Type Culture Collection,
ATCC).
Dòng tế bào HEp2 đã đƣợc thiết lập bởi A.E. Moore, L. Sabachewsky, và H.W.
Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa dứt sữa sau khi đựơc tiêm mô ung
thu biểu bì thanh quản của 1 ngƣời đàn ông ngƣời Cap-ca (Caucasian) 56 tuổi. Việc phân lập
in vitro đã đƣợc thực hiện ở nhiều phức hợp của nƣớc ối thai bò, dịch chiết phôi, huyết thanh
ngƣời và ngựa, và dung dịch muối cân bằng, những

17


tế bào giống biểu mô này phát triển tốt trong nhiều dạng môi trƣờng nuôi cấy. Đây là một
dòng tế bào khỏe mạnh có thể chống lại nhiệt độ, thiếu hụt dinh dƣỡng, và những thay đổi
môi trƣờng mà không mất khả năng sống.

II. PHƢƠNG PHÁP
1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào:
Tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng E'MEM (Eagle ' Minimum Essential Medium)
có thành phần nhƣ sau:
Bột E'MEM

4.72g

L-Glutamine 200mM

5 ml

NaHCO3 7.5%

7.5 ml

HEPES 1M

10 ml

Amphotericin B 0.1%

125 μl

Penicillin

50.000 UI

Streptomycin

50 mg

Phenol đỏ 0.4%

1 ml

Huyết thanh
(Fetal bovine serum)

50 ml

Nƣớc cất

đủ 500 ml

pH

7.2

Điều kiện nuôi cây: 37.5o C, 5% CO2.

2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay):
Sau một thời gian nuôi cây trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách
rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng; mỗi giếng
gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và 400μl môi trƣờng.
Tế bào đƣợc ủ ở 37.5°C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi
trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc

18


plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đôi
với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt
chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.
Sau thời gian ủ, tách rời tế bào trong mỗi giếng bằng dung dịch trypsin/EDTA, hòa tế
bào vào 500 μg/ml môi trƣờng và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (dịch huyền
phù tế bào: thuốc nhuộm), Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu xanh) đƣợc xác định
bằng buồng đếm hồng cầu. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt
chất đƣợc tính theo công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) =

Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm
Mật độ tế bào đối chứng

100%
[6]

3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay):
Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5
diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti
thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật
độ quang OD570 của dung dịch.
Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách
rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng; mỗi giếng
gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào).
Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi
trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở
nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào
HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO.
Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.
Sau thời gian ủ, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0.5 mg/ml MTT.
Sau 4 giờ ở 37.50 C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl
(0.04M). Đo OD570 của các lô thí nghiêm và đối chứng. Khả năng ức chế sự phát triển các
dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: [7,8,9,10]
Tỷ lệ ức chế (%) =

OD570đối chứng - OD570thí nghiệm
OD570đối chứng

100%

19


4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay):
Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào
dƣới tác động của hoạt chất.
5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, đƣợc cây vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng.
Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi
trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở
nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào
HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO.
Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C.
Sau thời gian ủ, số cụm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng đƣợc đếm dƣới
kính hiển vi. Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất đƣợc tính theo công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) =

Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm
× 100%
Số colony đối chứng
[9,10]

5. Phƣơng pháp xử lý thống kê
Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thông kê bằng phần mềm MSTATC
của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ.

20


PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2

Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD

Nồng độ
(μg/ml)

Tỷ lệ ức chế phân bào (%)
Trypan blue

MTT
C

Clonogenic
C

0.1
1
5

18.72 ± 12.18
28.68 ± 23.76 C
72.89 ± 11.98 B

4.56 ±10.52
3.52 ±5.06 C
71.47 ± 16.86 B

21.98 ± 23.1 B
24.78 ±23.67B
95.72 ± 1.93 A

10
20

86.56 ± 10.51 AB
99.77 +0.68 A

78.68 ± 19.17 B
97.20 ± 2.7 A

100 ± 0.0 A
100 ±0.0 A

LSD ∞=0.01

17.73

13.74

18.89

Tỷ lệ ức chế(%)

Biểu đồ 1: Tác dộng của gossypol lên RD

Nồng độ gossypol (ug/ml)

Kết quả ở bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy gossypol có tác động lên sự phát triển của tế
bào RD.
Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào
sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue,

MTT và clonogenic.
Ở nồng độ 10-5μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua
tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không có
colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả

21


các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2
thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn 100% (khoảng
70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 5-10
μg/ml.
Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có
khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic
Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 là khoảng trên 20%.

Nồng độ
(μg/ml)

Tỷ lệ ức chế phân bào (%)
Trypan blue
D

MTT
0.00 ±4.88

Clonogenic
C

10.85 ± 16.48 B

0.1

0.00 ± 18.51

1
5
10
20

16.83 ± 11.41 C
63.30 ± 23.83 B
88.90 ± 5.35 A
98.70 ±3.11 A

0.00 ±6.81 C
72.14 ± 13.48 B
72.14 ± 10.02 B
89.10 ±8.62 A

21.23 ±26.00
84.65 ±11.5 A
100 ±0.0 A
100 ±0.0 A

LSD
∞=0.01

18.65

10.06

18.73

Tỷ lệ ức chế(%)

Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2

Nồng độ gossypol (ug/ml)

22