PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN LÚA

d
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
T
Ạ
O
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN
TH
Ơ
KHOA KHOA
H
Ọ
C
o&o
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN
CỐ
ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRÊN
LÚA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC
HIỆN
PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP LÊ HOÀNG
THĂNG
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT LỚP CÔNG NGHỆ SINH
HỌC
TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA
30
Năm
2008

LỜI CẢM
TẠ
-------------
eaae
-------------
Sau bốn năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ
và
được thực hiện đề tài tốt nghiệp, với sự hướng dẫn và động viên tận tình của
quý
Thầy, Cô và sự giúp đỡ của bạn bè, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt
nghiệp
đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, dù phải gặp rất nhiều khó khăn trở ngại.
Tôi
xin trân trọng cảm
ơn:
- Thầy PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Trưởng Bộ môn Vi Sinh
Vật,
Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần
Th
ơ
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên giúp đỡ tôi trong suốt
th
ờ
i
gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt
nghi
ệ
p.
- Thầy Thạc Sĩ Trần Nhân Dũng - Viện Nghiên Cứu và
PhátTtri

ể
n
Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ đã chỉ dẫn, giúp đỡ và hỗ
tr
ợ
dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt
nghi
ệ
p.
-
Cử nhân Phạm Thị Khánh Vân, Cử nhân Nguyễn Thị Phương
Tâm,
Trung tâ
c
m
án b
H
ộ
ọ
n
c
gh
l
iê
iệ
n
u
cứ
Đ
u,

H
Bộ
C
m
ầ
ôn
n
V
T
i
h
sin
ơ
h
@
vật,
T
Vi
à
ện
i
l
N
iệ
gh
u
iê
h
n
ọ

C
c
ứu
tậ
và
p
Ph
v
á
à
t T
n
ri
g
ển
h
C
iê
ô
n
ng
cứu
Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt
thời
gian tôi thực hiện đề tài tốt
nghiệp.
- Quý Thầy Cô Bộ Môn Sinh - Khoa Khoa Học, Viện Nghiên
C
ứ
u

và Phát Triển Công nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt
ki
ế
n
thức, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Nghiên Cứu
và
Phát Triển Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Cần
Thơ.
- Xin ghi ơn Cha mẹ và gia đình những người đã sinh thành,
nuôi
dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẽ những khó khăn cũng như tạo mọi điều
ki
ệ
n
tốt nhất giúp tôi học tập và thực hiện đề tài
này.
- Bạn Nguyễn Như Phương và Bùi Việt Sang lớp Công Nghệ
Sinh
Học Khóa 30, đã luôn động viên và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong
quá
trình thực hiện đề
tài.
LÊ HOÀNG
THĂNG
MỤC
LỤC
TÓM
LƯỢC...........................................................................................
Trang
1

ABSTRACT ........................................................................................... Trang
1
PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................... Trang
2
PHẦN II – LƯỢC KHẢO TÀI
LIỆU
I. Giới thiệu về cây
lúa
1. Oryza satival
L.
.............................................................. Trang
4
2. Oryza rufipogon Griff..................................................... Trang
4
3. Đặc điểm sinh trưởng của lúa. ........................................ Trang
4
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt
Nam.
.......................... Trang
4
II. Tầm quan trọng của đạm đối với
lúa
......................................... Trang
5
III. Sự cố định đạm sinh học ......................................................... Trang
6
IV. Vai trò của Azospirillum trong nông
nghi
ệ
p

1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum ................................... Trang
7
2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của
Azospirillum
. ........................................................................................... Trang
9
V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân
tử.
1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction).
.................Trang
10
2. Điện di agarose gel.
.......................................................Trang 11
PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG
PHÁP
I. Địa điểm và thời
gian.
1. Địa
điểm.
.......................................................................Trang
12
2. Thời
gian.
......................................................................Trang
12
II. Vật liệu thí nghiệm.
.................................................................Trang 12
III. Phương
ti

ệ
n
1.Phương tiện để phân lập vi
khuẩn.
..................................Trang
12
2.Phương tiện trích DNA, thực hiện phản ứng PCR, điện
di
..........................................................................................Trang 13
IV. Hóa
ch
ấ
t.
1. Hóa chất để phân lập vi khuẩn. ......................................Trang
13
2. Hóa chất nhuộm
Gram.
..................................................Trang
14
3. Hóa chất trích
DNA

.......................................................Trang 14
4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR. ................................Trang
15
5. Hóa chất điện
di.............................................................Trang 15
V. Phương
pháp.
1. Phân lập vi khuẩn

Azospirillum......................................Trang 15
2. Quan sát khả năng chuyển động của vi
khuẩn.
...............Trang
17
3. Nhuộm Gram.................................................................Trang
17
4. Đo kích thước tế bào vi khuẩn .......................................Trang
18
5. Trích nhanh DNA từ vi khuẩn Azospirillum...................Trang
19
6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân
l
ậ
p
bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). .......Trang
19
PHẦN IV – KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN
I. Kết quả phân lập vi khuẩn
Azospirillum
1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm
môi
Trung tâm Học liệu
t
Đ
rư
H
ờng
C

n
ầ
uô
n
i c
T
ấy
hơ
các
@
dòn
T
g
à
v
i
i
l
k
iệ
hu
u
ẩn
h
A
ọ
z
c
osp
tậ

iri
p
llu
v
m
à
đã
ng
ph
h
ân
iê
l
n
ập
cứu
đ
ượ
c.

...........................................................................
Trang
21
2. Màu sắc khuẩn lạc, màu môi trường, hình dạng và kích
th
ướ
c
của các dòng vi khuẩn đã phân lập được. .....................Trang
25
3. Một số đặc điểm của các dòng vi khuẩn

Azospirillum
đã phân
lập.
..................................................................Trang
28
II. Kết quả kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng
kỹ
thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction).
................................Trang
30
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ
NGHỊ
I. Kết luận
....................................................................................Trang 32
II. Đề
nghị....................................................................................Trang 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................Trang
33
DANH SÁCH
BẢNG
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn
đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang ..........................................Trang
23
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn
đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) ....................................Trang
24
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn

đã
phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt) ....................................Trang
25
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng
vi
khuẩn đã phân lập......................................................................Trang
26
Bảng 2. Màu môi trường, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các dòng
vi
khuẩn đã phân lập
(tt)
................................................................Trang
27
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào ............................Trang
28
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang
29
Bảng 3: Kết quả nhuộm Gram và đo hình dạng tế bào (tt).......................Trang
30
DANH SÁCH
HÌNH
Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) ..........................................Trang
12
Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên
lúa
....................................Trang
17
Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt
môi
trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi

trường
....Trang
21
Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb
đặc
làm thay đổi màu môi trường.....................................................Trang
22
Hình 5: Ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho
thấy
vi khuẩn Azospirillum bắt màu hồng khi nhuộm Gram ..............Trang
28
Hình 6 : Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Azospirillum với cặp mồi
chuyên
biệt Azospirillum lipoferum. ......................................................Trang
31
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
1
TÓM
L
ƯỢ
C
44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ lúa hoang, lúa mùa
và
lúa cao sản tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Các dòng vi

khuẩn
Azospirillum phân lập được có một số đặc tính giống như mô tả của các tác
giả
khác trước đây. Chúng có chung các đặc điểm: vi khuẩn Gram âm, chuyển
động
được, hình que ngắn hay que dài, que ngắn dính nhau thành cặp, khuẩn lạc
màu
trắng trong, xanh...Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt thiết kế
d
ự
a
trên gen nifH, chúng tôi nhận diện được 2 dòng vi khuẩn thuộc loài
Azospirillum
lipoferum là AR8 và
AR41.
Từ khóa: Azospirillum lipoferum, lúa hoang, PCR,
nifH.
ABSTRACT
Forty four strains of Azospirillum were isolated from the root system
of
Trung tâ
w
m
ild
H
ric
ọ
e
c
, w

l
i
i
n
ệ
te
u
r c
Đ
ro
H
p an
C
d
ầ
hi
n
gh
T
p
h
ro
ơ
duc
@
tivit
T
y
à
ric

i

e
li
i
ệ
n
u
som
h
e
ọ
p
c
ro
t
v
ậ
in
p
es
v
o
à
f th
n
e
g
M
h

e
i
k
ê
o
n
ng
cứu
Delta. These strains have some characteristics which are the same to
the
descriptions
of previous research. All of them are negative Gram, motile,
short
rods or long
rods, short rods in pair, white or blue colony... Using PCR
technique
with specific
primers of nifH gen, 2 strains AR8 and AR41 strains were
identified
Azospirillum
lipoferum.
Key words: Azospirillum lipoferum, wild rice, PCR,
nifH.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
2
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học

K.30
PHẦN I - ĐẶT VẤN
ĐỀ
Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản, là cây lương thực quan
trọng
cho khoảng 3 tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như
Vi
ệ
t
Nam. Năm 2007, sản lượng lúa thế giới đạt khoảng 645 triệu tấn
(International
Rice Research Institute (IRRI), 2007). Trong tình hình dân số thế giới đông
(h
ơ
n
6,6 tỷ người) ngày càng tăng như hiện nay, nhu cầu về lương thực là rất
quan
trọng. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới
tiếp
tục gia tăng trong vòng 20 năm tới, thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới
đáp
ứng cho nhu cầu sống còn của cư dân mới. Trong điều kiện eo hẹp đó, người
ta
phải suy nghĩ đến một chiến lược để tăng sản lượng lúa gạo. Một trong
những
chiến lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất
nông
nghiệp và qua đó, hi vọng sẽ đem lại cho thế giới một nguồn thực phẩm an
toàn
và có giá trị kinh tế

cao.
Ở Việt Nam, Đồng Bằng Sông Cửu Long được xem là vựa lúa lớn
nhất
của cả nước, cung cấp hơn 52% sản lượng lúa cả nước
(http:// w ww. o nthi.c o m/ly-
Trung
tâ
t
m
huy
H
et/
ọ
do
c
ng
l
-
i
b
ệ
a
u
ng-
Đ
so
H
ng-
C
cu

ầ
u-
n
lon
T
g
h
_4
ơ
71
@
.htm
T
l).
à
Đ
i
ể
li
c
ệ
u
u
ng
h
cấ
ọ
p
c
đủ

tậ
lư
p
ơn
v
g
à
thự
n
c
g
t
h
hì
iê
tă
n
ng
cứu
năng suất cây trồng là điều quan trọng vì diện tích đất canh tác không thể
m
ở
rộng thêm được mà ngày càng bị thu hẹp. Muốn đạt năng suất cao chúng ta
ph
ả
i
kiểm soát tốt các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ,
n
ướ
c,

phòng trừ sâu bệnh,…Trong đó việc bón phân được xem là nhân tố quan trọng
vì
nó quyết định năng suất cây trồng và mùa
vụ.
Đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây
trồng.
Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm
đáp
ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm
mà
cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ
mùa.
Để đạt được năng suất cao, nông dân phải dùng rất nhiều phân bón
hóa
học đặc biệt là đạm vì nó là nguồn dinh dưỡng chính giúp cây phát triển.
Đ
iều
này đã nảy sinh nhiều mối lo ngại. Hầu hết phân bón hóa học được sản xuất
theo
qui trình Haber - Borsch, cần rất nhiều khí tự nhiên, than hay xăng, tất cả
các
nguồn năng lượng này đều thuộc dạng tài nguyên không phục hồi được. Điều
này
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
3
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học

K.30
sẽ dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên thiên nhiên. Hơn nữa việc sản xuất
phân
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
3
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
bón sẽ sinh ra khí CO
2
là một trong những nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà
kính
(Shenoy và ctv,
2001).
Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50%
l
ượ
ng
phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa
và
bốc hơi ở dạng NH
3
, NO
x
, N
2
(Nguyễn Huy Phiêu, 2000). Bên cạnh đó, sự

l
ạ
m
dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai
ngày
càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây
nên
hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường
sống
của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv,
2001;
Huỳnh Thu Hòa, 2006). Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là
giải
pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo
ng
ạ
i.
Việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật,
đã
được nhiều nước trên thế giới quan tâm trong đó có Việt Nam, nhằm tạo ra
một
sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ
môi
trường hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền
vững.
Trung tâm H
Q
ọ
ua
c

n
l
h
iệ
iề
u
u n
Đ
gh
H
iên
C
c
ầ
ứu
n
,
d
T
ò
h
ng
ơ
vi
@
khu
T
ẩn
ài
Az

li
o
ệ
sp
u
iri
h
llu
ọ
m
c
c
t
ó
ập
khả
và
năn
n
g
g
c
h
ố
iê
đị
n
nh
cứu
đạm giúp tăng suất cây trồng đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu.

Dòng
Azospirillum với nhiều đặc điểm thuận lợi như: có khả năng cố định đạm tự
do
trong không khí, tổng hợp được các chất kích thích sinh trưởng làm hệ thống
r
ễ
phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon,
1985).
Việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng Azospirillum làm phân bón
trong
nông nghiệp là rất cần thiết, đặc biệt trên lúa nhằm thay thế một lượng đạm
hóa
học đáng kể cho cây, bảo vệ môi trường và góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng
đồng.
Đồng thời, gia tăng sản lượng lúa, tăng thu nhập cho người nông
dân.
¶
Mục tiêu đề
tài:
Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên cây
lúa.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
4
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
PHẦN II - LƯỢC KHẢO TÀI

LI
Ệ
U
I. Giới thiệu về cây
lúa
1. Oryza sativa
L.
Cỏ nhất niên, cao 0,5 - 1,7m. Lá có phiến dài, bìa hơi “cắt”, bẹ dài,
có
mép cao trắng, tai cong, có lông. Chùm tụ tán, dĩnh nhỏ, hoa 1, tiểu nhụy 6,
ch
ỉ
dài. Dĩnh quả (hạt gạo lức) dính chặt vào trấu (hạt lúa), 2n = 24 (Phạm
Hoàng
Hộ,
2000).
2. Oryza rufipogon Griff. (Lúa hoang hay lúa
ma).
Nê thực vật đa niên nổi, có thân nằm rồi đứng, dài 1,5 - 4m, thân to 4
-
6 mm, lóng dài 10cm. Lá có phiến dài vào 20cm, rộng vào 1cm, mép các lá
dưới
cao hơn 1,5 - 3cm, có rìa lông. Chùm tụ tán đứng cao 10 - 15cm, gié hoa,
nâu
nâu, dài 7 - 9,5mm, rộng 1,8 - 1,9mm, có lông gai dài đến 11cm, dĩnh mỏng,
cao
3mm (Phạm Hoàng Hộ,
2000).
Cây lúa hoang (Oryza rufipogon) mọc hoang ở các nơi đầm lầy,
hoặc

dọc
theo các kênh mương ở Đồng Tháp Mười, và các vùng nước sâu trung bình
ở
Trung tâ
c
m
ác t
H
ỉnh
ọ
C
c
ần
liệ
Th
u
ơ,
Đ
V
H
ĩnh
C
Lo
ầ
n
n
g, T
T
i
h

ền
ơ
G i
@
ang .
T
N
à
ă n
i
g
li
s
ệ
u
u
ất l
h
úa
ọ
r
c
ất
t
th
ậ
ấ
p
p,
v

kh
à
oả
n
ng
g
0
h
,2
iê
đ
n
ến
cứu
0,4 tấn/ ha. Ngày nay, khi các cánh đồng đã phủ kín lúa cao sản thì cây lúa
hoang
gần như bị tiêu diệt hết, vì vậy để bảo tồn nguồn gen quí này người ta đã
đư
a
giống lúa hoang sang viện lúa Quốc Tế IRRI để lưu trữ (http://www.
viettribune.
com /vt/
index.php?id=629).
3. Đặc điểm sinh trưởng của
lúa.
Thời gian sinh trưởng tính từ lúc nảy mầm cho đến lúc chín khoảng
90
đến 180 ngày, tùy theo giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ gieo
cấy.
Về mặt nông học có thể chia thành 3 thời kỳ: sinh trưởng dinh

d
ưỡ
ng
từ lúc nảy mầm; sinh trưởng sinh sản từ làm đòng đến trổ bông và thời kỳ chín
t
ừ
trổ bông đến thu hoạch. Nắm được qui luật sinh trưởng, phát triển của cây
lúa,
chúng ta có thể chủ động áp dụng các biện pháp kỹ thuật theo hướng có lợi
nhất
cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhằm tạo năng suất
cao.
4. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt
Nam.
Đối với Việt Nam cây lúa có vai trò quan trọng trong việc giải
quyết
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
5
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
nhu cầu lương thực cho nhân dân. Gắn liền với quá trình phát triển của lịch
s
ử
,
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp

Trang
6
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
cây lúa được coi là người bạn gần gũi nhất đối với đồng ruộng và người
nông
dân. Với tập quán canh tác và tiêu dùng lúa gạo, hàng năm lúa gạo đáp ứng
trên
80% nhu cầu lương thực của cả nước. Người ta thống kê được, sản lượng
lúa
vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng từ 9,5 triệu tấn (năm 1990) lên
19,2
triệu tấn (năm 2007)
(http://w w w.vietna m net . vn/kinhte/2006/ 1 0/622312/
và
http:
//www.
sgtt.com.vn/detail3.aspx?newsid=32713&fld=HTMG/2008/0410/32713).
Vụ lúa đông xuân năm 2008, tổng sản lượng toàn vùng Đồng
Bằng
Sông Cửu Long đạt 9,4 triệu tấn, tăng 300 ngàn tấn so với năm 2007. Tính
chung
cả nước thì vụ đông xuân năm 2008 này sản lượng lúa đạt 17,2 triệu tấn,
tăng
khoảng 200 ngàn tấn so với vụ trước
(http:// w w w 6 .thanhnien . co m .vn/Kin h te
/2008/4/27
/236353.tno).

Các số liệu trên cho thấy cần đánh giá lại một cách nghiêm túc vai
trò
của lúa gạo cả nước nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng để
đảm
bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia và ổn định lượng gạo xuất
khẩu.
II. Tầm quan trọng của đạm đối với
lúa.
Trung tâm
Học

Đ
li
ạ
ệ
m
u
là
Đ
m
H
ột c
C
hấ
ầ
t
n
có
T
va

h
i
ơ
trò

@
quan
T
t
à
rọ
i
ng
liệ
tro
u
ng
h
đ
ọ
ờ
c
i số
tậ
ng
p
th
v
ự
à

c v
n
ật
g
v
h
à
i
đ
ê
ộ
n
ng
cứu
vật. Đạm là cơ cấu của protein, nhất là của protein nhân, chiếm khoảng 2 -
4%
trọng lượng của chất khô, nó còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và
purine,
thành phần cấu trúc của một số vitamin nhóm B (B
1
, B
2
, B
6
,…) và các hợp
ch
ấ
t
khác (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn,
2004).

Đạm là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu đối với sự sống
tế
bào, là yếu tố giới hạn năng suất cây trồng (Shenoy và ctv, 2001). Bón phân
đạm
thúc đẩy quá trình tăng trưởng của cây trồng, giúp cây ra nhiều nhánh,
phân
cành, ra nhiều lá, lá có kích thước to giúp cây quang hợp mạnh. Do đó, khi
bón
phân đạm sẽ giúp gia tăng năng suất và chất lượng sản phẩm (Vũ Hữu
Yêm,
1995).
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2004) cây thiếu đạm
thường
sinh trưởng kém, diệp lục tố khó thành lập nên lá thường bị vàng úa, cây còi
cọc,
lùn, năng suất kém; số lá, số chồi, số nhánh ít, kích thước lá nhỏ. Thừa đạm lá
có
màu xanh đậm, kích thước lá tăng, nhất là về mặt diện tích lá; cây thường có
hệ
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
6
+
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30
thống rễ kém phát triển; lá mỏng, kém hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời,
d

ễ
bị côn trùng phá hoại, đồng thời dễ đổ ngã dẫn đến năng suất
gi
ả
m.
Đối với cây lúa, đạm là yếu tố rất quan trọng quyết định năng
su
ấ
t,
mùa vụ. Mất khoảng 1kg đạm để sản xuất 15 - 20kg lúa (Shenoy và ctv,
2001).
Trong cây lúa, đạm tập trung nhiều ở phiến lá hơn là các cơ quan khác và cũng
là
nguồn protein chủ yếu cho sự hình thành hạt, chính vì vậy đạm mang lại hiệu
qu
ả
cao trong thực tế sản xuất rõ hơn các yếu tố khoáng
khác.
Theo Nguyễn Huy Phiêu (2000), bình quân từ một ha đất lúa có
thể
huy động được 30 - 50kg đạm, nhưng một vụ lúa một ha đất mất đi tới
150kg
đạm. Nếu không bón đủ để bù đắp lượng dinh dưỡng lấy đi do nông phẩm
cũng
như thất thoát do rửa trôi thì không thể duy trì độ phì nhiêu và nâng cao
n
ă
ng
suất cây trồng được. Người ta dự đoán, nhu cầu phân đạm ở Việt Nam sẽ tăng
t

ừ
1.271.000 tấn (năm 2000) lên 1.627.000 tấn (năm 2010)
(htt p ://www.Fadina p .
org/vietnam/fertilizer.html).
III. Sự cố định đạm sinh
học.
Trung tâm
Học

K
li
h
ệ
í
u
qu
Đ
yể
H
n là
C
n
ầ
gu
n
ồn
T
d
h
ự

ơ
trữ
@
đạm
Tà
N
i
2
l
r
iệ
ất
u
lớ
h
n,
ọ
tr
c
on
t
g
ậ
k
p
ho
v
ả
à
ng

n
kh
g
ô
h
ng
iê
k
n
hí
cứu
bên trên mỗi km
2
đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ. Tuy nhiên, loại nitơ này
cây
trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi
thành
NO
3
−
hoặc khử thành NH
4
. Một số loài vi sinh vật có thể khử N
2
thành NH
3
và
được gọi là sự cố định đạm sinh học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn,
2004).
Sự cố định đạm sinh học có thể đạt được 175 triệu tấn mỗi năm

(http://w w w.
microbiologyprocedure.com/nitrogen-fixation/biological-nitrogen-fixation.htm).
Trong tự nhiên sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng
lớn
(khoảng 30 kg đạm/ha/vụ) cho cây trồng hấp thu khi mà phân đạm hóa học
ch
ỉ
được cây trồng sử dụng 30 - 40% (Boddy and Dobereiner,
1984).
Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của
enzyme
nitrogenase được xúc tác bởi năng lượng. Để thực hiện phản ứng này cần
cung
cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử
nit
ơ
.
Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là
protein
sắt và protein sắt - molybden. Nitrogenase không chỉ xúc tác việc khử N
2
thành
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
7
SVTH: Lê Hoàng
Thăng
Lớp: Công Nghệ Sinh Học
K.30

NH
3
mà còn có thể xúc tác việc khử C
2
H
2
, , HCN,…thành các sản phẩm
t
ươ
ng
ứng như: C
2
H
4
, CH
3
NH
2
… (Nguyễn Lân Dũng và ctv,
1997).
Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như
sau:
Nitrogenase
N
2
+ H
2
+ 6e
NH
3

NH
3
được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành
protein:
NH
3
+ Acid hữu cơ Acid amino
Protein
Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý
nghĩa
hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền
công
nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ
đi
ể
n
hình. Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có
th
ể
làm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ
trong
nông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng
khi
sự cộng sinh cung cấp nguồn đạm liên tục cho cây trồng
(http:// w ww.vinache m .
Trung
t
â
c
m

om.
H
vn
ọ
)
c
.
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên
cứu
IV. Vai trò của Azospirillum trong nông
nghiệp.
1. Sơ lược về vi khuẩn
Azospirillum
Năm 1974 lần đầu tiên người ta phân lập được một loài xoắn
khu
ẩ
n
sống trên rễ một số cây cỏ nhiệt đới và đặt tên là Spirillum lipoferum
(Döbereiner
và
cộng tác viên (ctv), 1987). Về sau căn cứ vào tỷ lệ các base trong ADN
người
ta
xác định chúng thuộc về một giống mới, được đặt tên là
Azospirillum
(Döbereiner
và ctv, 1995). Azospirillum có số lượng khá lớn ở vùng rễ và
trong
lớp tổ chức ở bề mặt rễ (khoảng 10
6

-10
7
tế bào/gram rễ khô) (Nguyễn Mỹ
Nhung
2007).
Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi
khu
ẩ
n
Azospirillum. Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết
hợp
với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa
n
ướ
c,
mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995). Saleeana và ctv (2002) đã tìm ra
nh
ữ
ng
loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum trong rễ lúa trồng ở Tamil Nadu, Ấn
Độ
.
Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi
khu
ẩ
n
Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ
đậ
u.
Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong

r
ễ
,
vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng
sinh
với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và
ctv,
1995).
Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được
phát
hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv,
1978);
Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum
halopraeferrans
(Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai
loài
còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được
Dekhil
và ctv tìm ra năm 1997. Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn
Gram
âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt
ở
30
0
C và pH từ 6,0 - 7,0 (Bashan và ctv, 2004). Azospirillum có thể chuyển
động
được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu
(polar
Trung tâ
f

m
lage
H
llu
ọ
m
c
) t
l
ế
iệ
bà
u
o
Đ
(Đ
H
ào T
C
h
ầ
an
n
h
H
T
o
h
àn
ơ

g,

@
2005
T
).
ài
liệu học tập và nghiên
cứu
Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2
đi
ề
u
kiện hiếu khí và kỵ khí. Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất
ở
điều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi
tr
ườ
ng
(Döbereiner và Pedrosa, 1987). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những
vi
khuẩn này là 35 - 37
0
C. Khuẩn lạc của chúng phát triển trên môi trường agar
-
khoai tây có màu hồng nhạt hay
đậm.
Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật
như
IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA

(Abscisic
acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990). Sự sản xuất hormone thực
v
ậ
t
của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ
đó
giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp
cây
chống chịu khô hạn. Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng
30%
lượng phân bón trong nông nghiệp
(http:/ / w w w.hinduonn r t.co m /thehind u /se ta
/2002/04/04/stories/2002040400120400.htm)
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
9
Để phát hiện loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum, người ta dùng
c
ặ
p
mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được
công
bố trên website ngân hàng gen để nhận diện chúng
(http://www . n cb i .nl m .
nih.gov/Genbank/index.html).
2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của
Azospirillum.
Thí ngiệm về tác động của các dòng Azospirillum lên năng suất

cây
trồng đã được tiến hành ở nhiều loài cây và các nơi trên thế
giới.
Năng suất mùa vụ đã tăng từ 3 - 54% khi được chủng Azospirillum
là
kết quả của 18 thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại Ý (Favilli và ctv,
1987).
Ngoài ra Azospirillum còn làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23 -
26%
(Paceres
và ctv, 1988), ở Argentina 13 - 30 % (Rodriguez - Caceres,
1982).
Thí nghiệm ngoài đồng trên lúa Miến cho thấy khi có chủng
giống
Azospirillum brasilense vào hạt lúa Miến (10
7
CFU/hạt) làm gia tăng năng suất
từ
10 - 15% (Okon và ctv,
1994).
Ủ hạt với vi khuẩn cho kết quả tốt hơn khi ủ với phân bón hóa học.
Ủ
Trung tâ
h
m
ột
l
H
úa
ọ

m
c
ạ
l
c
i
h
ệu
với
Đ
A
H
zos
C
pi
ầ
ril
n
lum
Th
liê
ơ
n
@
tục
k
T
h
à
oả

i
n
l
g
iệ
3
u
n
h
ăm
ọc
tại
tậ
IC
p
RI
v
S
à
AT
ng
ch
h
o
iê
th
n
ấy
cứu
chúng cố định được 26kg đạm/ha so với không ủ và lượng NPK chứa trong

cây
tăng 80 - 90% (Fages và ctv,
1994).
Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột
giống
với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả
là
vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và
khu
vực
khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994). Điều này được
giải
thích
như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp
cố
định
đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn,
gia
tăng
diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự
th
ẩ
m
thấu
nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan
và
Holguin,
1997; Boddey và ctv,
1986).
v

Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt
Nam
Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh
(nhóm
Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter...) cho thấy lúa có thể tăng
năng
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
10
suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg
đạ
m/ha.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
11
Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn
Vi
sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho
th
ấ
y
mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo
dài
(dưới 10
0
C). Lúa chín sớm hơn từ 3 - 5 ngày so với cây lúa không xử lý với
ch
ế

phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ,
2004).
Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi
khu
ẩ
n
cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0
-
428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân
với
nồng độ vi khuẩn 10
5
, 10
6
, 10
7
tế bào/ml, các chỉ tiêu nảy mầm, chiều dài rễ
và
thân mầm đều tăng so với đối chứng, ngoại trừ chỉ tiêu của rễ mầm ở nồng độ
10
7
tế
bào/ml.
Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân
l
ậ
p
được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây lúa. Riêng
Đ
ào

Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ
lúa
trồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31
là
Trung
tâ
A
m
zos
H
pir
ọ
il
c
lum
liệ
li
u
pof
Đ
er
H
um
C
có
ầ
n
n
gu
T

ồn
hơ
gốc
@
từ
T
thâ
à
n
i
,
l
r
i
ễ
ệ
l
u
úa
h
tr
ọ
ồn
c
g
t
(
ậ
lú
p

a c
v
a
à
o s
n
ản
g
)
h
v
i
à
ê
l
n
úa
cứu
hoang. Tác giả cho rằng nồng độ acid malic, nguồn carbon chính
cho
Azospirillum trong môi trường NFb, thích hợp nhất là
4g/lít.
Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum
phân
bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây
trồng,
thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm
thiểu
ô
nhiễm môi

trường.
V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân
t
ử
.
1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction).
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis
và
cộng tác viên phát minh năm 1985. Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của
ADN
polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các
ADN
polymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ
sung
vào mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động
của
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
12
ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn
chỉnh.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
11
P h ả n ứ n g PCR g ồm nhi ề u chu k ỳ , m ỗi chu k ỳ có 3 b
ư

ớ

c



:
- Bước 1: Biến tính (denaturation). Phân tử ADN được tách thành
2
sợi đơn ở nhiệt độ 94 - 95
0
C trong vòng 1
phút.
- Bước 2: Bắt cặp (anealing). Nhiệt độ được hạ thấp 49
0
C cho
phép
mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn này kéo dài 1
phút.
- Bước 3: Kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên đến
72
0
C
giúp cho ADN polymerase tổng hợp ADN, giai đoạn này kéo dài 1
phút.
Các ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp
cho
các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu
kỳ,
tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2

n
(với n là số chu kỳ nhiệt). Sản
phẩm
PCR sau đó sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di (Nguyễn Viết
Khuê,
2006).
2. Điện di agarose
gel.
Điện di là một quá trình mà các phân tử mang điện tích được tách
ra
trong
một điện trường do khả năng di chuyển khác nhau của các phân tử. Đây
là
Trung tâ
p
m
hươ
H
ng
ọ
p
c
há
l
p
iệ
th
u
ôn
Đ

g
H
dụn
C
g d
ầ
ù
n
ng
T
đ
h
ể
t
ơ
ách
@
rời
T
cá
à
c
i
đ
l
o
iệ
ạn
u
ac

h
id
ọ
n
c
uc
t
l
ậ
ei
p
c c
v
ó
à
kíc
n
h
g
th
h
ư
i
ớ
ê
c
n
từ
cứu
200bp đến 50kb (Võ Công Thành, 2004; Trần Thị Xuân Mai,

2005).
Trong điện di, người ta thường sử dụng thang ADN chuẩn
(ADN
ladder). Đó là hỗn hợp nhiều đoạn ADN có kích thước đã biết khi cho điện
di
cùng lúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn ADN của
mẫu.
Kỹ thuật điện di trên gel sẽ tách các phân tử ADN tùy theo kích
thước
của
chúng
(http://ww w .se m vn.net/sem/ m o d u les . ph p ?na m e= F o r u m s & f ile=view
topic&p=7).
Vận tốc và sự phân ly ADN phụ thuộc vào một số yếu tố sau:
kích
thước phân tử ADN, nồng độ gel agarose, kiến trúc ADN, cường độ điện
tr
ườ
ng,
chiều của điện trường, … (Trần Thị Xuân Mai,
2005).
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
12
PHẦN III - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG
PHÁP
I. Địa điểm và thời
gian.
1. Địa

đ
iểm.
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Phòng
thí
nghiệm Sinh Học Phân Tử - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ
Sinh
Học, Trường Đại Học Cần
Th
ơ
.
2. Thời
gian.
Từ tháng 02/2008 đến
06/2008.
II. Vật liệu thí
nghiệm.
- Lúa hoang (hình 1): mẫu được thu tại 2 địa điểm: Khoa
Nông
Nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ, đường Huỳnh Thúc Kháng - Thành Phố
C
ầ
n
Th
ơ
.
Lông
gai
Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon
Griff.)
- Lúa

trồng:
+ Giống lúa: Hàm Châu, Châu Hạng Võ, Miền Tây Lúa,
Cửu
Long 8 và IR 504 -
04.
+ Mẫu được thu tại một số địa điểm: Trà Vinh, Vĩnh Long,
H
ậ
u
Giang và thành phố Cần
Th
ơ
.
III. Phương
ti
ệ
n.
1. Phương tiện để phân lập vi
khuẩn.
- Cối chày, chai khử trùng mẫu, eppendorf 1,5
ml.
- Bình tam giác, đĩa Petri đường kính 10
cm.
- Máy khuấy (vortex), máy sấy,
cốc.
- Kính hiển vi Olympus, tủ ủ
Incucell.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang

13
- Tủ cấy vô trùng, que cấy, tủ lạnh, cân điện
t
ử
- Ống nghiệm nắp đen 15
ml
- Nồi khử trùng nhiệt ướt, máy đo
pH
-Xẻng (dùng để đào lúa), kéo, bọc nilon, đèn
cồn
- Lò vi sóng Panasonic, đũa thủy
tinh.
2. Phương tiện trích ADN, thực hiện phản ứng PCR, điện
di.
- Micropipet Bio -
Rad,
- Eppendorf 1,5 ml và 2,0
ml
- Bộ chạy điện di Embi -
Tec
- Máy PCR Bio -
Rad
- Máy chụp hình gel Bio - Rad UV
2000
- Tuýp chạy PCR 200
l
- Lò vi sóng
Panasonic
- Máy lắc (vortex), water
bath.

IV. Hóa
chất.
Trung tâm
H
1.
ọ
H
c
óa
liệ
ch
u
ất
Đ
để
H
ph
C
ân
ầ
l
n
ập
T
vi
h
k
ơ
hu
@

ẩn.
Tài liệu học
tập và nghiên
cứu
- Nước cất vô
trùng
- Tween 20
(1:20)
- Cồn
70
0
C
- Môi trường NFb (môi trường bán đặc và
đặ
c)
Công thức môi trường NFb đặc (g/l) (Kirchhof và ctv,
1997).
- Acid
malic 5
-
K
2
HPO
4
0,5
-
MgSO
4
.7H
2

0 0,2
-
NaCl 0,1
-
CaCl
2
0,02
-
KOH 4,5
- Dung dịch vi
l
ượ
ng 2ml
- Dung dịch
vitamine 1ml
- Dung dịch FeEDTA
1,64% 4ml
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp
Trang
14


- B ro m ot hy m ol b lue 0,5% tr o ng KOH 0 ,2M

2ml


CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu
Hiệp

Trang
15
- pH
6,8
- Agar 18g (môi trường đặc
)
- Agar 1,9g (môi trường bán đặc
)
Dung dịch vi
lượng:
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
1
MnSO
4
.H
2
O
1,5
H
2
BO
3
1,4
CuSO

4
0,4
ZnSO
4
.H
2
O
0,12
Thêm nước cất cho đủ
1000ml
Dung dịch
vitamine
Biotin
10mg
Pyridoxyl - HCl
20mg
Thêm nước cất cho đủ
100ml
- Trường hợp trữ ống thêm vào công thức môi trường
trên
Trung tâm Học liệu ĐH
KN
C
O
ầ
3
n Thơ @ Tài liệ
50
u
ml

h
/l
ọc tập và
nghiên
cứu
Dịch trích nấm men
5g/l
2. Hóa chất nhuộm
Gram.
- Crystal violet,
iod
- Fushin,
ethanol
- Nước
c
ấ
t
3. Hóa chất trích
ADN.
- Ethanol
70%
- Eppendorf 1,5ml và
2ml
-
Micropipet
- Tăm tre đầu
nhọn
- Môi trường LB (Lauria
Betan)
Công thức môi trường LB (Lauria Betan)

(g/l)
Trypton
10
Dịch trích nấm men
5g