BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (979 KB, 16 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH
VI SINH TRONG THỰC PHẨM
I. Giới thiệu
Ngộ độc thực phẩm ở các nƣớc đang phát triển hiện đang ở mức báo động. Đặc biệt tình
trạng ngộ độc tập thể đang ngày càng có xu hƣớng gia tăng.
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm, chiếm 55,8% trong số
đó là đến từ các loài vi sinh vật nhƣ Staphylococcus aureus, Coliform, E. Coli…
Chỉ tính riêng ở Việt Nam, hàng năm tổn thất do ngộ độc thực phẩm lên đến 30 tỷ đồng.
Nắm bắt đƣợc tình hình thực tế, trong tuần tháng 5 vừa qua ( từ 16/05 đến 21/05/2011)
khoa Sinh học đã tiến hành cho sinh viên thực nghiệm về các phƣơng pháp để kiểm định vi
sinh trong thực phẩm nhằm giúp sinh viên thực hành các phƣơng pháp kiểm định và gia
tăng kiến thức trong quá trình tiếp cận với các phƣơng pháp thực tế.
II. Mẫu thực phẩm
1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi
2. Ngày thu: 16/05/2011
3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV
III. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm:
TCVN 7046 : 2002 Thịt tƣơi- quy định kỹ thuật
IV. Kết quả kiểm định
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC)
1.1. Quy trình định lượng
VŨ THÙY LINH 0715174
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
1.2. Kết quả đếm khuẩn lạc
Độ pha loãng F
Số khuẩn lạc N ( CFU)
-4
10
>300
-5
10
>300
-6
10
323 và 358
1.3. Kết luận
- Kết quả: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu lớn hơn 3x106 CFU/g
VŨ THÙY LINH 0715174
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
1.4.
-
-
-
Kết luận: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép của
tiêu chuẩn Việt Nam (106 CFU/g)
Mở rộng
Phƣơng pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc là một phƣơng pháp khá phổ biến và đƣợc sử
dụng rộng rãi để định lƣợng vi sinh vật, cụ thể ở đây là định lƣợng vi sinh vật hiếu
khí có trong mẫu thực phẩm. Trong bài thực tập mẫu đƣợc tiến hành pha loãng lên
đến 10-4 , 10-5 , 10 -6 đƣợc xem là nồng độ tƣơng đối loãng để tiến hành nuôi cấy
trong môi trƣờng PCA. Kết quả khi đếm khuẩn lạc đều lớn hơn 300. Từ đó ta thấy
mẫu thịt tƣơi đã nhiễm rất nhiều vi sinh vật hiếu khí. Nhiều chủng loại khác nhau.
Về cơ bản thịt tƣơi là một thực phẩm khá dễ bị nhiễm vi sinh vật vì nó có đầy đủ
phẩm chất giúp vi sinh vật tồn tại và phát triển nhƣ t0, pH, độ nƣớc, thành phầm dinh
dƣỡng…Q trình nhiễm có thể do chế biến, gia nhiệt chƣa tới hạn, nhiễm từ các
dụng cụ chế biến, vật chứa hoặc từ khơng khí, đất.
Giải pháp: Cần giữ sạch sẽ trong quá trình chế biến thịt tƣơi. Không dùng các thiết bị
bẩn để đựng thịt, vùng chế biến phải thoáng, tránh xa cống rãnh hoặc vùng rác thải.
Xử lý sạch những phế phẩm không dùng đến. Quá trình bảo quản và vận chuyển phải
giữ nhiệt độ đúng theo yêu cầu để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng thịt tƣơi.
Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong mơi trƣờng PCA ở nồng độ 10-6
2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C)
2.1. Quy trình định lượng
VŨ THÙY LINH 0715174
3
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
2.2. Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi
Độ pha loãng F
Số khuẩn lạc N ( CFU)
-4
10
50 và 15
- Số đĩa pha loãng mỗi nồng độ: n= 2
VŨ THÙY LINH 0715174
4
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MƠN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
-
Thể tích cấy vào đĩa: V=1ml
Tỷ lệ xác nhận: R= số khuẩn lạc sinh hơi trong ống BGBL/tổng số khuẩn lạc đem đi
cấy=1 ( cả năm ống đều sinh hơi)
N
NxVxF
2.3.
2.4.
xR
C = 32,5 x 104 ( CFU/g)
Kết luận
- Coliform tổng số / g trong mẫu thịt tƣơi là 32,5 x 104 CFU/g
- Kết luận: Coliform tổng số trong 1(g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép theo TCVN
102 CFU
Mở rộng
- Môi trƣờng VRB không hấp vô trùng nhƣ những môi trƣờng khác, mà đƣợc cân
vơ trùng. Đun trong lị vi ba cho tan hết và giữ nhiệt ở 450C.
- Mơi trƣờng BGLB Mật bị bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn
gram và vi khuẩn gram– không phải Coliform. Brilliant green có nồng độ đặc
hiệu nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trƣởng ở 44 0C , Tránh đƣợc
hiện tƣợng dƣơng giả, lúc này Coliform phát triển làm đục mơi trƣờng và sinh khí
trong ống durham do lên men lactose.
- Vì đặc tính của nhóm Coliform là có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong
môi trƣờng ni cấy lỏng. Do đó trong q trình định lƣợng Coliform tổng số ta
sử dụng môi trƣờng BGBL để quan sát khả năng sinh hơi của Coliform từ đó
khẳng định có xuất hiện Coliform trong mẫu. Trong bài thực tập này kết quả cho
ta thấy 5 ống BGBL có cấy khuẩn lạc Coliform đều sinh hơi.
- Coliform có thể đƣợc xem là vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lƣợng của chúng hiện
diện trong mẫu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong
thực phẩm. Sự hiện diện Coliform trong mẫu thịt tƣơi là khá lớn điều đó có thể
cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong mẫu thịt tƣơi là khá
lớn.
- Khuẩn lạc có màu đỏ hoặc đỏ đậm do màu của môi trƣờng và thêm tủa quầng
muối mật có trong mơi trƣờng.
VŨ THÙY LINH 0715174
5
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MƠN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
Hình 2: Khuẩn lạc Coliform trong mơi trƣờng VRB
3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định
3.1. Quy trình định tính
VŨ THÙY LINH 0715174
6
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
3.2.
-
Kết luận
Kết quả: Phản ứng thử Indol dƣơng tính. Xuất hiện vịng màu hồng trên mặt dung
dịch.
Kết luận: Phát hiện E. Coli giả định trong 1(g) mẫu.
VŨ THÙY LINH 0715174
7
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
Mở rộng
Thuốc thử sử dụng trong phản ứng Indol là Kovac’s. Cơ chất chính tham gia phát
hiện Indol trong mơi trƣờng ni cấy là p-dimethyaminobanzaldehyde. Chất này
phản ứng với indol tạo thành phức hợp màu đỏ do nhân pyrol của indol phản ứng với
nhóm ahdehyde của DMAB tạo thành nhân quinone có màu đỏ.
- E.coli đƣợc xem nhƣ là vi sinh vật chỉ thị trong môi trƣờng ô nhiễm phân hay chất
thải. Ngƣời ta thƣờng xác định sự hiện diện của E.coli để kiểm tra xem mẫu thực
phẩm có bị nhiễm bẩn từ môi trƣờng hay thông qua nguồn nƣớc hay không.
4. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus
4.1. Quy trình định lượng
3.3.
-
VŨ THÙY LINH 0715174
8
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
4.2.
-
4.3.
4.4.
-
-
-
Kết quả
Độ pha loãng F
Số khuẩn lạc N (CFU)
-3
10
21 và 14
Số ống huyết tƣơng đông tụ 4
Tỷ lệ xác nhận: R= Số khuẩn lạc đông tụ huyết tƣơng/ tổng số khuẩn lạc cấy = 4/5
N
xR
NxVxF
C = 14 x 103 (CFU/g)
Kết luận
Staphylococcus aureus có trong 1 (g) mẫu là 14 x 103 CFU/g
Kết luận: Staphylococcus aureus trong 1 (g) mẫu vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép của
TCVN: 102 CFU/g
Mở rộng
Thành phần môi trƣờng BPA có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức chế các
quần thể vi khuẩn thƣờng hiện diện cùng Staphylococcus trong khi đó pyruvate và
glycine kích thích sự phát triển của Staphylococcus. Khuẩn lạc Staphylococcus có hai
đặc điểm: Khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành telurium, dạng lồi và tạo vịng
trong xung quanh khuẩn lạc,đƣờng kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein. Sau đó
có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong có tác động của lecithinase, một loại
lipase). Đây là một đặc tính thƣờng thấy và có tính chun biệt ở các tụ cầu khuẩn
gây bệnh.
Coagulase là enzyme đƣợc tạo bởi S.aureus, là enzyme liên quan đến khả năng bền
nhiệt, có thể bền đến 600C trong 30 phút. Enzyme này là một protein tự nhiên, đƣợc
S.aureus tiết ra ngoài tế bào, dễ bị bất hoạt bởi các protease. Coagulase đóng vai trị
đơng tụ huyết tƣơng, chúng kết hợp với các cấu tử trong huyết tƣơng thành từng khối
hay từng cục. Ứng dụng nguyên tắc này ngƣời ta sử dụng huyết tƣơng thỏ để tiến
hành phản ứng định lƣợng Staphylococcus aureus.
Sự hiện diện mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ của quá trình chế biến rất kém.
VŨ THÙY LINH 0715174
9
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MƠN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
Hình 3: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus
VŨ THÙY LINH 0715174
10
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu
5.1. Quy trình định tính
VŨ THÙY LINH 0715174
11
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
5.2.
Kết quả
Thử nghiệm KIA:
Đối chứng: Trên đỏ dƣới vàng, có vệt đen và nứt thạch
Mẫu: Không đổi màu môi trƣờng màu đỏ), không nứt thạch và không xuất hiện vệt
đen.
Thử nghiệm LDC:
Đối chứng: Mơi trƣờng LDC giữ ngun màu tím (+)
Mẫu: Mơi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+)
Thử nghiệm Manitol Phenol Red Broth:
Đối chứng: Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng (+)
Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ (-)
Thử nghiệm Urea Broth:
Đối chứng: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-)
Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-)
Thử nghiệm Canh Trypton:
Đối chứng: Khơng xuất hiện vịng màu hồng (-)
Mẫu: Khơng xuất hiện vịng màu hồng (-)
Kết luận: Khơng phát hiện Samonella trong 25 (g) mẫu.
Mở rộng
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động
không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose
và lactose, khơng sinh Indole, khơng phân giải ure, khơng có khả năng tách nhóm
amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể phân tích định
tính bằng mộ quy trình gồm 4 bƣớc: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.
Salmonella thƣờng có mặt trong mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng và cùng hiện diện
chung với một số lƣợng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính
cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trƣởng của Salmonella.
Vì trong mơi trƣờng KIA lƣợng đƣờng chỉ chiếm 1% lactose và 0,1% glucose và
thuốc thử phenol red. Do đó sau khi lên men glucose hết Samonella bắt đầu sử dụng đến
pepton trong mơi trƣờng, q trình trao đồi này làm giải phóng NH3, làm kiềm hóa mơi
trƣờng do đó phần nghiêng có màu đỏ. Ở phần sâu của mơi trƣờng có pH acid bởi sự lên
5.3.
VŨ THÙY LINH 0715174
12
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
men kỵ khí glucose, các sản phẩm thu đƣợc là acid hữu cơ, do đó làm cho mơi trƣờng
chuyển thành màu vàng.
Khi enzyme lisine decarboxylase tác động lên amino acid L- lisin và khử nhóm
carboxyl, chúng tạo thành một amin và CO2 làm kiềm hóa mơi trƣờng. Tiến hành thử phản
ứng LDC để xác định khả năng tổng hợp enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ
các acid amin. Nếu sau khi ni cấy mơi trƣờng chuyển màu vàng là âm tính, giữ nguyên
màu ban đầu là dƣơng tính. Từ kết quả trên ta có thể thấy Samonella là vi sinh vật có thể
tổng hợp nhóm enzyme khử nhóm carboxyl hoặc tách hydrogen từ acid amin khi mơi
trƣờng giữ ngun màu tím (+)
Vi khuẩn Samonella có khả năng lên men đƣờng manitol sinh acid khi có thuốc thử
phenol red sẽ làm mơi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng. Samonella có khả năng lên men
đƣờng manitol do đó mơi trƣờng ở ống đối chứng chuyển từ đỏ sang vàng.
Emzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào vi sinh vật. Khi có cơ chất
urea hiện diện trong môi trƣờng, enzyme này đƣợc tổng hợp và phóng thích ra bên ngồi tế
bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Sản phẩm sau phản ứng làm cho mơi trƣờng hóa kiềm
chuyển sang màu đỏ. Samonella khơng có khả năng sinh enzyme urease phân giải ure do đó
mơi trƣờng giữ ngun màu.
Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo
hợp chất indol. Sự tách amin từ tryptophan là một phản ứng khử. Qua quá trình này nhóm
amin đƣợc tách ra và chuyển thành NH3. DMAB trong mơi trƣờng ni cấy phản ứng với
indol tạo màu đị. Samonella khơng có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan vì vậy
khơng sinh indol. Phản ứng thử indol âm tính (-) khơng phát sinh vịng màu đỏ.
Hình 3: Hình dạng khuẩn lạc Samonella
VŨ THÙY LINH 0715174
13
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
Mục lục:
Giới thiệu ........................................................................................................................... 1
I.
II. Mẫu thực phẩm.................................................................................................................. 1
1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi.................................................................................................... 1
2. Ngày thu: 16/05/2011 .................................................................................................... 1
3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV............................................................................. 1
III.
Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: .............................................................................................. 1
IV.
Kết quả kiểm định .......................................................................................................... 1
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC) ................................ 1
1.1.
Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 1
1.2.
Kết quả đếm khuẩn lạc ............................................................................................ 2
1.3.
Kết luận ................................................................................................................... 2
1.4.
Mở rộng ................................................................................................................... 3
2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C)............................................................................ 3
2.1.
Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 3
2.2.
Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi .................................................................. 4
2.3.
Kết luận ................................................................................................................... 5
2.4.
Mở rộng ................................................................................................................... 5
3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định ............................................................... 6
3.1.
Quy trình định tính .................................................................................................. 6
3.2.
Kết luận ................................................................................................................... 7
VŨ THÙY LINH 0715174
14
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
3.3.
Mở rộng ................................................................................................................... 8
4. Quy trình định lƣợng Staphylococcus aureus ................................................................ 8
4.1.
Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 8
4.2.
Kết quả .................................................................................................................... 9
4.3.
Kết luận ................................................................................................................... 9
4.4.
Mở rộng ................................................................................................................... 9
5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu ........................................................................ 11
5.1.
Quy trình định tính ................................................................................................ 11
5.2.
Kết quả .................................................................................................................. 12
5.3.
Mở rộng ................................................................................................................. 12
VŨ THÙY LINH 0715174
15
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM
KHOA SINH HỌC
BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM
VŨ THÙY LINH 0715174
16
