SHIKONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN SHIKONIN TỪ CÂY LITHOSPERMUM ERYTHRORHIZON

Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 1

I.

Tổng quan tài liệu ................................................................................................................. 2

1.

Giới thiệu về hợp chất thứ cấp ......................................................................................... 2

2.

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật .................................................................................... 2

3.

Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật .................................................. 3

4.

Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp ........................................................................... 5

II.

Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon .................................... 7

1.

Giới thiệu Shikonin ............................................................................................................ 7

2.

Phương pháp nuôi cấy tế bào. ........................................................................................... 8

2.1.

Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ .................................................................................... 8

2.2.

Vi khuẩn Agrobacterium và cơ chế gây nhiễm của chúng trên thực vật. ............ 10

2.3.

Thu nhận hợp chất shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon được gây
nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes . ............................................................... 14

2.3.1.

Giới thiệu về phương pháp. ................................................................................. 14

2.3.2.

Nguyên liệu và phương pháp ............................................................................... 14

2.3.3.

Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 15

2.4.

Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết in
situ (tại chỗ) và cố định Calcium Alginate ............................................................................ 18

2.4.1.

Giới thiệu về phương pháp .................................................................................. 18

2.4.2.

Nguyên liệu và phương pháp. .............................................................................. 19

2.4.3.

Sự cố định và cảm ứng tạo Shikonin trong nuôi cấy tế bào thực vật .............. 19

2.4.4.

Phương pháp phân tích ........................................................................................ 19

2.4.5.

Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 20



Nhóm thực hành :
Nguyễn Thị Thanh Trúc mssv 60802410

Nguyễn Thị Thủy Tiên mssv 60802210




Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 2



SHIKONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN SHIKONIN TỪ
CÂY LITHOSPERMUM ERYTHRORHIZON

I. Tổng quan tài liệu
1. Giới thiệu về hợp chất thứ cấp
Sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo
vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật thường được hình thành với một
lượng nhỏ trong cây. Chúng được biết đến như là các hợp chất thứ cấp và thường
được dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm có giá trị . Những nghiên cứu về
các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50
của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba
nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid :
Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả
động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm:
codein, nicotine, caffeine và morphine.Một số loài thực vật có chứa nhiều alkaloid
như cây thuốc phiện,canh ki na,cà độc dược,thuốc lá,khoai tây.alkaloid có thể có
trong toàn cây hay chỉ tập trung ở bộ phận nào đó,như ở quả cây thuốc phiện,vỏ

cây canh ki na,rễ cây và độc dược....Các hoạt tính sinh học của nó có thể tác động
lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu hay bộ máy hô hấp của con người.
Với liều lượng lớn alkaloid thường độc nhưng liều lượng nhỏ chúng thường làm
dùng thuốc chữa bệnh.
Các tinh dầu :
Chứa hỗn hợp terpenoid,được sử dụng như chất mùi ,chất thơm và dung
môi.Chúng không tan trong nước.
Các glycoside:
Bao gồm các hợp chât phenol và flavonoid,saponin,và các cyanogenic
glycoside,một số dùng làm thuốc nhuộm,chất mùi thực phẩm và dược phẩm.

2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật này là tiềm năng để thu được các hợp chất có giá trị mà không thể sản
xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học.
Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong
thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu
thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 3

tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào
thực vật nuôi cấy .
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất
thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được
sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong
các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và
sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có
khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào

không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm
tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào
ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo
thành các chất thứ cấp (Lee 2001).
Nuôi cấy tế bào huyền phù :
Thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng
chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần
tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian
ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước
khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy
nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và
tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào
đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành
phần môi trường (Misawa, 1994).
Nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) :
Có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược
điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi
cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu
nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến
làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích
hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác
tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng.
3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Với sự tiến bộ không ngừng của ngành công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật đã giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và thu nhận được nhiều
hợp chất thứ cấp quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại
Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có
nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy
mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp .Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ

hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật.
Mục tiêu của kỹ thuật nuôi cấy tế bào :cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 4

sinh học


Ưu điểm :có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên
những lý do sau:
F Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các
yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng;
F Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong
tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)
F Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác
nhau
F Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá
trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên
cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào
huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm
protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999).
Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy tế bào
F Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp
F Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao,
F Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật
(Mulbagal and Tsay 2004).
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.
Các sản phẩm tích lũy có trong tế bào có thể cao hơn khi ta tối ưu các điều kiện

nuôi cấy.Nên việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đã được
nghiên cứu nhiều như các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi
trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc
khuấy, và ánh sáng. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có
thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao.
Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập.
Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong
nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này
đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên
(Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng
anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982).
Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có
khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin
đạt tới 1,2 g/L.
Cung cấp tiền chất (precursor feeding).
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 5

Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi
cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian
nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng
sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá
thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương
tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno
và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền
phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp
ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích

lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi
trong nuôi ấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004).
Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation).
Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ
chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu
việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ
máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được
các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử
dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc
của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy
tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi,
1985).


4. Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp
@ Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có
khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus
brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm
Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư
buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường
hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có ác dụng đối với
các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác

@ Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số
yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan
và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T.
baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu ản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao
2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc
thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền

Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 6

chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ
có khoảng 200 mg taxol.

@ Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền
phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu
năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến.
Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về
da. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản
phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14
ngày.Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp
imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng
nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn
carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò
của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi
trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh
trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi
trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất
hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng
tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương
thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.
@ Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù
của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách
thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết
lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-
Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp

diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2%
khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii
var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được
sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn
chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs
1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của
chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa
điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất
gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù
sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L
kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy
cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định
lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy.
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 7

@ Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus
cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài
loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu
quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus
S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá
ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển
nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích
HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối
lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng
cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu
được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59

mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).Podophyllotoxin là một aryltetralin
lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và
Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide
và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy
nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế
việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương
thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được
Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs
(1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcoholvà b-cyclodextrin bổ
sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung
phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên
0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor
chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông
báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3%
podophyllotoxin.








II. Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon


1. Giới thiệu Shikonin
Shikonin,được biết đến như một chất kháng khuẩn,chống viêm,chữa lành vết
thương và khối u hoạt động,nó trở thành cây thuốc đầu tiên được sản xuất với quy
mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.Shikonin có trong rễ của cây

Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 8

Lithospermum erythrorhizon. Cây này trồng 5-7 năm, chiết rễ lấy được 1-2% chất
khô, giá 1 kg là 4.500 USD. Nhu cầu tiêu thụ shikonin cao. Ở Nhật Bản phải nhập
thêm của Trung Quốc, Triều Tiên.
Một đoạn rễ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để làm bài thuốc nhân gian và
ngày nay được sử dụng làm thuốc mỡ chữa bỏng.Nó có công thức cấu tạo như
sau:








Chuỗi phản ứng tổng hợp một dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao từ shikonin




Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà
khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng
tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản
xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu
hoạchtới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin.
Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn

công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá
trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào
trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một
dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự
nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp
hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào



2. Phương pháp nuôi cấy tế bào.
2.1.Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ
Những vấn đề tồn tại trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết
thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ.
Cơ sở khoa học của giải pháp :
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 9

Việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế
bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào
trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh
trưởng của rễ hoạt động.Rễ tơ có thể được nuôi cấy trong môi trường không có
chất điều hòa sinh trưởng thực vật và có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp với một
sản lượng lớn hơn khi không chuyển plasmid Ri.
Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng
rất ổn định về di truyền, sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể
tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào
khá nhiều ưu điểm trong đó đáng kể là khả năng tránh nhiễm khuẩn.
Các công ty Nhật Bản đã sử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm,

loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn.
Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc
sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của
cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị
nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng
khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể sản
xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy
tùng.
Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất
toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được
xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin
bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào
taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng
hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn
gốc thực vật đang được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp
nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ.
Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác
giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống
ung thư. Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng
hợp để thu được một chất có cấu trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được
tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải. Công ty
dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng
bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản
xuất.
Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên


Trang 10

Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là

Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system)
nhằm chứng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản
xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6
ngăn (six-well polystyrene plates) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc
120 vòng/phút).
Merkli và cs. (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự
gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất
diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của
các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng
lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất-McCown’s woody plant
medium có 1% sucrose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8
tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của
cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Bổ sung
40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3
lần so với đối chứng.
Sevón và cs. (1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus
được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34
cây riêng rẽ đã trưởng thành. Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất
hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin, và điều đáng kể là đã tìm
thấy các biến dị dòng soma trong các cây này. Tuy nhiên, sự có mặt của các gen
rol (A, B và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong
các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ.
Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích
lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây
Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng
hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó,
các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion (
-
3
NO

,
-2
4
SO
,
-
42
POH
, K
+
, Ca
2+
và Mg
2+
) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine.
Nồng độ
-
3
NO
và K
+
cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao
nhất khi
-2
4
SO
và K
+
cao.

2.2.Vi khuẩn Agrobacterium và cơ chế gây nhiễm của chúng trên thực vật.
Agrobacterium là một loại vi khuẩn đất ,hiện nay đang được dùng rất nhiều
trong trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp.Các plasmid của Agrobacterium
có thể được sử dụng chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật hoặc dùng như một