79
Ch
ng IV
H TH NG CYTOCHROME-P450
VÀ TH C V T
VI SINH V T
4.1. H! th#ng Cyt-450 % n&m men và n&m s,i (Filamentous
Fungi)
4.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450
n m men và n m s i
S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b�
l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith. Cùng n�m
�ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�.
Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 �
��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous
fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít. Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�u
trúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong
Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là
Cyt-P450(14DM), lanosterol 14 – demethylase.
Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�p
th� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ã
cung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con
men. S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c
Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b�
nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�i
trong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào,
còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn. Tuy
nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt--P450 nh�t
��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b�
sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450. T�ng s� các Cyt-P450
trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n. Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��i
gia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��
80
Nguy�n Th� Ng�c Dao
�áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t
��nh. �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n
ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a
vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao.
- Kh� axít béo bão hòa
acyl CoA
NADH
fP1
C SF8
B5
- Kh� axít béo bão hòa
ergostadienol
- Kh� methyl c�a sterol
NADPH
fP2
P450s
- Kh� methyl
lanosterrol
c�a
Kh� bão hòa c�a
ergostadienol
- Oxy hóa các xenobiotic
Squalene epoxidate
Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng,
fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor
(y�u t� nh�y c�m v�i cyanide)
B ng 4.1. Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i
n�m men và n�m s�i
Ho t tính
P450
Phân b
14 -demethyl hoá các sterol
P45014D
H�u h�t vi sinh v�t
22 kh� bão hoà ergosterol
P45022DS
Có th� h�u h�t
Thu� phân kh�i mào các alkan
P450 alkan
N�m men tiêu th� Alkan
Thu� phân các axit béo
P450 alki,c
Candida tropical
Chuy�n hoá các xenobiotic
B
Saccharomyces cerevisiae
a
Schizoscc pombe
a
Candida tropical
a
Cunighamella elegan
a
Cunighamella baireiri
P450 hpha
Aspergillus sp.
P450RM
Rhodotorula minuta
T�o thành isobuten
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
Chuy�n hoá nitrat/nitrit
P450dNIR
Fusarium oxysporum
Demethyl hoá pisatin
P450(57)d
Nectria haematococca
Thu� phân m-cresol
a
Aspergillus parasitous.
Sinh t�ng h�p aflatoxin
a
Claviceps purpurea
Sinh t�ng ergot alkaloid
a
Thu� phân progesterone
a
Aspergillus
Ocraceousrhizopusnigricas
81
Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác
��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c
kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho
ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a
nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein
tương �ng chưa tách �ư�c
4.1.2. Cyt-P450 c a n m men
Cyt-P450(14DM) (Lanosterol 14 -demethylase)
Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S. cerevisiae và C.
albicans, trong �ó S. cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong
các lo�i n�m men. Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol
�� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân
b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá.
Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh
Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S. cerevisiae có TLPT 58.000 khi
�i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700).
D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng
thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm,
tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45. D�ng kh�- CO có b�ng
h�p th� � 447nm. Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�a
ferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I. S�
chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol,
m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn. B�ng cách s� d�ng s� bi�n
��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd
c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�p
ch�t này.
Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác như
pyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph�
��c trưng cho typ II. Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t
82
Nguy�n Th� Ng�c Dao
azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n
ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch�
Cyt-P45014DM.
Nh:ng thu;c tính xúc tác
Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4,
demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPHP450-reductase, O2 và NADPH (hình 4.2). Ph�n �ng này bao g�m
3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l�
chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có
s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32. H�ng s� Km
và Vmax c�a lanosterol 14 -demethylase c�a S. cerevisiae tái t�o
�ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�o
thành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng. Vì s� methyl
hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� �
trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác
nhi�u quá trình oxy hoá /phút. Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�n
h�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k =
20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s�
kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min-1. �i�u này
kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch�
s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh�. Lanosterol 14 demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14 , 24, 25
dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM). Vì không có
24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men
nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý. Thêm
vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�t
lanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không
b� chuy�n hóa. Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�i
cholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá
thu�c không �áng k�.
Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có
tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó
và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14 -demethylase.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
83
HO
Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác
b�i Cyt-P45014DM.
C&u trúc bEc 1
C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t�
nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S. cerevisiae, C.albican
và C.tropical. Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i
tr�ng lương phân t� là 60.700 (S. cerevisiae). Xem xét c�u trúc b�c
1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình
gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong
trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, CytP45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u Nt�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�. �áng chú ý là m�t
�o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng
�ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành
th�c ngo�i tr� methionin � ��u. M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này
v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh
là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n;
ví d�: - QR :::: RK - trong S. cerevisiae Cyt-P45014DM. �i�u �ó g�i
ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n
�ư�c cho là g�n màng. S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong
Cyt-P450alk. Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú.
Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho CytP450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có
khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Theo nghiên c�u c�a
Chen và cs. nh�ng Cyt-P45014DM t� S. cerevisiae và C.tropicals có
343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay
84
Nguy�n Th� Ng�c Dao
th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh. M�t trong
s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi
là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i.
�i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G
D)
trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân
t� S. cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a CytP45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI. Trình t� axit amin c�a CytP45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp
�ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam. S� d�ng máy tính có
thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�i
Vi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân
tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t�
Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này
(317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào
thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang
ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch. �i�u �ó g�i ý r�ng vùng
này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th�
bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng.
Cyt-P45014DM nh
n&m Azole
là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng
M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như
là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông
hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m. T�t c�
nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14 demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM.
S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol
và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào. Bi�n ��i trong s�
t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo
tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát
tri�n ho�c ch�t. Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân
azole kháng n�m. S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn
có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n ��
quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác
� nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch. M�c dù nh�ng d�n xu�t
azole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng
nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơ
c�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch�. Tuy
v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
85
��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c. Cơ s�
cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t
��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t�
tác nhân azole kháng n�m.
Cyt-P450(alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a
dMu hNa
Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu
hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol. Ph�n
�ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i Cyt-P450 khác �ư�c g�i là CytP450alk. Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�n
nh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y
trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp. ho�c nh�ng
t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan. CytP450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan
c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là
Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng. Genomic DNA
��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247.
C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alk
v�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như
là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs.
Tính không PQng nh&t phân tS
Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a
vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C. IAM maltosa
12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543
axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và
kho�ng 25% �ư�c b�o t�n. Sanglard và Fiechter phát hi�n gen
Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu �
trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ
enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk2 và Cyt-P450alk3, m�t cách tương �ng. Seghezzi và cs. công b� r�ng
gen Cyt-P450alk2 là m�t protein ch�a 522 axit amin. Kích thư�c
phân t� c�a Cyt-P450alk2 có th� so sánh v�i kích thư�c c�a
C.maltosa Cyt-P450alk. Sanglard và cs. xác ��nh r�ng TLPT trên
�i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn
�áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n trong S.
cerevisiae. Tuy nhiên, Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc
tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,
86
Nguy�n Th� Ng�c Dao
g�i ý r�ng Cyt-P450alk2 xúc tác s� th�y phân alkane. Tóm l�i, CytP450alk2 tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a
C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a
C.maltosa. �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals
bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau. Sanglard và cs g�i ý
r�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p
vì Cyt-P450alk và alk2 ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�m
s�c th�.
Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác
Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�t
nhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n
và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr�
methionin g�n � ��u. �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng
c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che
ch�n b�i các axit amin tích �i�n . Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t�
C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450
spin th�p. Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công
b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c
450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247. Phân tích
quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên
tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t�
ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�n
d�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane. M�c khác,
Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c
công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�i
hexadecane.
M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và NADPH-P450reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a
hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái
l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�p
c�a Cyt-P45014DM. M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là CytP450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và
chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c. Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơ
ch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�n
ph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�,
b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng. Cyt-P450alk1 �ư�c
dòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk2 t� ra có s� ��c hi�u
cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
87
M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn
hóa hXc
Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�t
gây ��t bi�n hóa h�c. M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t
hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S. cerevisiae. Cyt-P450 này (còn �ư�c
g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500. Cyt-P450 này th�
hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�i
Cyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên
liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol.
M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa
các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh
nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c. �áng
chú ý là hàm lư�ng Met. và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so
v�i nh�ng Cyt-P45014DM . Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a CytP450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407,
m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�u
trúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng.
M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU
tVo thành isobuten tY isovaleric acid.
Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i
phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u
khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene. Vì isobutene �ư�c t�o
thành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s�
�áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành
isobutence (H.4.7). M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào
R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s�
chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�a
NADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�n
tr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450.
Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit
isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta
�ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh. M�i
�ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�t
khi �i�n di. Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th�
hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�i
axit isovaleric. Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc
tác c�a nó.
88
Nguy�n Th� Ng�c Dao
Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã
�ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH.
Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�a
n�m men �ã �ư�c bi�t. Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là
không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ng
ch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u CytP450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không.
Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�t
màng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên. �i�u
này g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�c
tìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã
�ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này. S�
chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c CytP450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh�
carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa
liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14
�-lanosterol. Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho
m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450.
Cyt-P45022DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^
trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol
S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là
c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol. Ph�n �ng này �ư�c xúc
tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2 và b�
�c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men. Tuy nhiên, ph�n
�ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng CytP450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome.
Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o
ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ng
này �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t
�ư�c g�i là Cyt-P45022DS. Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�c
tách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa
�ư�c làm rõ.
4.1.3. Cyt-P450 c a n m s i (Filamentous Fungi)
Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum
Shoun và cs �ã công b� r�ng F. oxysporum ch�a Cyt-P450 c� �
microsome và phân �o�n hoà tan. �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
89
màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t
�o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có
th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite. Thêm n�a,
ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F.
oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t
ngo�i lai.
Cyt-P450 P ,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan
Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c
tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F. oxysporum. Hai s�n ph�m này h�u
h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng. TLPT bi�u ki�n
c�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000
và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng
trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y.
S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit
amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000. D�ng oxy
hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n �
��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm. ��nh h�p th� c�a h�n
h�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm. C�n ph�i làm rõ li�u
nh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các
cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng
m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào.
Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�i
laurate. M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th�
��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate. M�t khác,
ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh�
c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng
hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và
447nm (m�t cách tương �ng). Như v�y, không có m�t ch�ng minh
ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B.
SU thu` phân acid béo
Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F. oxysporum �ã chuy�n
hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3. S� tái
l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch�
c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�n
chuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450. Trên phân �o�n t� bào,
ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân
�o�n hoà tan. Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c
90
Nguy�n Th� Ng�c Dao
xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong
quá trình phân hu� t� bào. Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�t
tính này v�n chưa �ư�c xác ��nh.
Cyt-P450 hoà tan P ,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c
Nitrit
S� phát tri�n c�a F. oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và
m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�a
nh�ng t� bào này (b�ng 4.2).
B ng 4.2. S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit
trong F. oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs)
Nitơ vô cơ
thêm vào
( 0,2%)
NO
NaNO3
NaNO2
NH4CL
NaNO3
NaNO2
S�c khí
th�p
th�p
th�p
th�p
cao
cao
Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein)
Phân �o�n tan
Phân �o�n microsome
Kph
0,288
0,685
0,0035
0,013
kph
0,085
0,075
0,103
0,11
0,014
0,012
Chú thích: kph = không phát hi�n
Vì s� c�m �ng t�ng h�p là ít �ư�c quan sát � Cyt-P450
microsomal dư�i �i�u ki�n này, nên Cyt-P450 �ư�c t�o ra �ã
�ư�c coi là hoàn toàn n�m trong phân �o�n hoà tan. M�i �ây,
Kizawa và cs �ã tách chi�t m�t dòng cDNA, �o�n này �ư�c
cho là có mang trình t� mã hoá c�a Cyt-P450. cDNA này
(CYP55) mã hoá cho m�t protein Cyt-P450 ch�a 403 axit
amin và không có búi k� nư�c ��i v�i m�t �o�n liên k�t
màng �ã �ư�c tìm th�y trong trình t�. Như v�y, Cyt-P450 mã
hoá b�i gen này là tương t� v�i m�t protein hoà tan. S� kích
thích t�ng h�p d� thư�ng và s� ��nh v� c�a Cyt-P450 này
dư�ng như �ư�c d� �oán trư�c v� ch�c n�ng duy nh�t c�a nó.
Shoun và các cs th�y r�ng ho�t tính kh� nitrit không tương t�
�ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450
hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�t
tính xúc tác trên.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
91
Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450
cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14
trong sinh tbng h,p sterol
Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và
��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men,
�c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s�
14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia
vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i. S� dư th�a
sterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng
tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít
lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro
lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i. �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơ
ch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng
trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i.
SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p
Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng
h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid
�ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p CytP450 b�i Phenobarbital. B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�c
hi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin
b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý.
Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a
Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a
m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�c
t�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin
�ư�c t�o ra b�i n�m này. Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous
Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các
ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng.
M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin:
Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là
Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá
c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin. Pisatin là m�t ch�t ��c do
n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay
t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn. Ho�t
tính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong
nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao
(20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin
92
Nguy�n Th� Ng�c Dao
�ư�c coi là th�p (<5�M). Theo �ó, s� kh� ��c c�a pisatin �ư�c
coi là ch�c n�ng n�i t�i c�a Cyt-P450 này và s� t�ng h�p c�a nó
là m�t cơ ch� t� v� sinh h�c �� ch�ng l�i h�p ch�t kháng khu�n.
M�t gen (CYP57) mã hoá cho Cyt-P450 này �ã �ư�c dòng hoá
và ��c trình t�.
SU chuy[n hoá các ch&t lV
Ho�t tính Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) �ã �ư�c th�y
trong Cunning hamella elegans, C. bainierit và Asp. Ochraceus TS.
Ho�t tính AHH c�a nh�ng n�m này �ã �ư�c kích thích t�ng h�p
b�i m�t s� arylhydrocarbon (hydrocacbon nhi�u vòng nhân thơm),
b� �c ch� b�i nh�ng ch�t �c ch� ��c hi�u Cyt-P450 như là CO và
SKF 525 A và ��nh v� trong phân �o�n microsomal. Cerniglia và
Gibson �ã ti�n hành phân tích ��u tiên nh�ng phân t� t�
benzo[a]pyrence do AHH xúc tác c�a C.elegans và ch� ra r�ng
AHH c�a n�m cho ra cùng m�t s�n ph�m như là s�n ph�m �ư�c t�o
thành b�i enzyme t� ��ng v�t có vú. M�i �ây, m�t gene c�a CytP450 �áp �ng cho s� chuy�n hóa c�a benzo[a]pyrence �ã �ư�c xác
��nh trong Asp.niger và �ư�c g�i là CYP53. Các microsomes c�a A.
ocraceus TS và Rhizopus nigrican �ã �ư�c công b� là có ho�t tính
thu� phân 11�- progesterone và ho�t tính này �ư�c coi là ph� thu�c
vào Cyt-P450 d�a trên s� nh�y c�m c�a nó ��i v�i m�t s� ch�t �c
ch� Cyt-P450 ��c hi�u.
Chloride peroxidase (chloro peroxidase) không phei là m;t
thành viên cHa các Cyt-P450
Chloride peroxidase [EC.1.11.1.10] là m�t glycohemoprotein có
m�t protoheme g�n v�i thiolate như là nhóm ngo�i �ư�c t�o ra b�i
Caldariomyces fumago,là m�t enzyme ngo�i bào. C�u trúc
ligand và k�t qu� ��c trưng quang ph� phân t� enzyme này là r�t
gi�ng v�i c�a các Cyt-P450. Tuy nhiên, c�u trúc protein c�a nó
khác rõ r�t v�i c�a các Cyt-P450, dòng hoá cDNA và phân tích
trình t� cho th�y r�ng apoprotein c�a Chloride peroxidase ch�a 321
axit amin v�i TLPT 35.202 và không tìm th�y s� tương ��ng gi�a
c�u trúc b�c 1 c�a nó v�i c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450S. TLPT
bi�u ki�n c�a enzyme này �ã �ư�c xác ��nh là 42.000 v�i 25 – 30%
carbonhydrate. Như v�y, Chloride peroxidase không �ư�c x�p vào
siêu gia �ình Cyt-P450 m�c dù thu�c tính quang ph� là tương t� v�i
các enzyme này.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
93
4.1.4. +i,u hoà s- t.ng h p Cyt-P450 b i vi khu1n nhân th-c
Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào
�i�u ki�n phát tri�n. Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t
��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng
�i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong
vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau.
Cyt-P450alk c�a Candida sp. �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c
hi�u b�i n-alkane. Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng
s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen
P450alk b�i n-alkane. S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane
không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát
tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose
c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk.
S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�u
c�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác. Cyt-P450 t�o
thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i
phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N.
haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó. S�
thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng
h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F. oxysporum. S� t�ng h�p c�m
�ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung
thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph�
thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i.
M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng
O2 th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y. Vì n�ng
�� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�a
n�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nh
hư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này. Liên quan v�i �i�u này là
nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh
t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�y
c�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450. Như mô t� trong chương
5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh�
n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoà
bi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng. Các
Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao
trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp
�ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�t
cho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng. Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u
94
Nguy�n Th� Ng�c Dao
hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là
m�t ��c trưng quan tr�ng. Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�u
hoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan
tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450
monooxygenase trong th� nhân th�t.
4.2. Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn
4.2.1. Nh4ng enzyme Cyt-P450 c a vi khu1n: Cyt-P450cam
Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ
nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1).
4.2.2. Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam
N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas
putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�a
Camphor như là ngu�n carbon duy nh�t. S� oxy hoá Camphor �ư�c
b�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ng
monooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh�. H�
th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3
enzyme tham gia là:
a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT
45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A.
b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT
11,418) mã hoá b�i gen Cam B.
c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538;
414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C. S� t�o thành tính enzyme
c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng
Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s�
chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol.
Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra
2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase
(MW: 38,377; 361 axit amin). Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor
�ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate.
T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng
ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�c
g�i là CAM. 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã
�ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor. Nh�ng gen
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
95
này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di
truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�t
búi gen và t�o thành Cam operon. Cam R, m�t gen �i�u hoà âm,
��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�p
v�i Cam operon.
Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơn
phân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra
m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB. Ch�t
kìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i
nó khi có m�t Camphor.
Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t�
��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó. Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�p
khác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng
bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng
h�p có tính enzyme .
Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam
D và Cam R. RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi
�y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT). Gen
�i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng)
trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�a
Cam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator
này in vitro. V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine
-Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D,
AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B. Mã
kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A. M�t c�u
trúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và
m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các
gen A và B.
M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã
�ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th�
�ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi
c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này.
4.2.3. C u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam
Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P. putida �ó là m�t trong nh�ng
h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�a
Cyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�t
lư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá. Nh�ng
96
Nguy�n Th� Ng�c Dao
nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam,
không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng
các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này. (xem Chương 2).
4.2.4. M:i liên quan gi4a c u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam
Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái
c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v�
trí ��c hi�u ��i v�i protein này. Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ã
thành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và
c�a nh�ng Cyt-P450 khác. Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�u
hơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�t
tinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh.
�� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�n
không th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�c
hi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i
hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng
t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th�
m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein CytP450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và
PdR.
Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và
cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu
� trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng
cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem.
K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�i
dithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�u
ki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành
m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�a
P450cam. Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính
Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin Odealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�t
ho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t.
R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơ
ch�t. Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và
F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�t
tính th� hai l�i r�t cao (250%). Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có
th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n
��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
97
g;t biWn enh h %ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd
(putidaredoxin)
Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác,
nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình
thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�i
enzyme t� nhiên). Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2
và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme
��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i.
K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C
protein t� Pd �ã b� khóa l�i. B�ng phân tích stopped flow s� d�ng
Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c
�� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c ��
phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là
40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5.
Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��n
enzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính
enzyme. Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng
safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p
�áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV).
Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2( 2) c�a guanidin và = NH( )
c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�t
hình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2( 1) khác c�a các
d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�a
nhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s�
chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này
có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd
d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�i
vi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh�. Th�c ra, nhóm c�a
Sligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như
là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò
quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd. Ngư�i ta
c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�a
gia �ình Cyt-P450. Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên,
g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t�
n�i phân t� ��n s�t hem.
S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs
�ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463),
m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có
98
Nguy�n Th� Ng�c Dao
th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase
c�a nó. Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136)
c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam,
m�t cách tương �ng.
g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen
M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm
(Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t�
oxygen. Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình
thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t�
Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi
angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương
�ng. M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t,
phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng
g�c acid amin � vùng này. Trong s� nh�ng g�c không phân c�c,
Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch�
y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450. Thr 252 h�u như
không bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�t
cho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�n
hóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase. Thr 252 �ã bi�n
��i thành A, V ho�c S. T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có
m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�t
v�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous,
oxygen hóa và CO-ferrous.
Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu
th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�a
enzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor
�ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i.
Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy
peroxide. Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng
enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính
monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i.
Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính
toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là
không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�p
peroxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b�
kh�. 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�t
tính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i. Như
v�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
99
�ôi liên k�t O-O c�a O2 trong ph�n �ng oxygenase. Nh�ng nghiên
c�u gây ��t bi�n các v� trí c�a Cyt-P450 cam có th� xem thêm trong
Chương I và Chương II � cu�n sách này.
Nh:ng P;t biWn % liên kWt c ch&t
Dùng phương pháp phân tích c�u trúc tinh th� tia X, ngư�i ta �ã
ti�n hành quan sát các v� trí axit amin b� bi�n ��i � các v� trí như t�o
ra các protein v�i Y96F, V247A, V295I, R186H, D251N, T101,
I209L… so sánh ho�t tính enzyme bi�n ��i v�i typ d�i �� rút ra
nh�n xét v� vai trò c�a các axit amin này trong s� liên k�t v�i cơ
ch�t. Bư�c ��u nh�n th�y vai trò thi�t y�u c�a các axit amin � các v�
trí như 117, 209, 365. Ngư�i ta c�ng nh�n th�y là �� �áp �ng cho
nhi�u cơ ch�t khác nhau, các axit amin tham gia vào s� liên k�t c�a
cơ ch�t thư�ng n�m � các v� trí trong vùng “m�m d�o” có kh� n�ng
bi�n ��i cao.
4.2.5. Nh4ng h< th:ng Cyt-P450
các vi khu1n khác
SU thu` phân axit béo: P450(BM-1), P450(BM-2) và P450(BM-3)
Bacillus megaterium ATCC 14581 �ư�c bi�t là có ch�a CytP450 th�y phân axit béo. Fluco và cs s� d�ng ch�t chi�t không có t�
bào c�a vi khu�n �ã phát hi�n Cyt-P450 th�y phân axit béo hòa tan,
enzyme này xúc tác s� th�y phân �1, �2 và �3 c�a các acid béo
bão hòa, các alcohol và các amide. Enzyme �òi h�i m�t cách tuy�t
��i NADPH như là ch�t cho �i�n t�. S� th�y phân nhóm methyl t�n
cùng, �-1, �ã �ư�c quan sát. �i�u này ngư�c v�i Cyt-P450 th�y
phân acid béo � � ��ng v�t có vú, enzyme này c�ng th�y phân �-1.
Các enzyme th�y phân acid béo này là m�t h�n h�p c�a 3 CytP450 khác nhau, �ó là Cyt-P450 1, -2, và -3. Nhóm c�a Fluco �ã
tinh ch� Cyt-P450(BM)này. Cyt-P450(BM-1) tinh khi�t t� nó không có
ho�t tính monooxygenase � m�c có th� phát hi�n �ư�c trong h�
th�ng thí nghi�m chu�n ch�a NADPH v�i ho�c là myristate ho�c
palmitoleate làm cơ ch�t. Tuy v�y, Cyt-P450(BM-1) xúc tác c� hai s�
th�y phân epoxidation và hydroxylation c�a palmitoleate b�ng cách
s� d�ng iodosyl benzene- diacetate, ch�t này �ư�c bi�t là m�t ch�t
th� ph�, nó h� tr� s� th�y phân steroid và acid béo b�i m�t s� bi�n
��i c�a các lo�i Cyt-P450 khi không có NADPH, O2, ho�c các c�u
t� reductase / redoxin. M�i �ây, Fluco và cs �ã tách dòng gen CytP450(BM-1) t� DNA nhi�m s�c th� c�a B.megaterim ATCC 14581
DNA. Khung ��c m� mã hóa Cyt-P450(BM-1) mang 410 axit amin
100
Nguy�n Th� Ng�c Dao
v�i TLPT là 47,439.Trình t� axit amin c�a Cyt-P450BM1 tương t�
nhi�u v�i nh�ng Cyt-P450cam hơn là v�i b�t c� eukaryotes CytP450 nào và gen c�a nó khác rõ r�t v�i gen c�a Cyt-P450(BM-3).
Cyt- P450(BM-2) �ã �ư�c tách ra như là m�t c�u t� nh� hơn t�
Cyt-P450(BM-3) trong quá trình tinh ch� Cyt-P450(BM-1). CytP450(BM-2) �ã tinh ch� có kh�i lư�ng phân t� kho�ng 46 kDa và d�
nhiên b�n thân nó không bi�u hi�n ho�t tính th�y phân axit béo
trong h� th�ng thí nghi�m ch�a NADPH. Ngư�i ta còn bi�t ít v�
Cyt-P450(BM-2).
Cyt-P450(BM-3) th� 3 (là ch� y�u) có ��c trưng r�t thú v� có liên
quan t�i c�u trúc và kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng.
C� BM-1 và BM-2 ��u có th� �ư�c kích thích t�ng h�p nhi�u
hơn 100 l�n b�i phenobarbital và nhi�u barbiturat khác. �ây là
trư�ng h�p ��u tiên �ư�c bi�t c�a monooxygenase ph� thu�c CytP450 �ư�c t�ng h�p b�ng barbiturat trong prokaryotes. Khi có m�t
NADPH và O2, BM-3 xúc tác s� th�y phân �-2 c�a axit béo bão
hòa, alcohols và amines và s� th�y phân c�ng như epoxi hóa axit
béo có m�t liên k�t không bão hòa như là axit palmitic. ��c trưng
khác duy nh�t c�a Cyt-P450(BM-3) là ��c tính �ã �ư�c t�o ra b�i m�t
polypeptid �ơn l� (MW: 119. 000) và có ho�t tính xúc tác ��c l�p.
Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 có th� xúc tác s� oxygen hóa axit
béo mà không c�n thêm b�t c� protein nào khác, và có ho�t tính xúc
tác kho�ng 4.600nmol acid béo �ư�c thu� phân/nmol P450, làm cho
nó tr� thành Cyt-P450 monooxygenase ho�t ��ng nh�t �ư�c công
b� cho t�i nay. Ho�t tính cao c�a protein có th� �ư�c mô t� c�n c�
vào n�ng �� c�a nó là 1 mole FAD và FMN/mole heme và vai trò
c�a Cyt-P450 NADPH-reductase và Cyt-P450 trên s�i peptid �ơn.
Cyt-P450(BM-3) �ư�c tiêu hoá h�n ch� b�ng trypsin d�n t�i 2 �o�n
polypeptid kho�ng 66.000 và 55.000 Da, �o�n th� nh�t �ư�c t�o ra
t� ��u C t�n c�a Cyt-P450(BM-3) ch�a c� FAD và FMN nhưng không
có hem và �o�n sau �ư�c xác ��nh là ch�a hem và có kh� n�ng g�n
v�i acid béo. Protein 55 kDa d�ng b� kh� g�n CO th� hi�n m�t peak
� 446 nm ��c hi�u cho Cyt-P450.
Cu�i cùng, Fulco và cs �ã thành công trong vi�c tách dòng gen
Cyt-P450(BM-3) nguyên v�n và �ã xác ��nh trình t� axit amin ��y ��
c�a nó. S� li�u v� trình t� d� ki�n là 1048 g�c axit amin v�i TLPT
là 117,641. Trình t� axit amin c�a �o�n Cyt-P450 có m�t � vùng Nt�n c�a Cyt-P450(BM-3) là tương t� nhi�u hơn (kho�ng 25%) v�i
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
101
trình t� c�a Cyt-P450cam. �o�n có NADPH – Cyt-P450- Reductase
có kho�ng 33% trình t� gi�ng v�i trình t� c�a gen Cyt-P450 ��ng
v�t có vú.
S� d�ng m�t plasmid tái t� h�p mang gen mã hóa Cyt-P450(BM-3),
Boddupalli và cs �ã bi�u hi�n Cyt-P450(BM-3) trong E.coli �� t�o ra
kho�ng 20% protein hòa tan hoàn toàn và Cyt-P450(BM-3) tinh s�ch.
S� t�ng h�p Cyt- P450(BM-3) ti�n hành v�i ��i ch�ng dương tham
gia vào ít nh�t 2 vùng �i�u hòa (R1 và R2) cái này b�ng qua kho�ng
1 Kb c�a vùng 5'-flanking c�a gen v�i vùng gen tương tác v�i
protein ho�t ��ng v� trí trans.
Steroid Hydroxylase (15-j): Cyt-P450meg
Gustafson và cs �ã xác ��nh r�ng Steroid hydroxylase c�a d�ch
chi�t vô bào c�a ch�ng B.megatermin ATCC 13368 là Cyt- P450
ch� th�y phân 3-oxo-�4-steroids (như là progestesone) � v� trí 15�.
Cyt-P450meg này �ã �ư�c tinh ch� hoàn toàn và TLPT là 52kDa �ã
�ư�c tính toán cho hemoprotein này. 15�-Steroid Hydroxylase �òi
h�i 3 c�u t� cho ho�t ��ng xúc tác: 1 Flavoprotein ch�a NADPH
ph� thu�c FMN (megaredoxin reductase), 1 protein Fe-S
(megaredoxin) và Cyt P450meg. �� tìm ki�m các ch�t kích thích
t�ng h�p, m�t s� lo�i như steroids, phenobarbital, axit béo… �ã
�ư�c kh�o sát nhưng chưa có ch�t nào có kh� n�ng kích thích t�ng
h�p Cyt P450meg.
M�t �i�u thú v� là c� megaredoxin và metochondrial
adrenodoxin (t� ti th� tuy�n thư�ng th�n) cùng bi�u hi�n ho�t tính
chéo trong h� th�ng khác nhau và r�ng megaredoxin reductase có
th� �ư�c thay th� b�ng adrenodoxin reductase ho�c NADPH-Cyt
P450- Reductase t� microsome gan th�. Ví d�, megaredoxin
reductase cho �i�n t� ��n Cyt P45011� và Cyt-P450LM-3 microsome
gan th�, ch�ng t� r�ng chu�i v�n chuy�n �i�n t� c�a h� th�ng th�y
phân steroid trong B.megatermin ��c hi�u không cao, ngo�i tr� c�u
t� terminal Cyt-P450.
Alkane Hydroxylase
Có hai loài vi sinh v�t s�n xu�t ra Alkane Hydroxylase ph�
thu�c Cyt-P450 �ã �ư�c bi�t cho ��n nay. M�t là Rhodococcus
rhodochrous ATCC 19067, �ã �ư�c x�p lo�i là Coryne bacterium,
loài th� 2 là Acinetobacter calcoaceticus.
Cardini và Jurtshuk �ã tìm th�y m�t Hydroxylase n-octan ph�
thu�c vào Cyt-P450 t� rhodochrous m�c trong môi trư�ng ch�a n-
102
Nguy�n Th� Ng�c Dao
octane như là ngu�n carbon duy nh�t cho s� phát tri�n. Ho�t tính
th�y phân �ư�c t�o ra b�i n-octane là 6 l�n cao hơn so v�i ch�t kích
thích t�ng h�p là acetate. D�ch chi�t vô bào t� nh�ng t� bào b� phá
v� b�i siêu âm �ã th�y phân n-octane �� t�o ra 1-octanol như là m�t
s�n ph�m duy nh�t trong s� có m�t c�a NADPH, O2 và 1 phân �o�n
riêng bi�t có s� kh� ��c hi�u th� hi�n quang ph� phân bi�t v�i CO
xác ��nh r�ng h� th�ng này là 1�-Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450.
H� th�ng th�y phân c�a R.rhodochrous �ư�c �ưa ra g�m m�t
NADPH- Cyt P450- Reductase. (1 FAD-FMN protein) và m�t CytPP450 tương t� như h� th�ng � microsome ��ng v�t có vú. Ngư�i
ta nh�n th�y r�ng vi khu�n như v�y có kh� n�ng m�c trong môi
trư�ng ch�a nh�ng n-alkane khác nhau t� C3 ��n C18 c�a nh�ng
alkane không bão hòa dài hơn 10 carbon ho�c th�m chí c�
chloroalkanes như là 1-chorooctane và 1 chlorooctadecane.
Aspesge và cs �ã phát hi�n ra m�t ch�t có kh� n�ng t�ng h�p
hexadecane và Cyt-P450 hòa tan t� loài Acinetobactes
calcoaceticus EB 104. Không có s� h�n ch� xúc tác, Cyt-P450 �ã
�ư�c kích thích t�ng h�p b�i n-alkane t� hexan thành hexadecan,
nonance và decance là nh�ng ch�t kích thích t�ng h�p ho�t ��ng
nh�t trong s� chúng. S� t�ng h�p Cyt-P450 c�ng �ã �ư�c kích thích
b�i nh�ng h�p ch�t không có liên quan v�i n-alkane, ví d� như
biphenylidence, phenanthrene, nhưng không b�i Phenobarbital.
Nghiên c�u m�i �ây cho th�y r�ng Cyt-P450 c�a A.celloacetius
th�y phân C t�n c�a n-alkane và r�ng h� th�ng Cyt-P450 �Hydroxylase �ư�c t�o ra b�i 3 c�u t� NADH-feredoxin reductase,
feredoxin và Cyt-P450.
Benson và cs th�y s� có m�t c�a n-alkane Hydroxylase �- 1 mã
hóa b�i gen alkB trên OCT plasmid c�a P.putida. Nh�ng enzyme
này không ph�i là protein ph� thu�c Cyt-P450 nhưng là m�t protein
g�n màng v�i TLPT là 41kDa.
Linalool 8-Methyl Hydroxylase: Cyt-P450lin
Lindalool 8-Methyl Hydroxylase (P450lin) và các c�u t� liên
quan c�a nó �ã �ư�c tinh ch� b�i Ulah và cs t� Pseudomonas
putida (incognita), enzyme này �ã �ư�c tách b�i Madyastha và
cs. H� th�ng Cyt- P450lin ch�a 3 protein như là CytP450cam.TLPT c�a NADH-LIN-red. là 44.000, c�a LIN-redoxin
là 11.000 và c�a Cyt-P450lin là 46.000, r�t g�n v�i s� li�u c�a h�
th�ng th�y phân c�a Cyt-P450cam.
Ch
ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t
103
M�c dù có s� gi�ng nhau v� hóa h�c và v�t lý gi�a camphor và
linalool c�a terpence, nhưng không có cái nào trong 3 lin-protein
th� hi�n ho�c ho�t tính mi�n d�ch chéo ho�c ho�t tính xúc tác trong
h� th�ng tái l�p d� h�p t�. Các ch�t kích thích t�ng h�p các enzyme
này là acyclic, ho�c cyclicterpenes như là linalool, geraniol, nerol,
citronellol ho�c limonene và s� kích thích t�ng h�p c�a h� th�ng
này nh�y c�m v�i glucose, 8-methyl linalool �ư�c oxy hóa thành
linalool-8-carboncylic acid qua 8-alcohol và 8-aldehyde c�a nó.
Ngư�i ta nh�n th�y r�ng � vi khu�n, t�n t�i h� th�ng tương t� CytP450 th�y phân m�t g�c methyl � v� trí 10 c�a linalool.
p-Cymene-7- Hydroxylase: Cyt-P450cym
Bhattacharyya và cs �ã phân l�p Pseudomonat, ch�ng PL,
ch�ng này lên men � và �-pinence. Enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng
h�p c�m �ng và nh�y v�i glucose. Cyt-P450cym c�a Pseudomonas
putida PL-W ho�c dòng JT-101 ( cùng m�t dòng như trên) có kh�
n�ng phát tri�n trên P-cymene (4-isopropyl-toluene) �ư�c coi là Pcymene-hydroxylase và enzyme th�y phân P-cymene t�o thành
cumic alcohol (4-isopropyl-benzyl alcohol). P-putida JT-810 �ư�c
tách b�i Ribbon và cs c�ng có kh� n�ng m�c trên P-cymene và
bư�c kh�i ��u �ư�c xúc tác b�i m�t enzyme có th� là ph� thu�c
Cyt-P450.
Dealkylase
Castwright và Broadbent �ã tách và tinh s�ch m�t O-dealkylase
ph� thu�c Cyt-P450 t� Nocrsdia srtain NHI. Cyt-P450 kh� alkyl
c�a p-alkylphenyl ethers như là axit anisinic và isovarilate. Enzyme
này �ư�c t�o ra t� ít nh�t hai c�u t�: Reductase ch�a flavin ��c hi�u
NADH (MW >70.000)và Cyt-P450pda (MW: 45,000). Dardas và cs
�ã phân l�p Moraxella SP, loài này có th� m�c trên guaiacol
(2 methoxy- phenol) ho�c 2-ethoxyphenol như là m�t ngu�n
carbon. Loài vi khu�n này t�o ra m�t O-demethylase ph� thu�c CytP450.
P450S tY Rhizobium Japonicum
Appleby th�y r�ng Cyt P450 có � dòng vi khu�n Rhizobium c�
��nh ��m (dòng CC705), và �ã ti�n hành xác ��nh �ư�c 6 CytP450(a,b,c1 - c4), tinh ch� �ư�c Cyt-P450a,b,c1. T�t c� các Cyt-P450
�ư�c tinh s�ch có TLPT 45,000. Phân tích axit amin c�a các Cyt-