Tải bản đầy đủ (.pdf) (139 trang)

Ebook cytochrome p450 phần 2 PGS TS nguyễn thị ngọc dao

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.18 MB, 139 trang )

79

Ch

ng IV

H TH NG CYTOCHROME-P450
VÀ TH C V T

VI SINH V T

4.1. H! th#ng Cyt-450 % n&m men và n&m s,i (Filamentous
Fungi)
4.1.1 Tình hình nghiên c u Cyt-P450

n m men và n m s i

S� phát hi�n Cytochrome- P450 trong n�m men �ư�c công b�
l�n ��u tiên vào n�m 1964 b�i Lindenmayer và Smith. Cùng n�m
�ó, Omura và Sato c�ng công b� nh�ng bài báo ��u tiên c�a h�.
Tuy nhiên, ngư�c v�i nh�ng hi�u bi�t khá nhi�u v� Cyt-P450 �
��ng v�t có vú thì Cyt-P450 � con men và n�m s�i (filamentous
fungi) còn �ư�c bi�t r�t ít. Yoshida và cs �ã kh�ng ��nh �ư�c c�u
trúc và ch�c n�ng c�a h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� trong
Saccharomyces cerevisiae (hình 4.1) và �ã g�i các h� th�ng này là
Cyt-P450(14DM), lanosterol 14 – demethylase.
Nghiên c�u v� s� oxy hóa alkan b�i Cyt-P450 c�a con men h�p
th� alkan �ư�c ti�n hành b�i m�t s� nhóm nghiên c�u khác nhau �ã
cung c�p nh�ng thông tin quan tr�ng liên quan t�i Cyt-P450 � con
men. S� có m�t c�a nh�ng Cyt-P450 và nh�ng ho�t tính ph� thu�c
Cyt-P450 trong con men và filamentous fungi �ã �ư�c công b�


nhưng c�ng m�i ch� d�ng l�i � mô t� s� lư�ng các Cyt-P450 t�n t�i
trong các dòng riêng bi�t ho�c các dòng c�a các eukaryote �ơn bào,
còn r�t h�n ch� so v�i s� lư�ng này � các karyote b�c cao hơn. Tuy
nhiên, có th� là nh�ng cơ th� riêng bi�t t�o ra nh�ng Cyt--P450 nh�t
��nh �� �áp �ng cho nh�ng chuy�n hóa ��c hi�u c�a chúng và b�
sung vào danh sách gia �ình c�a Cyt-P450. T�ng s� các Cyt-P450
trong eukaryote b�c th�p là r�t l�n. Cyt-P450 �ã t�o nên m�t ��i
gia �ình các gen kh�ng l� trong quá trình ti�n hóa c�a eukaryote ��


80

Nguy�n Th� Ng�c Dao

�áp �ng cho yêu c�u c�a chúng trong s� oxy hóa các h�p ch�t nh�t
��nh. �� gi�i thích s� ti�n hoá và s� khác nhau c�a Cyt-P450 c�n
ph�i nghiên c�u tích c�c hơn n�a trên Cyt-P450 c�a eukaryote c�a
vi sinh v�t c�ng như c�a th�c v�t b�c cao.
- Kh� axít béo bão hòa
acyl CoA

NADH

fP1

C SF8

B5

- Kh� axít béo bão hòa

ergostadienol
- Kh� methyl c�a sterol

NADPH

fP2

P450s

- Kh� methyl
lanosterrol

c�a

Kh� bão hòa c�a
ergostadienol
- Oxy hóa các xenobiotic

Squalene epoxidate
Hình 4.1. H� th�ng chuy�n �i�n t� � n�m men và ch�c n�ng c�a chúng,
fP1= NADH Cyt b5 reductase; b5 = Cytb5; CSF = cyanide senitive factor
(y�u t� nh�y c�m v�i cyanide)
B ng 4.1. Nh�ng ho�t tính ph� thu�c Cyt-P450 �ã công b� ��i v�i
n�m men và n�m s�i
Ho t tính

P450

Phân b


14 -demethyl hoá các sterol

P45014D

H�u h�t vi sinh v�t

22 kh� bão hoà ergosterol

P45022DS

Có th� h�u h�t

Thu� phân kh�i mào các alkan

P450 alkan

N�m men tiêu th� Alkan

Thu� phân các axit béo

P450 alki,c

Candida tropical

Chuy�n hoá các xenobiotic

B

Saccharomyces cerevisiae


a

Schizoscc pombe

a

Candida tropical

a

Cunighamella elegan

a

Cunighamella baireiri

P450 hpha

Aspergillus sp.

P450RM

Rhodotorula minuta

T�o thành isobuten


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t


Chuy�n hoá nitrat/nitrit

P450dNIR

Fusarium oxysporum

Demethyl hoá pisatin

P450(57)d

Nectria haematococca

Thu� phân m-cresol

a

Aspergillus parasitous.

Sinh t�ng h�p aflatoxin

a

Claviceps purpurea

Sinh t�ng ergot alkaloid

a

Thu� phân progesterone


a

Aspergillus
Ocraceousrhizopusnigricas

81

Chú thích: a = P450 �áp �ng cho nh�ng ho�t tính chưa �ư�c xác
��nh, b= m�t P450 có ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa �ư�c
kh�ng ��nh như m�t loài duy nh�t, c= nh�ng P450 có th� �áp �ng cho
ho�t tính này �ã �ư�c tách chi�t nhưng chưa kh�ng ��nh v� �óng góp c�a
nó cho ph�n �ng, d: gen c�a P450 này �ã �ư�c tách dòng nhưng protein
tương �ng chưa tách �ư�c

4.1.2. Cyt-P450 c a n m men
Cyt-P450(14DM) (Lanosterol 14 -demethylase)
Cyt-P450(14DM) �ã �ư�c tinh s�ch t� S. cerevisiae và C.
albicans, trong �ó S. cerevisiae �ư�c nghiên c�u nhi�u nh�t trong
các lo�i n�m men. Enzyme này oxy hóa nhóm methyl c�a lanosterol
�� b�t ��u s� sinh t�ng h�p ergosterol t� lanosterol và �ư�c phân
b� r�ng rãi trong h�u h�t các eukaryote v�i ch�c n�ng chuy�n hoá.
Nh:ng thu;c tính sinh lý, hóa sinh
Cyt-P450(14DM) tinh s�ch t� S. cerevisiae có TLPT 58.000 khi
�i�n di trên PGE có m�t SDS (th�p hơn giá tr� lý thuy�t 60.700).
D�ng ferric khi không có cơ ch�t c�a Cyt-P450 này th� hi�n tr�ng
thái spin th�p � sóng �� 417nm, không có h�p th� � vùng 650nm,
tín hi�u EPR � g = 1,92 ; 2,27; và 2,45. D�ng kh�- CO có b�ng
h�p th� � 447nm. Khi liên k�t v�i cơ ch�t, tr�ng thái spin th�p c�a
ferric chuy�n thành spin cao v�i thay ��i quang ph� typ I. S�

chuy�n d�ng spin này không x�y ra v�i 24, 25-dihydrolanosterol,
m�t cơ ch�t khác ít b� �nh hư�ng hơn. B�ng cách s� d�ng s� bi�n
��i quang ph� do cơ ch�t b� kh�, ngư�i ta �ã xác ��nh �ư�c Kd
c�a lanosterol là 6,0 µM và giá tr� này trùng kh�p v�i Km c�a h�p
ch�t này.
Enzyme này tác d�ng v�i nh�ng h�p ch�t ngo�i lai khác như
pyridin, d�n xu�t imidazol và triazol, th� hi�n s� bi�n ��i quang ph�
��c trưng cho typ II. Trong s� nh�ng h�p ch�t này, các d�n xu�t


82

Nguy�n Th� Ng�c Dao

azol �ư�c bi�t là nh�ng ch�t kháng n�m (antifungal agent) th� hi�n
ái l�c ��c bi�t cao và chúng ho�t ��ng như là nh�ng ch�t �c ch�
Cyt-P45014DM.
Nh:ng thu;c tính xúc tác
Cyt-P45014DM xúc tác s� oxy hóa lanosterol thành 4,
demethylcholesta 8, 14, 24-trienol trong s� có m�t c�a NADPHP450-reductase, O2 và NADPH (hình 4.2). Ph�n �ng này bao g�m
3 quá trình monooxygen hoá và m�t phân t� Cyt-P45014DM riêng l�
chuy�n hóa toàn b� quá trình ph�n �ng liên t�c này mà không có
s� gi�i phóng ch�t trung gian b� oxy hóa � v� trí 32. H�ng s� Km
và Vmax c�a lanosterol 14 -demethylase c�a S. cerevisiae tái t�o
�ư�c xác ��nh là 6,25µM và 16nmol s�n ph�m �ư�c t�o
thành/phút/nm Cyt-P45014DM, m�t cách tương �ng. Vì s� methyl
hóa g�m có 3 quá trình monooxygen hóa nên tr� s� Vmax mô t� �
trên kh�ng ��nh r�ng m�t phân t� Cyt-P45014DM lanosterol xúc tác
nhi�u quá trình oxy hoá /phút. Ph�n �ng kh� b�i enzyme c�a h�n
h�p Cyt-P450 - lanosterol x�y ra v�i m�t h�ng s� bi�u ki�n k =

20min-1 dư�i áp su�t CO, trong khi m�t h�ng s� bi�u ki�n cho s�
kh� c�a Cyt-P45014ld không có cơ ch�t là < 0,1min-1. �i�u này
kh�ng ��nh r�ng Cyt-P45014DM có m�t cơ ch� �i�u hòa �� h�n ch�
s� quay vòng vô ích c�a chu k� oxy hóa kh�. Lanosterol 14 demethylase tái l�p c�ng xúc tác cho s� th�y phân 14 , 24, 25
dihydrolanosterol v�i ái l�c y�u hơn (km = 16,7µM). Vì không có
24, 25 dihydrolanosterol xu�t hi�n m�t cách t� nhiên � n�m men
nên cơ ch�t ��c bi�t này có th� có ý ngh�a v� m�t sinh lý. Thêm
vào �ó, enzyme này có kh� n�ng chuy�n hóa m�t s� d�n xu�t
lanosterol khác và b� �c ch� b�i m�t s� d�n xu�t lanosterol không
b� chuy�n hóa. Tuy nhiên, enzyme này không có tác d�ng v�i
cholesterol ho�c ergosterol và bi�u hi�n ho�t tính chuy�n hoá
thu�c không �áng k�.
Quan sát này cho th�y r�ng Cyt-P45014DM c�a n�m men có
tính ��c hi�u cơ ch�t h�p ��i v�i lanosterol và các d�n xu�t c�a nó
và ch� ho�t ��ng như enzyme lanosterol 14 -demethylase.


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

83

HO

Hình 4.2. S� demethyl hóa 14 c�a lanosterol �ư�c xúc tác
b�i Cyt-P45014DM.

C&u trúc bEc 1
C�u trúc b�c 1 c�a Cyt-P45014DM �ã �ư�c suy lu�n t� trình t�

nucleotid c�a genomic DNAs dòng hoá t� S. cerevisiae, C.albican
và C.tropical. Cyt-P45014DM là tương ��i l�n g�m 530 axit amin v�i
tr�ng lương phân t� là 60.700 (S. cerevisiae). Xem xét c�u trúc b�c
1, Cyt-P45014DM c�a n�m men �ư�c coi là t�o thành m�t gia �ình
gen riêng bi�t và �ư�c Nebert và cs x�p vào CYP51 như trong
trư�ng h�p Cyt-P450 t� microsom c�a ��ng v�t có vú, CytP45014DM có m�t c�u trúc �ư�c cho là m�t vùng g�n màng � ��u Nt�n như là ph�n �ư�c g�ch dư�i trong trình t�. �áng chú ý là m�t
�o�n ch�a 30 axit amin �ư�c kéo dài v� phía ��u N-t�n c�a vùng
�ư�c cho là g�n màng và �o�n này v�n còn l�i trong phân t� thành
th�c ngo�i tr� methionin � ��u. M�c dù ch�c n�ng c�a �o�n này
v�n chưa �ư�c làm rõ nhưng �áng chú ý r�ng domain �ư�c gi� ��nh
là g�n màng này �ư�c b�o v� bên sư�n b�i các axit amin tích �i�n;
ví d�: - QR :::: RK - trong S. cerevisiae Cyt-P45014DM. �i�u �ó g�i
ý r�ng �o�n này có th� không �ư�c g�n vào màng cùng v�i �o�n
�ư�c cho là g�n màng. S� kéo dài như v�y c�ng �ư�c th�y trong
Cyt-P450alk. Nhưng không tìm th�y � Cyt-P450 ��ng v�t có vú.
Tóm l�i, s� kéo dài � ��u N- t�n này �ư�c coi là riêng bi�t cho CytP450 � n�m men, và cách th�c g�n màng � Cyt-P450 n�m men có
khác gì �ó v�i � Cyt-P450 ��ng v�t có vú. Theo nghiên c�u c�a
Chen và cs. nh�ng Cyt-P45014DM t� S. cerevisiae và C.tropicals có
343 (66,6% ) trùng kh�p và 119 (23,1%) các axit amin �ư�c thay


84

Nguy�n Th� Ng�c Dao

th� b�o t�n và 4 vùng tương ��ng cao �ã �ư�c xác ��nh. M�t trong
s� �ó là vùng liên k�t �ư�c gach dư�i và nh�ng vùng khác �ư�c coi
là liên quan v�i v� trí chính xác m�c dù v�n chưa �ư�c x�p lo�i.
�i�u �áng k� là s� thay th� ch� m�t g�c axit amin (310G
D)

trong vùng �ư�c xác ��nh l�n nh�t (t� 290N ��n 332E trong phân
t� S. cerevisiae) �ã t�o ra m�t d�ng không ho�t ��ng c�a CytP45014DM �ư�c g�i là Cyt-P450SGI. Trình t� axit amin c�a CytP45014DM và Cyt-P450cam g�i ý r�ng vùng này bao g�m trình t� �áp
�ng cho helix I ho�c helix xa c�a Cyt-P450cam. S� d�ng máy tính có
thêm h� th�ng "SCADS" mô hình hóa phân t� �ư�c phát tri�n b�i
Vi�n Suntory trong nghiên c�u v� sinh y h�c và s� li�u c�a phân
tích tinh th� Cyt-P450cam, ngư�i ta �ã d� �oán r�ng trong phân t�
Cyt-P450SGI ��t bi�n không ho�t ��ng, m�t histidin � vùng này
(317-H) có th� tác ��ng v�i s�t hem như là ph�i t� th� 6 trans vào
thiolate và s� tác ��ng này �ã �ư�c kh�ng ��nh b�i phân tích quang
ph� c�a phân t� Cyt-P450SGI �ã tinh s�ch. �i�u �ó g�i ý r�ng vùng
này ph�i �ư�c ��nh v� � g�n v�i m�t ngo�i biên c�a hem và có th�
bao g�m m�t ph�n c�a v� trí ho�t ��ng.
Cyt-P45014DM nh
n&m Azole

là mFc tiêu cHa nh:ng tác nhân ch#ng

M�t s� nh�ng d�n xu�t triazol và imidazol �ã �ư�c s� d�ng như
là tác nhân có kh� n�ng ch�ng n�m trong y h�c và l�nh v�c nông
hóa, chúng �ư�c g�i là nh�ng tác nhân azole kháng n�m. T�t c�
nh�ng h�p ch�t này ��u có th� n�ng �c ch� enzyme lanosterol 14 demethylase t�o ra h�n h�p l�p th� v�i Cyt-P45014DM.
S� �c ch� enzyme Cyt-P450 14-DM gây ra s� �ào th�i ergosterol
và làm � ��ng 14-methyl sterol trong các t� bào. Bi�n ��i trong s�
t�o thành sterol, ��c bi�t là tích l�y 14-methyl sterol gây ra s� xáo
tr�n hàng lo�t v� ch�c n�ng c�a màng, d�n t�i �c ch� t� bào phát
tri�n ho�c ch�t. Tóm l�i, Cyt-P45014DM là �ích ��u tiên c�a tác nhân
azole kháng n�m. S� phát tri�n nh�ng thu�c có hi�u qu� và an toàn
có th� �ư�c áp d�ng m�t cách h� th�ng là m�t trong nh�ng v�n ��
quan tr�ng nh�t trong hóa tr� li�u �� h�n ch� s� nhi�m các n�m khác
� nh�ng b�nh nhân b� suy gi�m mi�n d�ch. M�c dù nh�ng d�n xu�t

azole �ư�c coi là có th� tr� thành m�t trong nh�ng nhóm tri�n v�ng
nh�t trong nh�ng tác nhân kháng n�m h� th�ng, v�n còn nguy cơ
c�a ph�n �ng có h�i d�n t�i �c ch� các Cyt-P450 c�a v�t ch�. Tuy
v�y, s� phát tri�n m�t tác nhân azole kháng n�m có s� l�a ch�n cao


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

85

��i v�i Cyt-P45014DM v�n �ư�c ch� ��i m�t cách háo h�c. Cơ s�
cho �i�u này là nh�ng phân tích trư�c �ây v� c�u trúc v� trí ho�t
��ng c�a Cyt-P45014DM c�a n�m giúp cho s� thi�t k� nh�ng phân t�
tác nhân azole kháng n�m.
Cyt-P450(alk) (alkan terminal hydroxylase) cHa n&m men a
dMu hNa
Bư�c ��u tiên c�a s� chuy�n hóa alkan b�i nh�ng n�m men tiêu
hóa �ư�c alkan là s� th�y phân các alkane thành các alkanol. Ph�n
�ng này �ư�c xúc tác b�i m�t lo�i Cyt-P450 khác �ư�c g�i là CytP450alk. Cyt-P450alk �ư�c t�o ra ch� trong nh�ng t� bào phát tri�n
nh� alkan � nh�ng n�m men tiêu hóa �ư�c alkan và không tìm th�y
trong nh�ng n�m men khác như là Saccharomyces sp. ho�c nh�ng
t� bào phát tri�n nh� glucose c�a n�m men tiêu hóa alkan. CytP450alk �ã �ư�c tinh ch� t� nh�ng t� bào phát tri�n �ư�c nh� alkan
c�a C.maltosa EH15, t� bào này trư�c �ây �ư�c g�i là
Lodderomyces elongisporus và �ã �ư�c ��c trưng. Genomic DNA
��i v�i Cyt-P450alk �ã �ư�c dòng hóa t� C.maltosa IAM 12247.
C.maltosa EH15 và C.tropicals, s� trùng h�p b�c 1 c�a Cyt-P450alk
v�i nh�ng Cyt-P450 khác là th�p và Cyt-P450alk �ư�c x�p lo�i như
là m�t gia �ình gen CYP52 riêng bi�t b�i Nebert và cs.

Tính không PQng nh&t phân tS
Tr�ng lư�ng phân t� c�a các Cyt-P450alk �ư�c tính toán ��a
vào c�u trúc b�c 1 là 59838 (523 axit amin) cho C. IAM maltosa
12247, 59705 (521 axit amin) cho C.maltosa EH15 và 63200 (543
axit amin) cho C.maltosa, g�n 60% các axit amin là gi�ng nhau và
kho�ng 25% �ư�c b�o t�n. Sanglard và Fiechter phát hi�n gen
Cyt-P450 khác có 70% s� ��ng nh�t v�i gen Cyt-P450alk �ã nêu �
trên c�a C.tropicals trong cùng m�t thư vi�n gen và phân ��nh rõ
enzyme này v�i nh�ng Cyt-P450alk trư�c �ây là Cyt-P450alk2 và Cyt-P450alk3, m�t cách tương �ng. Seghezzi và cs. công b� r�ng
gen Cyt-P450alk2 là m�t protein ch�a 522 axit amin. Kích thư�c
phân t� c�a Cyt-P450alk2 có th� so sánh v�i kích thư�c c�a
C.maltosa Cyt-P450alk. Sanglard và cs. xác ��nh r�ng TLPT trên
�i�n di c�a Cyt-P450alk �ư�c tinh s�ch t� C.tropicals th�p hơn
�áng k� so v�i protein c�a Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n trong S.
cerevisiae. Tuy nhiên, Cyt-P450alk1 �ư�c bi�u hi�n �ã không xúc
tác �ư�c ph�n �ng th�y phân alkan mà l�i th�y phân - laurate,


86

Nguy�n Th� Ng�c Dao

g�i ý r�ng Cyt-P450alk2 xúc tác s� th�y phân alkane. Tóm l�i, CytP450alk2 tương t� v�i Cyt-P450alk chuy�n hóa chính alkane c�a
C.tropicals và có th� �ư�c dòng hóa tr�c ti�p t� Cyt-P450 c�a
C.maltosa. �i�u này kh�ng ��nh r�ng Cyt-P450alk c�a C.tropicals
bao g�m ít nh�t hai thành viên khác nhau. Sanglard và cs g�i ý
r�ng chúng có th� �ư�c t�o ra b�i s� c�p �ôi gen m�t cách n�i ti�p
vì Cyt-P450alk và alk2 ch� cách nhau m�t Kb trên cùng m�t nhi�m
s�c th�.
Thu;c tính phân tS và thu;c tính xúc tác

Như trong trư�ng h�p c�a Cyt-P45014DM, Cyt-P450alk có m�t
nhánh ưa nư�c trư�c �o�n �ư�c cho là g�n màng � vùng N- t�n
và �o�n này v�n �ư�c gi� l�i trong phân t� thành th�c ngo�i tr�
methionin g�n � ��u. �i�u thú v� là, �o�n �ư�c cho là g�n màng
c�a Cyt-P450alk �ã �ư�c chia thành hai nhánh và c� hai �ư�c che
ch�n b�i các axit amin tích �i�n . Cyt- P450alk �ư�c tinh ch� t�
C.maltosa bi�u hi�n sóng h�p th� ��c trưng c�a m�t Cyt-P450
spin th�p. Sóng h�p th� c�a ph�c h�p kh� v�i CO �ã �ư�c công
b� là � 447nm cho Cyt-P450 alk c�a C.maltosa EH15 ho�c
450nm cho Cyt-P450alk t� C.maltosa IAM 12247. Phân tích
quang ph� c�a microsome t� nh�ng t� bào C.tropicals m�c trên
tetradecane g�i ý r�ng Cyt-P450alk tác ��ng v�i m�t s� ph�i t�
ngo�i lai m�c dù không có s� bi�n ��i quang ph� �ư�c phát hi�n
d�a trên liên k�t v�i cơ ch�t c�a nó, n- tetradecane. M�c khác,
Cyt-P450alk �ư�c tinh ch� m�t ph�n t� C.guilliermondic �ã �ư�c
công b� th� hi�n bi�n ��i quang ph� typI d�a trên liên k�t v�i
hexadecane.
M�t h� th�ng tái l�p ch�a Cyt-P450alk và NADPH-P450reductase t� C.maltosa EH15 xúc tác s� th�y phân ban ��u c�a
hexadecane, s� kh� b�ng enzyme Cyt-P450alk trong h� th�ng tái
l�p ph� thu�c vào s� có m�t c�a cơ ch�t như là trong trư�ng h�p
c�a Cyt-P45014DM. M�t s� công b� g�i ý kh� n�ng là CytP450alk xúc tác s� th�y phân � ho�c �-1 c�a acid béo b�c cao và
chuy�n hóa m�t s� cơ ch�t là thu�c. Tuy nhiên, s� ��c hi�u cơ
ch�t c�a Cyt-P450alk không �ư�c nghiên c�u th�t tích c�c và c�n
ph�i có nh�ng nghiên c�u chính xác hơn v�i ch�t li�u tinh ch�,
b�i vì Cyt-P450alk xu�t hi�n dư�i nhi�u d�ng. Cyt-P450alk1 �ư�c
dòng hóa và �ư�c bi�u hi�n và Cyt-P450alk2 t� ra có s� ��c hi�u
cơ ch�t khác nhau như ý ki�n �ã nêu � trên.


Ch


ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

87

M;t Cyt-P450 Páp Tng cho sU hoVt hóa các ch&t gây P;t biWn
hóa hXc
Ngư�i ta �ã công b� r�ng, n�m men có th� ho�t hóa m�t s� ch�t
gây ��t bi�n hóa h�c. M�t s� Cyt-P450 có th� �áp �ng cho s� ho�t
hóa này �ã �ư�c tinh ch� t� S. cerevisiae. Cyt-P450 này (còn �ư�c
g�i là P448) �ã có m�t TLPT bi�u ki�n là 55.500. Cyt-P450 này th�
hi�n ho�t tính th�y phân benzo(1)pyrene trên h� th�ng tái l�p v�i
Cyt-P450-NADPH-Reductase, s� bi�n ��i quang ph� typ I d�a trên
liên k�t v�i benzo(a)pyrene, m�t s� cơ ch�t thu�c và lanosterol.
M�c dù s� �áp �ng c�a Cyt-P450 ��i v�i chuy�n hóa oxy hóa
các ch�t gây ung thư b�i n�m men có th� là ch�c ch�n, s� xác ��nh
nó như là m�t lo�i Cyt-P450 riêng bi�t v�n chưa ��t �ư�c. �áng
chú ý là hàm lư�ng Met. và Cys c�a Cyt-P450 này khác �áng k� so
v�i nh�ng Cyt-P45014DM . Ví d�, hàm lư�ng Met và Cys c�a CytP450 này �ư�c tính toán t� thành ph�n axit amin là 7/407 và 8/407,
m�t cách tương �ng, trong khi Cyt-P45014DM �ư�c xác ��nh t� c�u
trúc b�c m�t là 18/530 và 4/530, m�t cách tương �ng.
M;t Cyt-P450 duy nh&t cHa Phodotorunla minuta xúc tác sU
tVo thành isobuten tY isovaleric acid.
Fujii và cs công b� r�ng m�t Cyt-P450 �ã �ư�c t�ng h�p b�i
phenylalanine trong t� bào c�a R.minuta phát tri�n � �i�u ki�n hi�u
khí (60h) v�i ho�t tính t�o thành isobutene. Vì isobutene �ư�c t�o
thành t� L-Leu qua axit isovaleric, Cyt-P450 này �ư�c cho là s�
�áp �ng ��i v�i s� chuy�n hóa c�a isovaleric axit �� thành
isobutence (H.4.7). M�i �ây, các microsome tách t� nh�ng t� bào
R.minuta �ư�c kích thích s�n xu�t b�i phenylalanin xúc tác s�

chuy�n hóa c�a axit isovaleric thành isobutene trong s� có m�t c�a
NADPH và O2, và ho�t tính b� �c ch� b�i CO và VTMK3, do c�n
tr� quá trình chuy�n �i�n t� t� Cyt-P450 reductase t�i Cyt-P450.
Như v�y, s� có m�t c�a m�t Cyt-P450 trung gian chuy�n hóa axit
isovaleric thành isobutene trong microsome c�a t� bào R.minuta
�ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i phenylalanin �ã �ư�c kh�ng ��nh. M�i
�ây, Fujii và cs �ã phân l�p �ư�c Cyt-P450 có m�t d�ng ��ng nh�t
khi �i�n di. Cyt-P450 �ư�c tinh ch� �ã � tr�ng thái spin th�p và th�
hi�n t�c �� hơi ch�m hơn tr�ng thái spin cao trong s� liên k�t v�i
axit isovaleric. Tuy nhiên, chưa có thông tin nào v� thu�c tính xúc
tác c�a nó.


88

Nguy�n Th� Ng�c Dao

Trình t� 30 axit amin � ��u N-t�n c�a s�n ph�m tinh s�ch �ã
�ư�c xác ��nh là GIVQEAAAFVGSLTQLAGAFAALVLAFH.
Trình t� này là hoàn toàn khác v�i trình t� c�a nh�ng Cyt-P450 c�a
n�m men �ã �ư�c bi�t. Tuy v�y, c�u trúc b�c 1 c�a vùng này là
không b�o toàn gi�a nh�ng Cyt-P450 có cùng ch�c n�ng t� nh�ng
ch�ng khác nhau và ngư�i ta không th� xác ��nh �ư�c là li�u CytP450 này có cùng thu�c v� m�t gia �ình gen duy nh�t hay không.
Không th�y có tín hi�u c�a búi (cluster) k� nư�c � �o�n liên k�t
màng �ư�c tìm th�y trong trình t� axit amin ��u N-t�n � trên. �i�u
này g�i ý r�ng m�t ph�n kéo dài trư�c vùng liên k�t vào màng �ư�c
tìm th�y trong t�t c� các Cyt-P450 c�a n�m men cho ��n nay �ã
�ư�c phân tích trình t� c�ng có th� có m�t trong Cyt-P450 này. S�
chuy�n hóa axit isovaleric �� thành isobutene �ư�c coi là ho�c CytP450 xúc tác s� kh� bão hòa v� trí �, � ti�p theo sau s� kh�
carboxyl c�a �, � không bão hòa c�a axit carboxylic ho�c oxy hóa

liên k�t C-C gi�ng như là bư�c cu�i cùng c�a s� demethyl hóa 14
�-lanosterol. Trong m�i trư�ng h�p, Cyt-P450 này là trung gian cho
m�t ph�n �ng m�i chưa t�ng �ư�c công b� ��i v�i Cyt-P450.
Cyt-P45022DS chuy[n hóa trung gian cho sU khS bão hòa v^
trí 22 cHa ergostadienol ho_c ergostenol
S� t�o ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol là
c�n thi�t cho s� sinh t�ng h�p ergosterol. Ph�n �ng này �ư�c xúc
tác b�i nh�ng microsome n�m men, c�n có m�t NADPH và O2 và b�
�c ch� b�i kháng th� kháng CPR c�a n�m men. Tuy nhiên, ph�n
�ng này �ư�c coi là m�t ph�n �ng trung gian b�i m�t d�ng CytP450 �ư�c h�p nh�t vào h� th�ng v�n chuy�n �i�n t� � microsome.
Vì có m�t ch�ng n�m men ��t bi�n ch� thi�u h�t ph�n �ng t�o
ra liên k�t �ôi s� 22 � ergostadienol ho�c ergostenol nên ph�n �ng
này �ư�c coi là �ư�c xúc tác b�i m�t d�ng Cyt-P450 riêng bi�t
�ư�c g�i là Cyt-P45022DS. Tuy v�y, Cyt-P450 này v�n chưa �ư�c
tách chi�t và nh�ng thu�c tính xúc tác và phân t� c�a nó v�n chưa
�ư�c làm rõ.
4.1.3. Cyt-P450 c a n m s i (Filamentous Fungi)
Cyt-P450 cHa Fusarium oxysporum
Shoun và cs �ã công b� r�ng F. oxysporum ch�a Cyt-P450 c� �
microsome và phân �o�n hoà tan. �i�u �ó g�i ý r�ng m�t �o�n n�i


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

89

màng ��nh v� � microsome thu� phân trung gian acid béo và m�t
�o�n hoà tan có kh� n�ng do nitrate/nitrite kích thích t�ng h�p có

th� là �áp �ng cho s� chuy�n hoá nitrate ho�c nitrite. Thêm n�a,
ngư�i ta c�ng công b� r�ng d�ch chi�t không còn t� bào c�a F.
oxysporum th� hi�n ho�t tính có th� coi là oxy hoá ��i v�i ch�t
ngo�i lai.
Cyt-P450 P ,c tinh chW tY phân PoVn hoà tan
Hai ch� ph�m Cyt-P450 �ư�c coi là Cyt-P450A và B �ã �ư�c
tinh s�ch t� ph�n hoà tan c�a F. oxysporum. Hai s�n ph�m này h�u
h�t r�t gi�ng nhau tr� �i�m ��ng �i�n c�a chúng. TLPT bi�u ki�n
c�a c� hai Cyt-P450 �ã �ư�c xác ��nh b�ng �i�n di PGE là 48.000
và 43.000 b�ng l�c gel, xác ��nh �ư�c b�n ch�t monomer c�a chúng
trong ch� ph�m cu�i cùng không ch�a ch�t t�y.
S� lư�ng các g�c axit amin �ư�c tính toán t� vi�c phân tích axit
amin c�a Cyt-P450A và B là 427-8 cho TLPT là 48.000. D�ng oxy
hoá c�a Cyt-P450A, B là trong tr�ng thái h�n h�p spin th� hi�n �
��nh h�p th� t�i 414nm v�i m�t vai � 390nm. ��nh h�p th� c�a h�n
h�p v�i CO d�ng kh� �ư�c th�y � 447nm. C�n ph�i làm rõ li�u
nh�ng Cyt-P450 này có ph�i d�ng hoà tan không, vì Shoun và các
cs �ã công b� r�ng Cyt-P450 liên k�t microsome �ư�c gi�i phóng
m�t ph�n vào phân �o�n hoà tan trong quá trình phân hu� t� bào.
Cyt-P450A th� hi�n quang ph� phân bi�t typ I trên liên k�t v�i
laurate. M�t cơ ch�t có th� c�a Cyt-P450 microsomal và kháng th�
��i v�i Cyt-P450 này �c ch� ho�t tính thu� phân laurate. M�t khác,
ngư�i ta �ã công b� r�ng ��nh h�p th� c�a h�n h�p CO d�ng kh�
c�a Cyt-P450 microsomal �ã �ư�c th�y � 450nm, trong khi d�ng
hoà tan c�a chúng và ch� ph�m tinh s�ch l�i �ư�c th�y � 448 và
447nm (m�t cách tương �ng). Như v�y, không có m�t ch�ng minh
ch�c ch�n nào cho s� trùng l�p c�a Cyt-P450A và Cyt-P450B.
SU thu` phân acid béo
Nh�ng d�ch chi�t không có t� bào t� F. oxysporum �ã chuy�n
hoá thu� phân laurate và palmitate � v� trí -1, �-2 và �-3. S� tái

l�p Cyt-P450 và CPR �ã �ư�c g�i ý d�a trên nh�ng tác ��ng �c ch�
c�a CO và menadion, ch�t này �ư�c coi là ch�t �c ch� s� v�n
chuy�n �i�n t� t� Reductase ��n Cyt-P450. Trên phân �o�n t� bào,
ho�t tính này �ư�c tái t�o trong c� phân �o�n microsome và phân
�o�n hoà tan. Tuy nhiên, ho�t tính trong phân �o�n hoà tan �ã �ư�c


90

Nguy�n Th� Ng�c Dao

xem như là do s� gi�i phóng h� th�ng emzym t� microsome trong
quá trình phân hu� t� bào. Nh�ng lo�i Cyt-P450 �áp �ng cho ho�t
tính này v�n chưa �ư�c xác ��nh.
Cyt-P450 hoà tan P ,c kích thích tbng h,p b%i Nitrat ho_c
Nitrit
S� phát tri�n c�a F. oxysporum khi có m�t nitrat ho�c nitrit và
m�t ít oxy �ã t�o ra có th� coi là Cyt-P450 trong ph�n hoà tan c�a
nh�ng t� bào này (b�ng 4.2).
B ng 4.2. S� kích thích t�ng h�p Cyt-P450 hoà tan b�ng nitrat ho�c nitrit
trong F. oxysposum ( t� công b� c�a Shoun và các cs)
Nitơ vô cơ
thêm vào
( 0,2%)

NO
NaNO3
NaNO2
NH4CL
NaNO3

NaNO2

S�c khí

th�p
th�p
th�p
th�p
cao
cao

Hàm lư�ng Cyt-P450(nmol/mg protein)
Phân �o�n tan

Phân �o�n microsome

Kph
0,288
0,685
0,0035
0,013
kph

0,085
0,075
0,103
0,11
0,014
0,012


Chú thích: kph = không phát hi�n
Vì s� c�m �ng t�ng h�p là ít �ư�c quan sát � Cyt-P450
microsomal dư�i �i�u ki�n này, nên Cyt-P450 �ư�c t�o ra �ã
�ư�c coi là hoàn toàn n�m trong phân �o�n hoà tan. M�i �ây,
Kizawa và cs �ã tách chi�t m�t dòng cDNA, �o�n này �ư�c
cho là có mang trình t� mã hoá c�a Cyt-P450. cDNA này
(CYP55) mã hoá cho m�t protein Cyt-P450 ch�a 403 axit
amin và không có búi k� nư�c ��i v�i m�t �o�n liên k�t
màng �ã �ư�c tìm th�y trong trình t�. Như v�y, Cyt-P450 mã
hoá b�i gen này là tương t� v�i m�t protein hoà tan. S� kích
thích t�ng h�p d� thư�ng và s� ��nh v� c�a Cyt-P450 này
dư�ng như �ư�c d� �oán trư�c v� ch�c n�ng duy nh�t c�a nó.
Shoun và các cs th�y r�ng ho�t tính kh� nitrit không tương t�
�ã �ư�c kích thích t�ng h�p c�m �ng song song v�i Cyt-P450
hoà tan, g�i ý s� tham gia có th� c�a Cyt-P450 này vào ho�t
tính xúc tác trên.


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

91

Nh:ng Cyt-P450 khác và hoVt tính liên quan PWn Cyt-P450
cHa n&m s,i (Filamenrtous Fugi): SU demethyl hoá v^ trí 14
trong sinh tbng h,p sterol
Tác nhân kháng n�m azole, nh�ng ch�t �c ch� có ti�m n�ng và
��c hi�u c�a lanosterol 14�-demethylase (P45014DM) c�a n�m men,
�c ch� s� sinh t�ng h�p ergosterol b�i n�m s�i và tích lu� m�t s�

14- methyl sterol trong t� bào, g�i ý r�ng Cyt-P45014DM tham gia
vào s� chuy�n nhóm c�a 14�-methyl trong n�m s�i. S� dư th�a
sterol �ư�c tìm th�y trong nh�ng n�m men �ư�c x� lý v�i nh�ng
tác nhân kháng n�m là lanosterol, trong khi � n�m s�i ch� có m�t ít
lanosterol và m�t s� lư�ng l�n 24-methylne-24, 25-dilydro
lanosterol �ã �ư�c tích lu� l�i. �i�u này g�i ý v� tính ��c hi�u cơ
ch�t c�a Cyt-P45014DM t� Filamentous Fungi dư�ng như tác ��ng
trên 24-methylene-24, 25-dihydro lanosterol như là cơ ch�t tr�i.
SU tVo ra ch&t chuy[n hoá thT c&p
Ambike và cs g�i ý v� s� tham gia c�a Cyt-P450 vào sinh t�ng
h�p alkaloid b�i claviceps purpured d�a trên m�t �i�u là alkaloid
�ư�c t�o thành t�ng lên song song v�i s� kích thích t�ng h�p CytP450 b�i Phenobarbital. B�ng cách s� d�ng cùng m�t chi�n lư�c
hi�u qu�, s� tham gia c�a Cyt-P450 vào s� t�o thành c�a Aflatoxin
b�i Asp.parasiticus NRRL3240 c�ng �ư�c g�i ý.
Murphy và cs c�ng công b� r�ng phân �o�n microsomal c�a
Penicillum patulum ch�a m�t Cyt-P450 xúc tác s� chuy�n hoá c�a
m-cresol thành m-hydroxybenzyl alcohol, ch�t này �ư�c coi là �ư�c
t�o ra trong con �ư�ng sinh t�ng h�p c�a Paturin, m�t mycotoxin
�ư�c t�o ra b�i n�m này. Phát hi�n này g�i ý r�ng Filamenrtous
Fungi có nh�ng Cyt-P450 khác có ch�c n�ng trong s� t�o thành các
ch�t chuy�n hoá th� c�p ��c trưng c�a chúng.
M;t Cyt-P450 khS P;c cHa Phytoalexin pisatin:
Mattheva và Van Etten th�y r�ng m�t n�m b�nh c�a th�c v�t là
Nectria haematococca t�o ra Cyt-P450 xúc tác s� O-demethyl hoá
c�a pisatin khi nó ti�p xúc v�i pisatin. Pisatin là m�t ch�t ��c do
n�m phytoalexin t�o ra khi ��u Hà Lan � vư�n b� nhi�m n�m ngay
t�i v� trí b� nhi�m, nhưng s�n ph�m phenolic c�a nó ít ��c hơn. Ho�t
tính ��c hi�u c�a c�a pisatin demethyl hoá �ư�c quan sát trong
nh�ng microsome tách t� s�i n�m �ư�c x� lý b�i pisatin là r�t cao
(20nmol/min/mg protein microsome) và Km c�a nó ��i v�i pisatin



92

Nguy�n Th� Ng�c Dao

�ư�c coi là th�p (<5�M). Theo �ó, s� kh� ��c c�a pisatin �ư�c
coi là ch�c n�ng n�i t�i c�a Cyt-P450 này và s� t�ng h�p c�a nó
là m�t cơ ch� t� v� sinh h�c �� ch�ng l�i h�p ch�t kháng khu�n.
M�t gen (CYP57) mã hoá cho Cyt-P450 này �ã �ư�c dòng hoá
và ��c trình t�.
SU chuy[n hoá các ch&t lV
Ho�t tính Aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) �ã �ư�c th�y
trong Cunning hamella elegans, C. bainierit và Asp. Ochraceus TS.
Ho�t tính AHH c�a nh�ng n�m này �ã �ư�c kích thích t�ng h�p
b�i m�t s� arylhydrocarbon (hydrocacbon nhi�u vòng nhân thơm),
b� �c ch� b�i nh�ng ch�t �c ch� ��c hi�u Cyt-P450 như là CO và
SKF 525 A và ��nh v� trong phân �o�n microsomal. Cerniglia và
Gibson �ã ti�n hành phân tích ��u tiên nh�ng phân t� t�
benzo[a]pyrence do AHH xúc tác c�a C.elegans và ch� ra r�ng
AHH c�a n�m cho ra cùng m�t s�n ph�m như là s�n ph�m �ư�c t�o
thành b�i enzyme t� ��ng v�t có vú. M�i �ây, m�t gene c�a CytP450 �áp �ng cho s� chuy�n hóa c�a benzo[a]pyrence �ã �ư�c xác
��nh trong Asp.niger và �ư�c g�i là CYP53. Các microsomes c�a A.
ocraceus TS và Rhizopus nigrican �ã �ư�c công b� là có ho�t tính
thu� phân 11�- progesterone và ho�t tính này �ư�c coi là ph� thu�c
vào Cyt-P450 d�a trên s� nh�y c�m c�a nó ��i v�i m�t s� ch�t �c
ch� Cyt-P450 ��c hi�u.
Chloride peroxidase (chloro peroxidase) không phei là m;t
thành viên cHa các Cyt-P450
Chloride peroxidase [EC.1.11.1.10] là m�t glycohemoprotein có

m�t protoheme g�n v�i thiolate như là nhóm ngo�i �ư�c t�o ra b�i
Caldariomyces fumago,là m�t enzyme ngo�i bào. C�u trúc
ligand và k�t qu� ��c trưng quang ph� phân t� enzyme này là r�t
gi�ng v�i c�a các Cyt-P450. Tuy nhiên, c�u trúc protein c�a nó
khác rõ r�t v�i c�a các Cyt-P450, dòng hoá cDNA và phân tích
trình t� cho th�y r�ng apoprotein c�a Chloride peroxidase ch�a 321
axit amin v�i TLPT 35.202 và không tìm th�y s� tương ��ng gi�a
c�u trúc b�c 1 c�a nó v�i c�u trúc b�c 1 c�a các Cyt-P450S. TLPT
bi�u ki�n c�a enzyme này �ã �ư�c xác ��nh là 42.000 v�i 25 – 30%
carbonhydrate. Như v�y, Chloride peroxidase không �ư�c x�p vào
siêu gia �ình Cyt-P450 m�c dù thu�c tính quang ph� là tương t� v�i
các enzyme này.


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

93

4.1.4. +i,u hoà s- t.ng h p Cyt-P450 b i vi khu1n nhân th-c

Nh�ng vi sinh v�t thay ��i ch�c n�ng chuy�n hoá ph� thu�c vào
�i�u ki�n phát tri�n. Vì h�u h�t các Cyt-P450 c�a vi khu�n �ã bi�t
��u �áp �ng cho s� c�n thi�t chuy�n hoá �� phát tri�n dư�i nh�ng
�i�u ki�n ��c bi�t, nên s� t�o thành nh�ng Cyt-P450 như v�y trong
vi khu�n �ư�c coi là �ư�c �i�u hoà b�i nhi�u y�u t� khác nhau.
Cyt-P450alk c�a Candida sp. �ư�c kích thích t�ng h�p m�t cách ��c
hi�u b�i n-alkane. Phương pháp lai Northern xác ��nh rõ ràng r�ng
s� t�ng h�p này �ư�c gây ra b�i s� t�ng quá trình sao chép gen

P450alk b�i n-alkane. S� c�m �ng c�a Cyt-P450alk b�i n-alkane
không �ư�c quan sát th�y khi môi trư�ng có �� glucose cho s� phát
tri�n, kh�ng ��nh r�ng m�t cơ ch� �i�u hoà ki�m ch� b�i glucose
c�ng x�y ra ��i v�i s� bi�u hi�n c�a gen Cyt-P450alk.
S� t�ng h�p c�m �ng c�a Cyt-P450 b�i m�t y�u t� ��c hi�u
c�ng �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� Cyt-P450 khác. Cyt-P450 t�o
thành isobuten c�a R.minuta �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i
phenylalanin và Cyt-P450 kh� methyl c�a pisatin � N.
haemadococca �ã �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i cơ ch�t c�a nó. S�
thêm nitrat ho�c nitrit vào môi trư�ng nuôi c�y �ã kích thích t�ng
h�p m�t d�ng Cyt-P450 hoà tan � F. oxysporum. S� t�ng h�p c�m
�ng này c�a Cyt-P450 b�i ch�t ngo�i lai như là hoá ch�t gây ung
thư và phenobarbital �ã �ư�c công b� ��i v�i m�t s� ho�t ��ng ph�
thu�c Cyt-P450 c�a n�m s�i.
M�c Cyt-P450 trong t� bào S.cereviseac t�ng lên khi hàm lư�ng
O2 th�p và n�ng �� glucose cao trong môi trư�ng nuôi c�y. Vì n�ng
�� O2 và glucose �nh hư�ng ��n nhi�u quá trình chuy�n hoá c�a
n�m men nên có th� là s� t�ng h�p c�m �ng Cyt-P450 là do �nh
hư�ng tr�c ti�p c�a nh�ng y�u t� này. Liên quan v�i �i�u này là
nh�ng phát hi�n dư�i �ây: M�c Cyt-P450 t�ng lên khi �c ch� sinh
t�ng h�p protein ti th� b�i Chloramphenicol và tương t� như v�y
c�ng �ư�c th�y gi�a cAMP và Cyt-P450. Như mô t� trong chương
5, h�u h�t các Cyt-P450 � ��ng v�t có vú là nh�ng enzyme có kh�
n�ng �ư�c t�ng h�p c�m �ng và s� hi�u bi�t v� cơ ch� �i�u hoà
bi�u hi�n gen c�a chúng �ã có nh�ng bư�c ti�n nhanh chóng. Các
Cyt-P450 monooxygenase t�o thành m�t siêu gia �ình kh�ng l� bao
trùm t�t c� th� nhân th�t và nhi�u d�ng trong s� �ó có kh� n�ng �áp
�ng ��i v�i s� chuy�n hoá nh�ng phân t� th�p khác nhau c�n thi�t
cho s� thích nghi v�i stress môi trư�ng. Ti�p �ó, s� �i�u hoà bi�u



94

Nguy�n Th� Ng�c Dao

hi�n gen �� �áp �ng v�i các y�u t� ngo�i lai khác nhau có th� là
m�t ��c trưng quan tr�ng. Như v�y nghiên c�u so sánh cơ ch� �i�u
hoà bi�u hi�n gen � th� nhân th�t b�c cao và th�p có th� là quan
tr�ng cho s� hi�u bi�t v� ti�n hoá c�a h� th�ng Cyt-P450
monooxygenase trong th� nhân th�t.
4.2. Nh:ng enzyme Cyt-P450 cHa vi khufn
4.2.1. Nh4ng enzyme Cyt-P450 c a vi khu1n: Cyt-P450cam

Cyt-P450cam là h� th�ng Cyt-P450 vi khu�n �ư�c hi�u bi�t rõ
nh�t v� m�i liên quan gi�a c�u trúc và ch�c n�ng (xem chương 1).
4.2.2. Campho 5-exo-hydroxylase: Cyt-P450cam

N�m 1959, Gansalus và cs �ã phân l�p �ư�c Pseudomonas
putida PPG1 (ATCC17453), ch�ng này phát tri�n trên ��a ch�a
Camphor như là ngu�n carbon duy nh�t. S� oxy hoá Camphor �ư�c
b�t ��u b�ng s� t�o ra 5-exo-hydroxy Camphor b�i m�t h� th�ng
monooxygenase v�i s� k�t h�p nh�ng c�u t� oxy hoá kh�. H�
th�ng này ��i v�i ph�n �ng exo-hydroxyl hoá c�a Camphor có 3
enzyme tham gia là:
a) NADH-putidaredoxin reductase (PdR), 1FAD-protein (TLPT
45,547: 422 axit amin) �ư�c mã hoá b�i gen Cam A.
b) Putidaredoxin (Pd) 1 protein oxy hoá kh� có Fe-S (TLPT
11,418) mã hoá b�i gen Cam B.
c) Cyt-P450cam, m�t c�u t� teminal hydroxylase (MW: 46,538;
414 axit amin) mã hoá b�i gen Cam C. S� t�o thành tính enzyme

c�a h� th�ng thu� phân Camphor ��u tiên tương t� như h� th�ng
Cyt-P450SCC trong ti th� v� thư�ng th�n ��ng v�t tham gia vào s�
chuy�n hóa chu�i bên c�a cholesterol.
Bư�c ti�p theo là s� kh� hydro c�a 5-OH Camphor �� t�o ra
2,5-diketocamphane (h�p ch�t �ư�c xúc tác b�i F-dehydrogenase
(MW: 38,377; 361 axit amin). Sau m�t s� bư�c, cu�i cùng Camphor
�ư�c chuy�n hoá thành 3 phân t� acetat và m�t phân t� isobutylate.
T�t c� các gen, tr� nh�ng gen cho bư�c cu�i cùng c�a nh�ng
ph�n �ng k� trên �ư�c ��nh v� trong m�t plasmid l�n (240 Kb) �ư�c
g�i là CAM. 4 enzyme, s�n ph�m c�a các gen cam A, B, C và D �ã
�ư�c tìm th�y là �ư�c t�ng h�p c�m �ng b�i Camphor. Nh�ng gen


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

95

này �ã �ư�c dòng hoá và ��c trình t�, k�t qu� ch� ra r�ng c�u t�o di
truy�n c�a các gen Cam, ít nh�t, bao g�m Cam DCAB trong m�t
búi gen và t�o thành Cam operon. Cam R, m�t gen �i�u hoà âm,
��ng trư�c gen Cam D và �ư�c phiên mã � v� trí ��i di�n tr�c ti�p
v�i Cam operon.
Ch�t kìm hãm, m�t protein dimeric (TLPT c�a m�t mer (�ơn
phân) là 20,300; 186 acid amin) là �áp �ng cho Camphor, nó t�o ra
m�t s� t�ng h�p c�m �ng c�ng h�p c�a các gen Cam DCAB. Ch�t
kìm hãm �ã �ư�c tách ra, g�n k�t vào operator và tách r�i ra kh�i
nó khi có m�t Camphor.
Ngư�i ta nh�n th�y r�ng gen Cam R c�ng �ư�c �i�u hoà t�

��ng b�i chính ch�t �c ch� c�a nó. Nh�ng ch�t c�m �ng t�ng h�p
khác nhau ��i v�i h� th�ng này �ã �ư�c công b� và ngư�i ta c�ng
bi�t v� s� có m�t c�a m�t ch�t �c ch� chuy�n hoá ��i v�i s� t�ng
h�p có tính enzyme .
Promotor c�a Cam operon �ư�c xác ��nh gi�a các gen c�a Cam
D và Cam R. RNA polymesase c�a E.coli liên k�t v�i vùng mà nơi
�y có trình t� nucleotid là -35 (TTGACC) và -10 (TATGCT). Gen
�i�u hành (operator) (m�t c�u trúc palindromic - g�p �ôi, ��i x�ng)
trên vùng ch�a trình t� -10 và nucleotid b�t ��u (� v� trí: +1) c�a
Cam operon, ch�t kìm hãm �ư�c tách ra liên k�t vào vùng operator
này in vitro. V� trí liên k�t ribosom �ư�c gi� ��nh, có trình t� Shine
-Dargarno, là tương t� trong m�i gen Cam, GAGG c�a Cam D,
AGGAG cho Cam C, GGAG cho Cam A, GAGG cho Cam B. Mã
kh�i ��u là ATG cho Cam B, C, D và GTG cho Cam A. M�t c�u
trúc vòng và hình cu�ng �ã �ư�c tìm th�y � ��u c�a gen Cam A và
m�t promoter �i�u hành có th� c�a P.putida trong vùng gi�a các
gen A và B.
M�t ch�ng E.coli s�n xu�t quá m�c enzyme Cyt-P450cam �ã
�ư�c t�o ra và s� lư�ng enzyme trong m�t h� nuôi c�y t� bào có th�
�ư�c phát hi�n b�ng quang ph� phân bi�t CO c�a môi trư�ng nuôi
c�y s� d�ng ch�ng vi khu�n này.
4.2.3. C u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam
Cyt-P450cam �ư�c s�n xu�t b�i P. putida �ó là m�t trong nh�ng
h� th�ng t�t �� nghiên c�u m�i liên quan c�u trúc-ch�c n�ng c�a
Cyt-P450 vì nó không liên k�t màng và có kh� n�ng thu �ư�c m�t
lư�ng l�n m�t cách ��c bi�t sau khi gen �ư�c dòng hoá. Nh�ng


96


Nguy�n Th� Ng�c Dao

nghiên c�u c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái P450cam,
không và có liên k�t v�i cơ ch�t, liên k�t v�i CO cho phép s� d�ng
các ��t bi�n ��c hi�u v� trí c�a protein này. (xem Chương 2).
4.2.4. M:i liên quan gi4a c u trúc và ch c n8ng c a Cyt-P450cam
Như �ã nêu � trên, c�u trúc tinh th� tia X c�a m�t s� tr�ng thái
c�a Cyt-P450cam t�o cho chúng ta kh� n�ng s� d�ng s� ��t bi�n v�
trí ��c hi�u ��i v�i protein này. Th�c ra, m�t s� nghiên c�u �ã
thành công trong vi�c thu nh�n m�t s� ��t bi�n c�a Cyt-P450cam và
c�a nh�ng Cyt-P450 khác. Tuy nhiên, Cyt-P450cam �òi h�i nhi�u
hơn hai c�u t� Pd và PdR, nhưng nh�ng protein này �ã không k�t
tinh �ư�c và liên k�t gi�a ba protein v�n còn chưa �ư�c xác ��nh.
�� t�p h�p nhi�u Cyt-P450 ��t bi�n bao g�m nh�ng ��t bi�n
không th� liên k�t v�i Pd và (ho�c) PdR, nh�ng ý �� �ã �ư�c th�c
hi�n �� phân l�p nh�ng ��t bi�n �ư�c kích thích t�ng h�p b�i
hydroxylamine (in vitro x� lý ��i v�i DNA gen c�a Cam C), nh�ng
t� bào có ��t bi�n này không th� m�c v�i Camphor nhưng có th�
m�c v�i 5-exo-hydroxy Camphor và có kh� n�ng t�o ra protein CytP450cam không có ho�t tính oxygen hóa trong s� có m�t c�a Pd và
PdR.
Trong trư�ng h�p Cyt-P450d t� microsome chu�t, Shimizu và
cs công b� r�ng gi�ng như nh�ng protein Cyt-P450cam bi�n ��i nêu
� trên, protein C(456)E và C(456)4 và G(458)E (C(456) �áp �ng
cho C537 c�a Cyt-P450cam �ã không tham gia vào vi�c gi� hem.
K(452)E th� hi�n m�t quang ph� phân bi�t CO sau khi b� kh� b�i
dithionit nhưng không th� hi�n quang ph� b�i s� kh� trong �i�u
ki�n tái t� h�p l�i, g�i ý r�ng Lys (453) tham gia vào s� t�o thành
m�t h�p ch�t v�n chuy�n �i�n t� n�i phân t� (gi�ng như R112C c�a
P450cam. Enzyme Cyt-P450d t� nhiên có c� hai ho�t tính
Benzphetamin N-demethylation và 7-ethoxycoumarin Odealkylation, nhưng m�t �i�u thú v� là, G(450)S protein ch� m�t

ho�t tính th� hai trong khi I(457)S ch� m�t ho�t tính th� nh�t.
R(455)G protein th� hi�n m�t ho�t tính th�p nh�t ��i v�i c� hai cơ
ch�t. Nh�ng ��t bi�n nhân thơm như là F(425)L, P(427)L và
F(430)L protein t� ra ho�t tính th� nh�t r�t th�p (10%) nhưng ho�t
tính th� hai l�i r�t cao (250%). Như v�y s� bi�n ��i c�a vùng xa có
th� �nh hư�ng ��n con �u�ng v�n chuy�n �i�n t� và m�t s� bi�n
��i nh� trong tính ��c hi�u cơ ch�t.


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

97

g;t biWn enh h %ng PWn sU vEn chuy[n Pi!n tS tY Pd
(putidaredoxin)
Enzyme R112C c�a Cyt-P450cam không có ho�t tính xúc tác,
nhưng b�o t�n phân t� hem m�c dù hàm lư�ng hem là không bình
thư�ng (10-15 nmol/mg protein, kho�ng 75% n�ng �� c�a lo�i
enzyme t� nhiên). Quang ph� h�p th� c�a liên k�t CO-liên k�t O2
và d�ng ferric (có camphor ho�c không có camphor) c�a enzyme
��t bi�n là tương t� v�i k�t qu� thu �ư�c t� enzyme typ d�i.
K�t qu� này g�i ý r�ng s� chuy�n �i�n t� ��u tiên ��n R112C
protein t� Pd �ã b� khóa l�i. B�ng phân tích stopped flow s� d�ng
Pd b� kh� và enzyme ��t bi�n cho th�y r�ng giá tr� c�a h�ng s� t�c
�� b�c 1 là quá th�p; 0,1/giây ��i v�i ch�t ��t bi�n trong m�c ��
phân t� (R>15) c�a Pd b� kh� ��n Cyt-P450cam, trong khi nó là
40/giây ��i v�i Cyt-P450cam typ d�i trong kho�ng R>5.
Giá tr� th�p này c�a vi�c chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh� ��n

enzyme ��t bi�n có th� là nguyên nhân cho s� m�t ho�t tính
enzyme. Th� n�ng trung bình (Em) c�a protein ��t bi�n, s� d�ng
safranin (Em = -225 mV) như là m�t ��i ch�ng, là -182mV, th�p
�áng k� so v�i protein typ d�i (-138mV).
Vì m�t trong nh�ng nhóm -NH2( 2) c�a guanidin và = NH( )
c�a Arg112 (trong helix C) �ư�c ��nh v� g�n m�t bên c�a b� m�t
hình tam giác c�a v� trí xa hem, và nhóm -NH2( 1) khác c�a các
d�ng Arg112 t�o thành liên k�t v�i OID c�a axit carboxylic c�a
nhóm propionat hem, Arg112 có th� là r�t quan tr�ng ��i v�i s�
chuy�n �i�n t� t� Pd d�ng kh�, và vùng xung quanh nhóm Arg này
có th� là m�t trong vùng h�p lý nh�t cho s� ti�p xúc v�i m�t Pd
d�ng kh�, và m�t protein acid, qua tương tác axit-bazơ, và ��i v�i
vi�c ch�p nh�n m�t �i�n t� t� m�t Pd d�ng kh�. Th�c ra, nhóm c�a
Sligars �ã ch� ra r�ng nh�ng axit amin láng gi�ng c�a Arg112, như
là Cys344 và Arg72, cùng ��nh v� trên m�t b� m�t, �óng vai trò
quan tr�ng trong s� tương tác gi�a Cyt-P450cam và Pd. Ngư�i ta
c�ng ghi nh�n r�ng Arg112 là m�t axit amin không bi�n ��i cao c�a
gia �ình Cyt-P450. Vì v� trí duy nh�t c�a Arg112 như mô t� � trên,
g�c này c�ng �óng m�t vai trò quan tr�ng trong s� chuy�n �i�n t�
n�i phân t� ��n s�t hem.
S� d�ng ��t bi�n v� trí tr�c ti�p c�a Cyt-P450d, Shimizu và cs
�ã xác ��nh r�ng lysin � v� trí (94) (99) (105) (440) (453) và (463),
m�t Arginin � v� trí (135) (136) (137) và (455) trong Cyt-P450d có


98

Nguy�n Th� Ng�c Dao

th� tham gia vào s� ti�p xúc v�i m�t s� chuy�n �i�n t� t� reductase

c�a nó. Ngư�i ta c�ng nh�n ra r�ng K(94) K(440) K(463) và R(136)
c�a Cyt-P450d �áp �ng cho R72, K344 và R112 c�a Cyt-P450cam,
m�t cách tương �ng.
g;t biWn P#i vhi liên kWt oxygen
M�t chuy�n ��ng v�n c�c b� và s� m� r�ng c�a h�c trung tâm
(Gly 248-Thr 252) c�a helix I xa t�o nên m�t cái túi cho phân t�
oxygen. Chu�i bên, m�t nhóm –OH c�a Thr 252, là không bình
thư�ng trong vi�c là nó cho m�t liên k�t hydro v�i nguyên t�
Cacbonyl oxygen c�a Gly 287 và psi angle (liên k�t C�-N) và psi
angle (liên k�t C�-C) c�a Asp251 là -108 và 5o, m�t cách tương
�ng. M�c dù c�u trúc tinh th� c�a d�ng oxy hóa v�n chưa �ư�c bi�t,
phân t� oxygen �ư�c coi là �ư�c gói trong túi oxygen b�i nh�ng
g�c acid amin � vùng này. Trong s� nh�ng g�c không phân c�c,
Asp251 ��ng ra ngoài ch� như m�t g�c ion hóa, và v� trí này ch�
y�u là Asp ho�c Glu trong gia �ình Cyt-P450. Thr 252 h�u như
không bi�n ��i trong các Cyt-P450 nh�n ch�c n�ng như là m�t ch�t
cho proton và/ ho�c m�t ch�t xúc tác acid bazơ trong bư�c chuy�n
hóa liên k�t O-O c�a ph�n �ng monooxygenase. Thr 252 �ã bi�n
��i thành A, V ho�c S. T�t c� nh�ng enzyme bi�n ��i trong s� có
m�t c�a d-camphor ��u t�n t�i quang ph� h�p th� h�u h�t khác bi�t
v�i quang ph� c�a enzyme d�i trong nh�ng d�ng ferric, ferrous,
oxygen hóa và CO-ferrous.
Trong m�t h� th�ng tái l�p v�i Pd và PdR, enzyme alanin tiêu
th� O2 � m�t m�c �� (1100/p'/hem)có th� so sánh v�i t�c �� c�a
enzyme d�i (1330/p'/hem) nơi s� lư�ng 5-exo-hydroxycamphor
�ư�c t�o thành ít hơn 10% so v�i s� t�o thành b�i enzyme d�i.
Kho�ng 85% oxy �ư�c tiêu th� �ã �ư�c tái t�o dư�i d�ng hydroxy
peroxide. Enzyme valin th� hi�n nh�ng ��c tính tương t�, nhưng
enzyme serin �ư�c t�n t�i th�c t� cùng m�t ho�t tính
monooxygenase như là ho�t tính c�a enzyme d�i.

Vì t�c �� t� oxy hóa c�a nh�ng (E) ��t bi�n là quá th�p �� tính
toán t�c �� tiêu th� oxygen toàn b�, s� t�o thành H2O2 �ư�c coi là
không b�i ngu�n này mà do s� phá v� c�u trúc c�a m�t h�n h�p
peroxid �ư�c t�o ra b�i s� kh� c�a d�ng b� oxygen hóa t� Pd b�
kh�. 252G, P ho�c C enzyme th� hi�n ��c tính tương t� v�i ho�t
tính c�a (E) 252A trong khi 252N (E) thì tương t� v�i typ d�i. Như
v�y, nhóm OH c�a Thr252 �óng vai trò quy�t ��nh trong s� phân


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

99

�ôi liên k�t O-O c�a O2 trong ph�n �ng oxygenase. Nh�ng nghiên
c�u gây ��t bi�n các v� trí c�a Cyt-P450 cam có th� xem thêm trong
Chương I và Chương II � cu�n sách này.
Nh:ng P;t biWn % liên kWt c ch&t
Dùng phương pháp phân tích c�u trúc tinh th� tia X, ngư�i ta �ã
ti�n hành quan sát các v� trí axit amin b� bi�n ��i � các v� trí như t�o
ra các protein v�i Y96F, V247A, V295I, R186H, D251N, T101,
I209L… so sánh ho�t tính enzyme bi�n ��i v�i typ d�i �� rút ra
nh�n xét v� vai trò c�a các axit amin này trong s� liên k�t v�i cơ
ch�t. Bư�c ��u nh�n th�y vai trò thi�t y�u c�a các axit amin � các v�
trí như 117, 209, 365. Ngư�i ta c�ng nh�n th�y là �� �áp �ng cho
nhi�u cơ ch�t khác nhau, các axit amin tham gia vào s� liên k�t c�a
cơ ch�t thư�ng n�m � các v� trí trong vùng “m�m d�o” có kh� n�ng
bi�n ��i cao.
4.2.5. Nh4ng h< th:ng Cyt-P450


các vi khu1n khác

SU thu` phân axit béo: P450(BM-1), P450(BM-2) và P450(BM-3)
Bacillus megaterium ATCC 14581 �ư�c bi�t là có ch�a CytP450 th�y phân axit béo. Fluco và cs s� d�ng ch�t chi�t không có t�
bào c�a vi khu�n �ã phát hi�n Cyt-P450 th�y phân axit béo hòa tan,
enzyme này xúc tác s� th�y phân �1, �2 và �3 c�a các acid béo
bão hòa, các alcohol và các amide. Enzyme �òi h�i m�t cách tuy�t
��i NADPH như là ch�t cho �i�n t�. S� th�y phân nhóm methyl t�n
cùng, �-1, �ã �ư�c quan sát. �i�u này ngư�c v�i Cyt-P450 th�y
phân acid béo � � ��ng v�t có vú, enzyme này c�ng th�y phân �-1.
Các enzyme th�y phân acid béo này là m�t h�n h�p c�a 3 CytP450 khác nhau, �ó là Cyt-P450 1, -2, và -3. Nhóm c�a Fluco �ã
tinh ch� Cyt-P450(BM)này. Cyt-P450(BM-1) tinh khi�t t� nó không có
ho�t tính monooxygenase � m�c có th� phát hi�n �ư�c trong h�
th�ng thí nghi�m chu�n ch�a NADPH v�i ho�c là myristate ho�c
palmitoleate làm cơ ch�t. Tuy v�y, Cyt-P450(BM-1) xúc tác c� hai s�
th�y phân epoxidation và hydroxylation c�a palmitoleate b�ng cách
s� d�ng iodosyl benzene- diacetate, ch�t này �ư�c bi�t là m�t ch�t
th� ph�, nó h� tr� s� th�y phân steroid và acid béo b�i m�t s� bi�n
��i c�a các lo�i Cyt-P450 khi không có NADPH, O2, ho�c các c�u
t� reductase / redoxin. M�i �ây, Fluco và cs �ã tách dòng gen CytP450(BM-1) t� DNA nhi�m s�c th� c�a B.megaterim ATCC 14581
DNA. Khung ��c m� mã hóa Cyt-P450(BM-1) mang 410 axit amin


100

Nguy�n Th� Ng�c Dao

v�i TLPT là 47,439.Trình t� axit amin c�a Cyt-P450BM1 tương t�
nhi�u v�i nh�ng Cyt-P450cam hơn là v�i b�t c� eukaryotes CytP450 nào và gen c�a nó khác rõ r�t v�i gen c�a Cyt-P450(BM-3).

Cyt- P450(BM-2) �ã �ư�c tách ra như là m�t c�u t� nh� hơn t�
Cyt-P450(BM-3) trong quá trình tinh ch� Cyt-P450(BM-1). CytP450(BM-2) �ã tinh ch� có kh�i lư�ng phân t� kho�ng 46 kDa và d�
nhiên b�n thân nó không bi�u hi�n ho�t tính th�y phân axit béo
trong h� th�ng thí nghi�m ch�a NADPH. Ngư�i ta còn bi�t ít v�
Cyt-P450(BM-2).
Cyt-P450(BM-3) th� 3 (là ch� y�u) có ��c trưng r�t thú v� có liên
quan t�i c�u trúc và kh� n�ng t�ng h�p c�m �ng.
C� BM-1 và BM-2 ��u có th� �ư�c kích thích t�ng h�p nhi�u
hơn 100 l�n b�i phenobarbital và nhi�u barbiturat khác. �ây là
trư�ng h�p ��u tiên �ư�c bi�t c�a monooxygenase ph� thu�c CytP450 �ư�c t�ng h�p b�ng barbiturat trong prokaryotes. Khi có m�t
NADPH và O2, BM-3 xúc tác s� th�y phân �-2 c�a axit béo bão
hòa, alcohols và amines và s� th�y phân c�ng như epoxi hóa axit
béo có m�t liên k�t không bão hòa như là axit palmitic. ��c trưng
khác duy nh�t c�a Cyt-P450(BM-3) là ��c tính �ã �ư�c t�o ra b�i m�t
polypeptid �ơn l� (MW: 119. 000) và có ho�t tính xúc tác ��c l�p.
Khi có m�t NADPH và O2, BM-3 có th� xúc tác s� oxygen hóa axit
béo mà không c�n thêm b�t c� protein nào khác, và có ho�t tính xúc
tác kho�ng 4.600nmol acid béo �ư�c thu� phân/nmol P450, làm cho
nó tr� thành Cyt-P450 monooxygenase ho�t ��ng nh�t �ư�c công
b� cho t�i nay. Ho�t tính cao c�a protein có th� �ư�c mô t� c�n c�
vào n�ng �� c�a nó là 1 mole FAD và FMN/mole heme và vai trò
c�a Cyt-P450 NADPH-reductase và Cyt-P450 trên s�i peptid �ơn.
Cyt-P450(BM-3) �ư�c tiêu hoá h�n ch� b�ng trypsin d�n t�i 2 �o�n
polypeptid kho�ng 66.000 và 55.000 Da, �o�n th� nh�t �ư�c t�o ra
t� ��u C t�n c�a Cyt-P450(BM-3) ch�a c� FAD và FMN nhưng không
có hem và �o�n sau �ư�c xác ��nh là ch�a hem và có kh� n�ng g�n
v�i acid béo. Protein 55 kDa d�ng b� kh� g�n CO th� hi�n m�t peak
� 446 nm ��c hi�u cho Cyt-P450.
Cu�i cùng, Fulco và cs �ã thành công trong vi�c tách dòng gen
Cyt-P450(BM-3) nguyên v�n và �ã xác ��nh trình t� axit amin ��y ��

c�a nó. S� li�u v� trình t� d� ki�n là 1048 g�c axit amin v�i TLPT
là 117,641. Trình t� axit amin c�a �o�n Cyt-P450 có m�t � vùng Nt�n c�a Cyt-P450(BM-3) là tương t� nhi�u hơn (kho�ng 25%) v�i


Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

101

trình t� c�a Cyt-P450cam. �o�n có NADPH – Cyt-P450- Reductase
có kho�ng 33% trình t� gi�ng v�i trình t� c�a gen Cyt-P450 ��ng
v�t có vú.
S� d�ng m�t plasmid tái t� h�p mang gen mã hóa Cyt-P450(BM-3),
Boddupalli và cs �ã bi�u hi�n Cyt-P450(BM-3) trong E.coli �� t�o ra
kho�ng 20% protein hòa tan hoàn toàn và Cyt-P450(BM-3) tinh s�ch.
S� t�ng h�p Cyt- P450(BM-3) ti�n hành v�i ��i ch�ng dương tham
gia vào ít nh�t 2 vùng �i�u hòa (R1 và R2) cái này b�ng qua kho�ng
1 Kb c�a vùng 5'-flanking c�a gen v�i vùng gen tương tác v�i
protein ho�t ��ng v� trí trans.
Steroid Hydroxylase (15-j): Cyt-P450meg
Gustafson và cs �ã xác ��nh r�ng Steroid hydroxylase c�a d�ch
chi�t vô bào c�a ch�ng B.megatermin ATCC 13368 là Cyt- P450
ch� th�y phân 3-oxo-�4-steroids (như là progestesone) � v� trí 15�.
Cyt-P450meg này �ã �ư�c tinh ch� hoàn toàn và TLPT là 52kDa �ã
�ư�c tính toán cho hemoprotein này. 15�-Steroid Hydroxylase �òi
h�i 3 c�u t� cho ho�t ��ng xúc tác: 1 Flavoprotein ch�a NADPH
ph� thu�c FMN (megaredoxin reductase), 1 protein Fe-S
(megaredoxin) và Cyt P450meg. �� tìm ki�m các ch�t kích thích
t�ng h�p, m�t s� lo�i như steroids, phenobarbital, axit béo… �ã

�ư�c kh�o sát nhưng chưa có ch�t nào có kh� n�ng kích thích t�ng
h�p Cyt P450meg.
M�t �i�u thú v� là c� megaredoxin và metochondrial
adrenodoxin (t� ti th� tuy�n thư�ng th�n) cùng bi�u hi�n ho�t tính
chéo trong h� th�ng khác nhau và r�ng megaredoxin reductase có
th� �ư�c thay th� b�ng adrenodoxin reductase ho�c NADPH-Cyt
P450- Reductase t� microsome gan th�. Ví d�, megaredoxin
reductase cho �i�n t� ��n Cyt P45011� và Cyt-P450LM-3 microsome
gan th�, ch�ng t� r�ng chu�i v�n chuy�n �i�n t� c�a h� th�ng th�y
phân steroid trong B.megatermin ��c hi�u không cao, ngo�i tr� c�u
t� terminal Cyt-P450.
Alkane Hydroxylase
Có hai loài vi sinh v�t s�n xu�t ra Alkane Hydroxylase ph�
thu�c Cyt-P450 �ã �ư�c bi�t cho ��n nay. M�t là Rhodococcus
rhodochrous ATCC 19067, �ã �ư�c x�p lo�i là Coryne bacterium,
loài th� 2 là Acinetobacter calcoaceticus.
Cardini và Jurtshuk �ã tìm th�y m�t Hydroxylase n-octan ph�
thu�c vào Cyt-P450 t� rhodochrous m�c trong môi trư�ng ch�a n-


102

Nguy�n Th� Ng�c Dao

octane như là ngu�n carbon duy nh�t cho s� phát tri�n. Ho�t tính
th�y phân �ư�c t�o ra b�i n-octane là 6 l�n cao hơn so v�i ch�t kích
thích t�ng h�p là acetate. D�ch chi�t vô bào t� nh�ng t� bào b� phá
v� b�i siêu âm �ã th�y phân n-octane �� t�o ra 1-octanol như là m�t
s�n ph�m duy nh�t trong s� có m�t c�a NADPH, O2 và 1 phân �o�n
riêng bi�t có s� kh� ��c hi�u th� hi�n quang ph� phân bi�t v�i CO

xác ��nh r�ng h� th�ng này là 1�-Hydroxylase ph� thu�c Cyt-P450.
H� th�ng th�y phân c�a R.rhodochrous �ư�c �ưa ra g�m m�t
NADPH- Cyt P450- Reductase. (1 FAD-FMN protein) và m�t CytPP450 tương t� như h� th�ng � microsome ��ng v�t có vú. Ngư�i
ta nh�n th�y r�ng vi khu�n như v�y có kh� n�ng m�c trong môi
trư�ng ch�a nh�ng n-alkane khác nhau t� C3 ��n C18 c�a nh�ng
alkane không bão hòa dài hơn 10 carbon ho�c th�m chí c�
chloroalkanes như là 1-chorooctane và 1 chlorooctadecane.
Aspesge và cs �ã phát hi�n ra m�t ch�t có kh� n�ng t�ng h�p
hexadecane và Cyt-P450 hòa tan t� loài Acinetobactes
calcoaceticus EB 104. Không có s� h�n ch� xúc tác, Cyt-P450 �ã
�ư�c kích thích t�ng h�p b�i n-alkane t� hexan thành hexadecan,
nonance và decance là nh�ng ch�t kích thích t�ng h�p ho�t ��ng
nh�t trong s� chúng. S� t�ng h�p Cyt-P450 c�ng �ã �ư�c kích thích
b�i nh�ng h�p ch�t không có liên quan v�i n-alkane, ví d� như
biphenylidence, phenanthrene, nhưng không b�i Phenobarbital.
Nghiên c�u m�i �ây cho th�y r�ng Cyt-P450 c�a A.celloacetius
th�y phân C t�n c�a n-alkane và r�ng h� th�ng Cyt-P450 �Hydroxylase �ư�c t�o ra b�i 3 c�u t� NADH-feredoxin reductase,
feredoxin và Cyt-P450.
Benson và cs th�y s� có m�t c�a n-alkane Hydroxylase �- 1 mã
hóa b�i gen alkB trên OCT plasmid c�a P.putida. Nh�ng enzyme
này không ph�i là protein ph� thu�c Cyt-P450 nhưng là m�t protein
g�n màng v�i TLPT là 41kDa.
Linalool 8-Methyl Hydroxylase: Cyt-P450lin
Lindalool 8-Methyl Hydroxylase (P450lin) và các c�u t� liên
quan c�a nó �ã �ư�c tinh ch� b�i Ulah và cs t� Pseudomonas
putida (incognita), enzyme này �ã �ư�c tách b�i Madyastha và
cs. H� th�ng Cyt- P450lin ch�a 3 protein như là CytP450cam.TLPT c�a NADH-LIN-red. là 44.000, c�a LIN-redoxin
là 11.000 và c�a Cyt-P450lin là 46.000, r�t g�n v�i s� li�u c�a h�
th�ng th�y phân c�a Cyt-P450cam.



Ch

ng IV. H� th�ng Cytochrome-P450 � vi sinh v�t và th�c v�t

103

M�c dù có s� gi�ng nhau v� hóa h�c và v�t lý gi�a camphor và
linalool c�a terpence, nhưng không có cái nào trong 3 lin-protein
th� hi�n ho�c ho�t tính mi�n d�ch chéo ho�c ho�t tính xúc tác trong
h� th�ng tái l�p d� h�p t�. Các ch�t kích thích t�ng h�p các enzyme
này là acyclic, ho�c cyclicterpenes như là linalool, geraniol, nerol,
citronellol ho�c limonene và s� kích thích t�ng h�p c�a h� th�ng
này nh�y c�m v�i glucose, 8-methyl linalool �ư�c oxy hóa thành
linalool-8-carboncylic acid qua 8-alcohol và 8-aldehyde c�a nó.
Ngư�i ta nh�n th�y r�ng � vi khu�n, t�n t�i h� th�ng tương t� CytP450 th�y phân m�t g�c methyl � v� trí 10 c�a linalool.
p-Cymene-7- Hydroxylase: Cyt-P450cym
Bhattacharyya và cs �ã phân l�p Pseudomonat, ch�ng PL,
ch�ng này lên men � và �-pinence. Enzyme có kh� n�ng �ư�c t�ng
h�p c�m �ng và nh�y v�i glucose. Cyt-P450cym c�a Pseudomonas
putida PL-W ho�c dòng JT-101 ( cùng m�t dòng như trên) có kh�
n�ng phát tri�n trên P-cymene (4-isopropyl-toluene) �ư�c coi là Pcymene-hydroxylase và enzyme th�y phân P-cymene t�o thành
cumic alcohol (4-isopropyl-benzyl alcohol). P-putida JT-810 �ư�c
tách b�i Ribbon và cs c�ng có kh� n�ng m�c trên P-cymene và
bư�c kh�i ��u �ư�c xúc tác b�i m�t enzyme có th� là ph� thu�c
Cyt-P450.
Dealkylase
Castwright và Broadbent �ã tách và tinh s�ch m�t O-dealkylase
ph� thu�c Cyt-P450 t� Nocrsdia srtain NHI. Cyt-P450 kh� alkyl
c�a p-alkylphenyl ethers như là axit anisinic và isovarilate. Enzyme

này �ư�c t�o ra t� ít nh�t hai c�u t�: Reductase ch�a flavin ��c hi�u
NADH (MW >70.000)và Cyt-P450pda (MW: 45,000). Dardas và cs
�ã phân l�p Moraxella SP, loài này có th� m�c trên guaiacol
(2 methoxy- phenol) ho�c 2-ethoxyphenol như là m�t ngu�n
carbon. Loài vi khu�n này t�o ra m�t O-demethylase ph� thu�c CytP450.
P450S tY Rhizobium Japonicum
Appleby th�y r�ng Cyt P450 có � dòng vi khu�n Rhizobium c�
��nh ��m (dòng CC705), và �ã ti�n hành xác ��nh �ư�c 6 CytP450(a,b,c1 - c4), tinh ch� �ư�c Cyt-P450a,b,c1. T�t c� các Cyt-P450
�ư�c tinh s�ch có TLPT 45,000. Phân tích axit amin c�a các Cyt-


×