Hóa sinh học thực nghiệm chương 1 2

HÓA SINH HỌC THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 1. NHỮNG NGUYÊN TẮC VÀ CHUẨN BỊ CƠ BẢN TRONG CÁC NGHIÊN
CỨU HÓA SINH HỌC
1. Những nguyên tắc an toàn khi làm việc với các phòng thí nghiệm hóa sinh học.
- Cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định của phòng thí nghiệm
- Một số hóa chất có độc tính cao, có thể gây bỏng, gây mê, gây dị ứng hoặc có ảnh hưởng

-

-

-

2.
3.

a.
b.
c.
d.

nghiêm trọng, lâu dài đến sức khỏe con người cần được bảo quản đúng nguyên tắc, sử
dụng phương tiện bảo vệ thích hợp khi tiếp xúc.
Khi có sự cố làm đổ hóa chất rat ay, chân, quần áo hay ra phòng thí nghiệm thì phải dùng
các biện pháp sơ cứu thích hợp để nhanh chóng hạn chế tác hại và ngay sau đó phải báo
cho cán bộ hướng dẫn hoặc những người có chuyên môn hay nghiệp vụ để xử lý.
Các hóa chất phóng xạ có những quy định riêng và khi làm việc với các chất phóng xạ
phải đọc kỹ các quy định về an toàn phóng xạ và phải được học qua lớp an toàn phóng xạ
do những tổ chức có thẩm quyền huấn luyện.
Các loại tế bào mang thể tái tổ hợp và nhiều phế thải của thí nghiệm cần được xử lý và

thải bỏ theo những phương thức phù hợp để tránh gây ra những tác hại đến con người và
môi trường.
Bảo quản và sử dụng hóa chất
Bảo quản và sử dụng hóa chất đúng là điều kiện đầu tiên đảm bảo thí nghiệm thành công
của thí nghiệm.
Bảo quản và cất giữ hóa chất theo đúng yêu cầu của hãng sản xuất hay chỉ dẫn của các
sách tra cứu.
Cần sử dụng các hóa chất đạt độ tinh khiết phù hợp theo yêu cầu thí nghiệm.
Khi pha hay chuẩn bị hóa chất cần lưu ý nồng độ hòa tan tối đa của các chất khác nhau
trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol,…..) là rất khác nhau.
Thời gian sử dụng và bảo quản hóa chất tùy thuộc vào nồng độ của hóa chất hoặc loại
hóa chất
Một số hóa chất phải chuẩn bị ở dạng vô trùng: dùng nồi hấp hoặc màng lọc tùy theo loại
hóa chất.
Hạn chế tối đa làm nhiễm bẩn hóa chất trước, trong khi sử dụng. phần lớn vật tư tiêu hao
dùng cho hóa sinh học và sinh học phân tử chỉ nên dùng một lần và ở dạng vô trùng.
Cách chuẩn bị một số hóa chất và dung dịch thường dùng.
Một số nồng độ
3.1 Nồng độ phần trăm
Nồng độ phần trăm theo thể tích (w/v): là số gam chất tan trong 100ml dung dịch. VD:
pha 80ml dd Na2CO3 2,5%
Nồng độ phần trăm theo khối lượng (w/w): là số gam chất tan trong 100g dung dịch. VD:
pha 250ml dd Na2CO3 14%.
Nồng độ phần trăm theo thể tích (v/v): là số ml chất đó trong 100ml dung dịch.
Nồng độ mg% có nghĩa là số mg chất đó trong 100g nguyên liệu hay hỗn hợp.


e. Nồng độ % bão hòa là nồng độ % so với khả năng hòa tan tối đa của chất đó trong dung

dịch.

f. Nồng độ part per million (ppm) là phần chất đó trong 1 triệu g.
3.2 Nồng độ phân tử gam M = mole/L: là số phân tử gam chất tan có trong 1 lít dung dịch
VD: NaOH 0,3M, có nghĩa là có 0,3x40=12g NaOh trong 1 lít dung dịch.
3.3 Nồng độ đương lượng N là số đương lượng gam chất tan có trong 1 lít dung dịch
a. Với acid thì nồng độ đương lượng được tính bằng số phân tử gam chất tan chia
cho số ion H+ tham gia phản ứng trao đổi. VD: HCl 1N, tức là có 36,5g HCl trong
1 lít dung dịch; H2SO4 1N, tức là có 98g:2=49g H2SO4 trong 1 lít dd.
b. Với bazơ thì nồng độ đương lượng được tính bằng số phân tử gam chia cho số
nhóm hydroxyl (OH-) trong phân tử chất đó. VD: NaOH 2N, tức là có
2x(40:1)=80g NaOH trong 1 lít dung dịch; Mg(OH)2 0,5N tức là có
0,5x(41:2)=10,25g Mg(OH)2 trong 1 lít dd.
c. Với chất oxy hóa-khử như KmnO4 trong phản ứng với H2O2 …
Ngoài ra, hiện nay người ta còn dùng nồng độ “x” vì loại dung dịch này chứa
nhiều thành phần khác nhau, việc liệt kê đầy đủ thành phần, nồng độ sẽ mất thời
gian nên các đệm này có tên chung hoặc theo ký tự sao cho dễ thực hiện, theo dõi.
Nồng độ làm việc là nồng độ 1x.
Chuẩn bị nhanh các dung dịch từ nồng độ các nồng độ đã biết.
a. Pha loãng nồng độ của một dung dịch ra n lần: thì ta chỉ cần lấy n-1 thể tích dung môi và

cho thêm 1 thể tích dung dịch cần pha loãng sẽ được dung dịch mới có nồng độ nhỏ đi n
lần. VD: Pha ATP 200mM thành ATP 2,4mM, ta lấy 200:2,4=83,3 lần. Ta lấy n(83,3)1=82,3 thể tích (dung môi, nước) và bổ sung 1thể tích ATP 200mM vào, lắc đều, ta sẽ có
dung dịch ATP 2,4mM.
b. Pha một dung dịch có nồng độ phần trăm tương ứng từ một dung dịch có nồng độ cao
hơn: Ta cần pha X% từ dung dịch Y% có nồng độ cao hơn thì ta lấy Xml dung dịch Y%
bổ sung thêm nước đến Yml.
Cách chuẩn bị một dung dịch đệm: có 2 cách
Cách 1. Pha hai thành phần của đệm ( một có tính acid, một có tính bazo) sau đó trộn chúng lại
với nhau theo tỉ lệ được ghi trong các bảng đệm để có dung dịch đệm với pH và nồng độ mong
muốn.
Cách 2: Tính toán nồng độ và thể tích cần pha của đệm sau đó cân lượng hóa chất cần thiết của

thành phần thứ nhất, hòa tan trong một thể tích nước vừa phải sau đó bổ sung từ từ thành phần
thứ hai để đưa về giá trị pH cần pha, sau đó thêm nước để đạt thể tích tính toán ban đầu.
Lưu ý khi sử dụng đệm:
-

Đệm chỉ có khả năng đệm (duy trì pH hỗn hợp phản ứng ổn định) trong một vùng pH
nhất định, thường là trong phạm vi trên dưới 1 đơn vị pH so với giá trị pKa của đệm.


-

-

•
-

pH của một số đệm thay đổi theo nhiệt độ, độ pha loãng hay khi được bổ sung một số
thành phần khác. Chính vì vậy, cần kiểm tra pH của dung dịch đệm khi thay đổi nhiệt độ,
pha loãng hay bổ sung thêm chất nào đó.
Một số đệm có thể hấp thụ ánh sáng tử ngoại, can thiệp vào phân tích, có thể thâm nhập
qua màng tế bào và gây độc.
Trong một số phản ứng đệm phản ứng thường rất phức tạp, ngoài dung dịch đệm đảm bảo
sự ổn định của pH thì người làm việc phải bổ sung thêm các chất khác như: NaCl,KCl,
muối kim loại, gelatin, albumin…
Các tính chất của hệ thống đệm tốt:
pKa nằm ở vùng 6 - 8
Có độ hòa tan cao trong các hệ thống với dung môi chủ yếu là nước
Không bị hoặc ít bị vận chuyển bởi các màng sinh học
Bị ảnh hưởng tối thiểu bởi các muối.
Ít bị ảnh hưởng khi phân ly do thành phần ion, hay khi thay đổi nồng độ, nhiệt độ.

Không tạo phức giữa đệm và ion kim loại.
Bền vững về mặt hóa học
Ít hấp thụ ánh sáng tử ngoại và nhìn thấy
Sẵn có ở dạng tinh khiết.

CHƯƠNG 2. CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM THÔNG THƯỜNG
1. Thu thập, chuẩn bị và bảo quản các mẫu nghiên cứu.
a. Thu thập mẫu nghiên cứu.
- Mẫu nghiên cứu phải có nguồn gốc, lý lịch rõ ràng.
- Mẫu phải đủ về số lượng, chủng loại, khối lượng để triển khai đủ tạo ra số liệu tin cậy.
- Mẫu được bảo quản phù hợp để không bị biến đổi hoặc hạn chế tối đa những thay đổi sau

•
-

lấy mẫu
b. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu.
Các hợp chất sinh học tồn tại ở một trong hai dạng ngoại bào hoặc nội bào. Việc thu nhận
các hợp chất ngoại bào thường dùng ly tâm hoặc lọc để loại bỏ tế bào và các chất không
tan khác.Tuy vậy, nhóm chất ngoại bào chỉ chiếm một phần rất nhỏ so với các chất nội
bào. Để thu dịch chiết tế bào hay mô, cần có phương pháp phá vỡ tế bào/mô phù hợp.
Các phương pháp chính được dùng:
Nghiền đồng thể: sử dụng máy nghiền mô bằng tay hay gắn mô tơ…
Siêu âm: phá vỡ bằng cách tạo ra sự va đập của mẫu do tác động rung siêu âm tạo ra.
Thay đổi áp suất đột ngột: ép mẫu với một áp suất lớn rồi thả ra đột ngột.
Lắc hay va đập với cát thủy tinh: dùng máy làm vỡ hạt/tế bào tạo lực va đập, đồng thời
trong mẫu có thêm cát thủy tinh thì mô và tế bào bị phá vỡ rất nhanh.
Phá vỡ bằng enzyme: Sử dụng enzyme phân hủy thành tế bào lysozyme và mutanolysin.
Phá vỡ bằng chất tẩy rửa: Một số chất tẩy rửa có thể phá vỡ các tế bào hay cơ quan tử.
Phá vỡ bằng áp suất thẩm thấu: VD hồng cầu

Phá vỡ bằng làm đông – làm tan đột ngột: Là pp dùng sự thay đổi nhiệt độ từ chỗ rất lạnh
để tế bào bị đông cứng sau đó cho ngay vào nhiệt độ làm tan đá để phá vỡ tế bào.
c. Bảo quản mẫu nghiên cứu:


-

Các mẫu sinh học rất dễ bị biến đổi trong quá trình bảo quản, vì vậy sử dụng biện pháp
bảo quản thích hợp cũng là vấn đề hết sức cần thiết.
Với các mẫu sinh học thông thường như lá, quả, mô động vật, dịch nuôi cấy vi khuẩn …
bảo quản ở 40C. Hạt hay các mẫu mô thực vật (lá, thân) đã được phơi khô bảo quản ở
nhiệt độ phòng. Những mẫu vật cần bảo quản lâu dài, dịch chiết tế bào, rất nhiều chế
phẩm enzyme cần bảo quản ở nhiệt độ rất thấp.

2. Bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả
a. Nguyên tắc chung: Để một nghiên cứu có kết quả tốt, người làm thí nghiệm phải xác định

rõ mục đích và các tiêu chí phải đạt được của nghiên cứu đó. Từ đó, xác định các nội
dung, phạm vi thí nghiệm cần thực hiện, xác đinh hay lựa chọn các phương pháp, kỹ
thuật phải sử dụng. Sau đó, lập kế hoạch thực hiện các thí nghiệm với các quy trình cụ
thể.
b. Xây dựng Protocol phân tích
- Nguyên tắc của phương pháp hay phép phân tích
- Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, máy móc và dụng cụ
- Cách làm hay các bước tiến hành
- Tính toán kết quả.
- Các vấn đề cần lưu ý
- Kiểm tra độ tin cậy của kết quả thu được.
3. Phân tích định tính và định lượng các hợp chất sinh học
Độ nhạy là giới hạn thấp nhất mà phép đo/phân tích vẫn đo/phân tích được một cách tin

cậy.
Độ đặc hiệu trong phép đo/phân tích một chất là giới hạn hay khả năng của phép đo/phân
tích cho phép phân biệt chất đó với chất khác, đặc biệt là các chất tương tự nó.
Mức độ tin cậy của các phân tích chính là khả năng lặp lại của thí nghiệm để cho cùng
kết quả.
Các phương pháp phân tích trong hóa sinh.
- Phương pháp chuẩn độ: La phương pháp có tính cổ điển dựa trên tương tác hóa học của
hợp chất quan tâm với một chất khác có nồng độ đã biết kèm theo một chất chỉ thị màu
để đảm bảo phát hiện đúng điểm dừng của phản ứng, từ đó tính ra lượng hay nồng độ của
chất quan tâm.
- Phương pháp đo quang phổ: Định lượng các chất bằng phép đo quang phổ là phương
pháp được sử dụng phổ biến nhất trong tất cả các phân tích hóa sinh do tính chính xác và
thuận tiện. Phương pháp này dựa trên sự hấp thụ ánh sáng của một số hợp chất tại vùng
bước sóng nhất định và hàm lượng của chất đó được tính ra theo nguyên tắc của định luật
Lambert Beer. Theo định luật này thì độ hấp thụ ánh sang của một chất tỷ lệ với nồng độ
của chất đó và được thể hiện qua công thức
A = logI0/I = ε.l.c
A: độ hấp thụ ánh sang

I0: Cường độ tia tới

ε: hệ số tắt phân tử gam

I: Cường độ ánh sáng truyền qua


l: độ dày của dung dịch

c: Nồng độ chất phân tích.

Hệ số tắt phân tử gam là độ hấp thụ của chất đó khi ở nồng độ 1M, sử dụng
cuvette đo có chiều dày dung dịch 1cm và trong các điều kiện nhiệt độ, pH xác
định.
Phương pháp huỳnh quang: Các pp đo huỳnh quang dựa trên đặc trưng của một số chất
có khả năng nhận ánh sáng kích thích ở mức năng lượng cao và bức xạ ra ánh sáng ở mức
năng lượng thấp hơn ở một bước sóng đặc trưng nên người ta sẽ định lượng được chất
cần quan tâm.
Phương pháp miễn dịch: Trường hợp chất cần xác định có tính kháng nguyên, thì người
ta có thể dựa vào tương tác kháng nguyên – kháng thể tương ứng tạo ra để định lượng
bằng kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme gọi tắt là ELISA ( Enzyme
linked Immunosorbant Assay). Kháng thể trong các phép phân tích này thường là kháng
thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao.
o

-

-

Minh họa: CPT+KTSC - KTTC+E — cơ chất - sản phẩm có màu.
Enzyme có khả năng chuyển hóa cơ chất không màu thành sản phẩm có màu. Nồng độ
chất cần phân tích sẽ được định lượng qua nồng độ chất màu tạo thành và được đo theo
nguyên tắc đo quang phổ hấp thụ.
-

-

Phương pháp phóng xạ: PP dựa trên cơ sở đánh dấu hợp chất quan tâm bằng một trong
những nguyên tố phóng xạ.Nguyên tố đồng vị phóng xạ là nguyên tố có hạt nhân không
bền vững, nó phân rã và kèm theo sự bức xạ ra các hạt hay các tia và sự bức xạ này có thế
được đo bằng thiết bị phóng xạ.

Phương pháp khổi phổ MS: Khối phổ là phổ về khối lượng. Nguyên lý của phép đo khối
phổ là: khi hai phân tử A và B được xác định có khối lượng hoàn toàn giống nhau thì có
thể cùng một chất, đặc biệt nếu phân tử chất A được cắt thành các mảnh nhỏ, sau đó phân
tích khối lượng của các mảnh nhỏ và thấy phổ khối lượng thu được giống hoàn toàn khối
phổ chất B đã biết, thì chắc chắn A và B là một.
o Phân tích khối phổ bằng sắc ký khí (Gass chromatography mass spectrometryGCMS) căn cứ vào thời gian và độ lớn của đỉnh của chất này so với chất chuẩn có
hàm lượng đã biết người ta có thể nhận biết và định lượng ra chất quan tâm.
o MALDI:(Matrix assisted laser desortion inoization) phương pháp ion hóa phản
hấp thụ laser hỗ trợ bằng chất nền. PP MALDI các ion protein được tạo ra được
gia tốc qua một trường điện từ và chúng đi qua một ống bay để đến một detector.
Như vậy thời gian bay (TOF) của một ion protein hay peptid trong ống là thước
đo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) của nó.
o Và, ESI MS ( Electrospray ionization mass spectrometry) phân tích khối phổ ion
hóa phun điện tử. Dung dịch protein được phân tán thành những giọt nhỏ tích điện
nhờ cho đi qua một kim nhỏ và trong một điện trường điện thế cao.


-

4.
a.
-

b.
-

5.
a.

Cộng hưởng từ hạt nhân: Là PP đo phổ hấp thụ với một số đặc trưng tương tự như đo phổ

nhìn thấy và tử ngoại. Nguyên lý cơ bản dựa trên đặc trưng của tất cả hạt nhân đều tích
điện dương.
Các biện pháp nâng cao tính chính xác của phân tích.
Các phương pháp nâng cao độ nhạy của phép đo.
Cô đặc mẫu: Khi giới hạn của phương pháp không thể cho phép phát hiện vì hàm lượng
của chất cần phân tích quá nhỏ thì cô đặc mẫu là phương pháp đơn giản để cho phép phân
tích được thực hiện có kết quả
Sửa dụng chất đồng vị phóng xạ:
Sử dụng chất phát huỳnh quang
Nhân bản
Tích lũy hay quay vòng
Các phương pháp nâng cao độ đặc hiệu của phép đo
Sử dụng các phản ứng đặc trưng của chất cần phân tích để tăng tính đặc hiệu
Dựa trên các tương tác đặc hiệu sinh học: Các tương tác sinh học là cơ sở để phát triển
các phép đo có tính đặc hiệu cao như: tương tác giữa enzyme cà cơ chất hay chất ức chế
cạnh tranh, giữa enzyme và cofactor hay coenzyme, giữa kháng nguyên và kháng thể,
giữa hormone và vitamine với các thụ thể tương ứng, hay giữa các đoạn oligonucleotid có
trình tư bổ sung lẫn nhau.
Phân tích hoạt độ enzyme
Nguyên tắc:

E + S ↔ ES↔ES* ↔ E + P
E: Enzyme

S: cơ chất

P: sản phẩm

ES: Phức chất hình thành giữa enzyme và cơ chất
ES*: là phức chất giữa enzyme với cơ chất mà trong đó cơ chất đã được biến đổi gần như sản

phẩm của phản ứng.
Hoạt độ enzyme có thể được xác định bằng cách phân tích cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo
thành của phản ứng trong một đơn vị thời gian, hoặc kết hợp cả hai.
Hoạt độ xúc tác của enzyme được tính bằng một đơn vị hoạt độ. Một đơn vị hoạt độ enzyme là
lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một micromol cơ chất thành sản phẩm trong
thời gian một phút ở điều kiện phân tích.
Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme trên một miligram hay gram
protein. Hoạt độ riêng phản ánh mức độ tinh sạch của chế phẩm enzyme.
Để phân tích chính xác hoạt độ enzyme thì trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme cần phải sử
dụng nồng độ dư thừa cơ chất và cofactor (nếu enzyme cần cofactor) và chỉ để phản ứng diễn ra
trong một khoảng thời gian xác định.


b. Các phương pháp phân tích hoạt độ enzmyme:
- Phân tích liên tục: là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi liên tục hay sản phẩm tạo thành

một cách liên tục theo thời gian. Áp dụng khi không có chất hay cách làm ngừng phản
ứng thích hợp hoặc được áp dụng với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điều
kiện phân tích.
- Phân tích gián đoạn: là pp cho enzyme tác dụng với cơ chất ở điều kiện thích hợp và sau
một khoảng thời gian nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme, sau đó đo lượng cơ chất
còn lại hoặc sản phẩm tạo thành.
- Ngoài hai pp chủ yếu ở trên còn có một số phương pháp khác như: PP đo độ nhớt, pp
phân cực kế, pp đo áp suất khí……Tùy theo enzyme mà người ta thiết kế những cơ chất
phù hợp và pp thích hợp để định tính hay định lượng enzyme cần phân tích.
c. Một số lưu ý khi phân tích hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme.
- pH và nhiệt độ
- Cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm nền
- Thời gian phản ứng của các mẫu phân tích phải đồng đều nhau
- Phải luôn luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số

- Phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp
CHƯƠNG 3. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG LY TÂM
1. Giới thiệu chung về ly tâm
2. Các loại ly tâm
3. Một số điều cần lưu ý khi dùng ly tâm

CHƯƠNG 4. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG SẮC KÝ
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Nguyên tắc chung của các phương pháp sắc ký
Sắc ký bản mỏng
Sắc ký lọc gel
Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký ái lực
Một số loại sắc ký khác

CHƯƠNG 5. PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG ĐIỆN DI
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Giới thiệu chung về điện di

Điện di gel polyacrylamide
Điện di gel agarose
Điện di xung trường
Điện di miễn dịch và thẩm tách miễn dịch
Điện di hai chiều

CHƯƠNG 6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC
THƯỜNG GẶP
1. Phương pháp định lượng Protein


2.
3.
4.
5.
6.
7.

Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp tách chiết RNA
Phương pháp định lượng acid nucleic
Phân tích một số hợp chất sinh học phân tử nhỏ
Phân tích hoạt độ một số enzyme và chất ức chế enzyme
Tách chiết và tinh sạch protein