Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà muscadomestica trong vi khuẩn escherichia coli

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------***-----------

LUẬN VĂN CAO HỌC

Mã số chuyên ngành: 60420103

Đề tài:
Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt ấu trùng ruồi nhà Musca
domestica trong vi khuẩn Escherichia coli

Học viên: Đặng Văn Tiến
Lớp: CHST _ K15
Hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính

Hà Nội, 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis. .................................................................. 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis. ................................3
1.1.2. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam. ................................................4

1.1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt. ........................................................5
1.1.3.2. Đặc điểm hình thái. ..............................................................................................6
1.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa................................................................................................7
1.1.4. Đặc điểm phân loại. ................................................................................................7
1.1.5. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. ........................................................11
1.1.6. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng............................................15
2. ..................................................................................... 17
1.3. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm. ................................................................. 18
1.3.1. Phân loại khoa học của ruồi nhà (Musca domestica). ........................................19
1.3.2. Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica) ..........................................................19
1.3.3. Ảnh hưởng của ruồi đối với sức khỏe cộng đồng. ...............................................21
1.3.4. Một số phương pháp diệt và phòng chống ruồi hiện nay. ...................................22
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 24
2.1. Vật liệu. ............................................................................................................. 24
2.1.1. Sinh phẩm. .............................................................................................................24
2.1.2. Hóa chất và thiết bị. ..............................................................................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. .................................................................................. 27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2.2.1. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn
dịch..............................................................................................................................27
2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học. ...................................................................27
2.2.3. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn. ............................................29
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli.........................................................30
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen cry2A............................................................30
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose. .................................................................30
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen cry2.........................................................................31
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng. ...............32

2.2.9. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % ........................................32
2.2.10. Phương pháp biểu hiện gen ................................................................................34
2.2.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện .......................34
2.2.12. Xác định khả năng hoà tan của protein .............................................................35
2.2.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin ...............................35
CHƢƠNG 3:

ẢO LUẬN ........................................................... 37
Bacillus thuringiensis nghiên

cứu. .......................................................................................................................... 37
3.2. Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis

.... 38
Musca

domestica của các chủng Bt phân lập đƣợc. ............................................................ 40
3.4. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết
thanh bằng phƣơng pháp PCR. ................................................................................ 42
đọc trình tự gen cry2A. ............................................................... 43
2A. ...........................................................................................43
2A..........................................................................................45
3.6. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) .............. 48
3.6.1.Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry2A ............................................................48
3.6.2. Gắn đoạn gen cry2A vào vector biểu hiện pET22b(+)........................................49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

3.6.3. Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen cry2A ............................................50

3.6.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của cry2A trong plasmid tái tổ hợp ...................................50
3.6.4. Nghiên cứu biểu hiện gen cry2A trong E. coli BL21 ...........................................54
3.7. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin................58
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 60
4.1. Kết luận ............................................................................................................. 60
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 61
....................................................................................... 62

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính là người thầy đã
hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành khóa học và bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên
tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng
cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2013

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ết tắt

STT

ết đầy đủ

1

Bp

Base pair

2

Bt

Bacillus thuringiensis

3

CFU

Colony Forming Unit

4

dH2O

Deion water

5

DNA

Deoxyribonucleotide acid

6

dNTP

deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate

7

ĐC

Đối chứng

8

E. coli

Escherichia coli

9

EDTA

Ethylene diamine tetra- acetic acid

10

EtBr

Ethidium Bromide

11

kDa

Kilo Dalton

12

OD

Optical density - mật độ quang học

13

PCR

Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

14

SDS

Sodium dodecyl sulphate

15

Sol

Solution

16

TE

Tris EDTA

17

X-gal

5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bt

.

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi khuếch đại gen cry2A
Bảng 3.1: Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bt.
Bảng 3.2: Kết quả phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis bằng
phƣơng pháp huyết thanh.
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các
chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore)
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein tinh thể độc tố Cry.

Hình 1.5. Ruồi nhà (Con ruồi đực - Bên trái; Con ruồi cái - bên phải)
Hình 1.6. Vòng đời của ruồi nhà (Musca domestica)
Hình 1.7. Trứng của ruồi nhà (Musca domestica)
Hình 3.1. Hình dạng bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt
Hình 3.2. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh
dƣới kính hiển vi quang học
Hình 3.3. Ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của các
chủng Bt phân lập
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%
Hình 3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp pCR2.1- cry2A vào vi khuẩn E.coli DH5α
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmide từ các dòng khuẩn lạc pCR2.1 cry2A - LNT7.12 và pCR2.1 - cry2A - MSS8.4 trên agarose 1%.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen cry2A
Hình 3.8. So sánh trình tự gen của 2 chủng MSS8.4 và LNT7.12 với
AJ488143.1
Hình 3.9. sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen cry2A
Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt mở vòng vector pET22b(+)
Hình 3.11. Điện di sản phẩm cắt đoạn gen cry2A từ vector tái tổ hợp pCR2.1 –
cry2A
Hình 3.12. Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên môi trƣờng LBA
Hình 3.13. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose
Hình 3.16. Trình tự acid amin của protein Cry2A trên lý thuyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Hình 3.17. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21 trên môi
Hình 3.18. Điện di sự biểu hiện protein rCry2A trên gel 12,6 % polyacrylamide
Hình 3.19. Điện di protein tái tổ hợp Cry2A theo nhiệt độ trên gel 12,6 %
polyacrylamide
Hình 3.20. Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp Cry2A theo nồng độ IPTG

Hình 3.21. Điện di mẫu protein Cry2A theo thời gian trên gel 12,6 %
polyacrylamide
Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

MỞ ĐẦU
Ruồi nhà (Musca domestica) sống rất gần gũi với loài ngƣời trên toàn thế
giới. Khoảng 90 % ruồi hiện diện xung quanh con ngƣời. Chúng thƣờng đƣợc tì
vật sinh sống, nơi có nhiều thực phẩm và chất
thải. Sự có mặt của chúng là dấu hiệu của điều kiện mất vệ sinh vì chúng mang
theo nhiều chất bẩn và mầm bệnh. Ruồi không chỉ gây khó chịu cho con ngƣời làm
việc và nghỉ ngơi mà còn là vật trung gian lây truyền rất nhiều bệnh cho ngƣời,
động vật và cây trồng.
Do

tập tính

ruồi vận chuyển

mầm bệnh nhƣ

virus, vi khuẩn, trứng giun sán từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành và từ môi trƣờng vào
cơ thể con ngƣời. Ruồi truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy
hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae, lỵ,
tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus).
Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt ruồi nhà khác nhau mà con ngƣời áp
dụng. Biện pháp diệt ruồi nhà đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc

diệt ruồi. Tuy nhiên, những loại thuốc diệt ruồi hiện nay thƣờng có giá thành cao,
chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng
đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Để khắc
phục những tồn tại của thuốc diệt ruồi hóa học và các phƣơng pháp diệt ruồi truyền
thống, chúng ta cần tạo ra những chế phẩm sinh học vừa có tác dụng tiêu diệt hiệu
quả mầm bệnh, lại vừa thân thiện với con ngƣời, với môi trƣờng.
Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất, gram dƣơng đƣợc phát hiện và biết
đến từ năm 1901. Chúng có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả
năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời
và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Chế phẩm Bt đƣợc sử dụng lần đầu tiên
vào năm 1930 để kiểm soát loài sâu đục thân
Sau

Angasta kuehnella ở Châu Âu.
Bt

1


...
Bt
.

đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên

,

cứu, sản xuất

Bt và đƣa những kết quả nghiên cứu đó

ứng dụng vào đời sống.
Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ruồi nhà của các chủng Bt phân lập ở Việt Nam
là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh
phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ruồi. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen cry2 mã hóa protein diệt
ấu trùng ruồi nhà Musca domestica trong vi khuẩn Escherichia coli”.
Mục tiêu của đề tài:
1. Sàng lọc đƣợc các chủng Bacillus thuringiensis (Bt) có hoạt tính diệt ruồi
nhà (Musca domestica).
2. Tách dòng và đọc trình tự đƣợc Gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất,
lá có hoạt tính diệt ruồi nhà.
3. Biểu hiện đƣợc protein Cry2 diệt ấu trùng ruồi.
Để đạt đƣợc các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nhiệm sau:
1. Phân loại các chủng Bt bằng phƣơng pháp huyết thanh miễn dịch.
2. Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà.
3. Khuếch đại gen mã hóa protein độc tố diệt ấu trùng ruồi nhà

sử

dụng cặp mồi đặc hiệu.
4. Tách dòng gen cry2A mã hóa tinh thể protein diệt ruồi nhà.
5. Đọc trình tự gen cry2A và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen Quốc
tế.
6. Biểu hiện gen cry2A trong vi khuẩn E.coli BL21 (DE3).

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis.
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis.
Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đƣợc coi là
vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho
côn trùng.
Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis đƣợc bắt nguồn
ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20. Từ năm 1870 khi Loius Pasteur phát
hiện thấy một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus
bombyces. Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata nghiên cứu về
bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi
khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto. Đến mƣời
năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc nhà khoa học ngƣời Đức là E. Berliner
phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải, Anagasta kuhniella và ông đã
có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào
tử này. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensis do
phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức.
Năm 1927, Mattes và cộng sự đã phân lập lại Bt từ Anagasta kuhniella. Chế
phẩm Bt đƣợc sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm soát loài côn trùng hại
có tên là Angasta kuhniella, một loài sâu đục thân ở Châu Âu. Chế phẩm thƣơng
mại đầu tiên, đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938.
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có
bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu là do
tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử.
Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của Bt đã đƣợc sản
xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó, Howard Dulmage và

3


Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đƣợc bộ sƣu

tầm đầu tiên về các chủng Bt.
Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới
cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm
1970, Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng
cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm Bt.
Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bacillus thuringiensis
subsp. isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh.
Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc
trình tự. Từ đó một lƣợng lớn gen đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính của
chúng.
Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis
subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu
Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự
Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt subsp. sandiego và đã tổng hợp đƣợc chuỗi gen
độc tố của chúng.
Năm 1985, gen cry của Bt đƣợc chuyển vào cây trồng để diệt sâu.
Năm 1987, công ty Mycogen đã sản xuất chế phẩm dạng con nhộng Cellcap.
Trong những năm 1987 - 1992, ngƣời ta tiếp tục nghiên cứu và phát hiện thấy Bt có
khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến
thuộc bộ Hymenoptera.
Năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa vào sản xuất, từ
đó một chƣơng trình mới về ứng dụng Bt vào cây trồng - thực vật chuyển gen
(Genetically Modified Organisms - GMOs) [5]
1.1.2. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam.
Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bt và phải kể đến một chặng
đƣờng dài mà các nhà khoa học của Việt Nam nghiên cứu về thuốc trừ sâu sinh học

4

Bt. Trong 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bt các nhà khoa
học Việt Nam đã đạt đƣợc nhiều thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất và đƣa
những kết quả nghiên cứu đó ứng dụng vào đời sống, góp phần giảm thiệt hại kinh
tế cho ngành nông, lâm nghiệp [4].
Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu Bt đƣợc ứng dụng đầu tiên tại Viện bảo vệ thực vật
năm 1971. Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu sản
xuất chế phẩm Bt phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp lên men trên máy lắc và có
chế phẩm diệt sâu rất tốt [1].
Năm 1973 - 1976, Bt đƣợc sản xuất chủ yếu trên môi trƣờng đặc với giá thể là
agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác nhƣ: bã khô lạc, bột đậu tƣơng,
bột cá... Các chủng sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này có nguồn gốc chủ yếu từ
Trung Quốc. Các chế phẩm này đã đƣợc sử dụng cho vùng trồng rau ở ngoại thành
Hà Nội và đã thu đƣợc các kết quả tốt đẹp [2].
Năm 1982, Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo
phƣơng pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5 m3.
Từ năm 1984 - 1994, việc sản xuất chế phẩm Bt đã giảm sút bởi vì các chế
phẩm Bt sản xuất ra có chất lƣợng không cao do vậy tốc độ tiêu thụ giảm.
Trong những năm gần đây, việc ứng dụng Bt đƣợc mở rộng hơn. Nhiều tƣ liệu
nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đã đƣợc công bố. Các công trình tập trung chủ
yếu vào các nội dung chính nhƣ sự phân bố và đa dạng sinh học của các chủng Bt
phân lập tại Việt Nam và nghiên cứu về các gen mã hóa protein độc tố diệt côn
trùng cũng ứng dụng các protein này trong sản xuất chế phẩm sinh học [17, 18, 19,
20].
1.1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bt.
1.1.3.1. Vị trí phân loại.
Bacillus thuringiensis đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae,
ngành Firmicutes. Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi khuẩn

5

B. subtilis, B. cereus (vi khuẩn gây

), vi khuẩn B. anthracis (vi

khuẩn gây bệnh than). Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thƣờng đƣợc coi là vi khuẩn
đất. Chúng sống trong môi trƣờng đất, côn trùng và bề mặt tiếp xúc với côn trùng
[35].
1.1.3.2. Đặc điểm hình thái.
Bacillus thuringiensis hình que (Hình 1.1), có khả năng di động nhờ có tiên
mao mọc trên bề mặt tế bào, bắt màu Gram dƣơng. Vi khuẩn Bt hô hấp hiếu khí
hoặc kị khí không bắt buộc. Mỗi tế bào Bt có khả năng sinh bào tử và tin
khả năng diệt côn trùng. Kích thƣớc tế bào khoảng 0,8 1,4µm x 2,5 - 10µm [8].
Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thƣớc 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm,
quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào. Một đặc điểm
quan trọng là trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp
protein tinh thể. Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích
thƣớc và số lƣợng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung là có khả
năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng. Khi ở trong tế bào sinh dƣỡng, tinh thể
thƣờng nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và bào tử đều thoát ra ngoài.
Trong môi trƣờng lỏng Bt có khả năng chuyển động, khả năng này có đƣợc là
nhờ các lông roi (flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thƣớc lớn hơn 0,9 µm [54].

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis

6


Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (Crystal) và bào tử (Spore)
B. thuringiensis đƣợc xem nhƣ là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều

môi trƣờng khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ biến của Bt trong
môi trƣờng tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [16].
1.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa.
Bt không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng arrabinoza,
xylose, manitol, nhƣng tạo axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose. Có khả năng
thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng có chứa
0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà.
Không có khả năng khử amin của phenilalamin, không sử dụng axit citric, không
khử muối sunphat.
Bt có khả năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45oC. Nhiệt
độ tối ƣu là 28 - 30oC. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ƣu cho sự phát
triển của Bt là pH = 7. Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và
dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [5].
1.1.4. Đặc điểm phân loại.
Có rất nhiều phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis khác nhau [5]:
- Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và
Angus, 1958). Tuy nhiên phân loại theo phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc
các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

7


rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. thuringiensis,
B. mycoides, B. anthacis. Mới đây mới phát hiện thêm loài B. weihenstephanensis và
B. pseudomycoides [5, 8, 14].
- Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H.
- Phân loại theo ngoại hình enzyme lipase.
- Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực
khuẩn thể khác nhau.
- Phân loại theo nguồn bệnh.

- Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể.
Tuy nhiên, các phƣơng pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế.
Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại mới cho
Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính
diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động
vật chân khớp…Phƣơng pháp phân loại theo typ huyết thanh H đƣợc sử dụng chủ
yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao.
: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng
ngƣng kết. Kết quả của phản ứng là tạo ra cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm
có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Dƣới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang
học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động đƣợc.
Cho đến năm 2003, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 69 typ huyết thanh bao gồm 82
thứ huyết thanh khác nhau của Bt [6, 15] (Bảng 1.1). Đây là phƣơng pháp phân loại
đƣợc sử dụng phổ biến và là phƣơng pháp đáng tin cậy đƣợc trung tâm quốc tế
Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các
phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 [6, 47].

8


1.1:
Kháng
nguyên H

Thứ huyết
thanh

Bt

.

Ngƣời đầu tiên nghiên cứu

Code

1

thuringiensis

THU

Berliner 1915; Heimpel & Angus 1958

2

finitimus

FIN

Heimpel & Angus 1958

3a, 3c

alesti

ALE

Toumanoff & Vago 195; Heimpel & Angus 1958

3a, 3b, 3c

kurstaki

KUR

de Barjac & Lemille 1970

3a, 3d

sumiyoshiensis

SUM

Ohba & Aizawa 1989

3a, 3d, 3e

fukuokaensis

FUK

Ohba & Aizawa 1989

4a, 4b

sotto

SOT

Ishiwata 1905 ; Heimpel & Angus 1958

4a, 4c

kenyae

KEN

Bonnefoi & de Barjac 1963

5a, 5b

galleriae

GAL

Shvetsova 1959; de Barjac & Bonnefoi 1962

5a, 5c

canadensis

CAN

de Barjac & Bonnefoi 1972

6

entomocidus

ENT

Heimpel & Angus 1958

7

aizawai

AIZ

Bonnefoi & de Barjac 1963

8a, 8b

morrisoni

MOR

Bonnefoi & de Barjac 1963

8a, 8c

ostriniae

OST

Ren et al. 1975

8b, 8d

nigeriensis

NIG

Weiser & Prasertphon 1984

9

tolworthi

TOL

Norris 1964 ; de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10b

darmstadiensis DAR

Krieg de Barjac & Bonnefoi 1968

10a, 10c

londrina

LON

Arantes et al. (Không công bố)

11a, 11b

toumanoffi

TOU

Krieg 1969

11a, 11c

kyushuensis

KYU

Ohba & Aizawa 1979

12

thompsoni

THO

de Barjac & Thompson 1970

13

pakistani

PAK

de Barjac, Cosmao Dumanoir, Shaik & Viviani 1977

14

israelensis

ISR

de Barjac 1978

15

dakota

DAK

De Lucca, Simonson & Larson 1979

16

indiana

IND

De Lucca, Simonson & Larson 1979

17

tohokuensis

TOH

Ohba, Aizawa & Shimizu 1981

18a, 18b

kumamotoensis KUM Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

18a, 18c

yosoo

YOS

Lee, H. H et al. 1995

19

tochigiensis

TOC

Ohba, Ono, Aizawa & Iwanami 1981

20a, 20b

yunnanensis

YUN

Wan-Yu, Qi-Fang, Xue-Ping & You-Wei 1979

20a, 20c

pondicheriensis PON

Rajagopalan et al. (Không công bố)

21

colmeri

De Lucca, Palmgren & de Barjac 1984

COL

9


Kháng
nguyên H

Thứ huyết
thanh

Ngƣời đầu tiên nghiên cứu

Code

22

shandongiensis SHA

Wang Ying et al. 1986

23

japonensis

JAP

Ohba & Aizawa 1986

24a, 24b

neoleonensis

NEO

Rodriguez-Padilla et al. 1988

24a, 24c

novosibirsk

NOV

Burtseva, Kalmikova et al. 1995

25

coreanensis

COR

Lee H. H et al. 1994

26

silo

SIL

de Barjac and Lecadet (Không công bố)

27

mexicanensis

MEX

Rodriguez-Padilla and Galan-Wong (Không công bố)

28a, 28b

monterrey

MON Rodriguez-Padilla et al. (Không công bố)

28a, 28c

jegathesan

JEG

29

amagiensis

AMA Ohba (Không công bố)

30

medellin

MED

Orduz, Rojas, Correa, Montoya & de Barjac 1992

31

togucshini

TOG

Hodirev (Không công bố)

32

cameroun

CAM

Jacquemard 1990; Juarez-Perez et al. 1994

33

leesis

LEE

Lee H. H et al. 1994

34

konkukian

KON

Lee H. H et al. 1994

35

seoulensis

SEO

Lee H. H et al. 1995

36

malaysiensis

MAL

Ho (Không công bố)

37

andaluciensis

AND

Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996

38

oswaldocruzi

OSW

Rabinovitch et al. 1995

39

brasiliensis

BRA

Rabinovitch et al. 1995

40

huazhongensis

HUA

Dai Jingyuan et al. 1996

41

sooncheon

SOO

Lee H. H et al. 1995

42

jinghongiensis

JIN

Li Rong Sen et al. (in press)

43

guiyangiensis

GUI

Li Rong Sen et al. (in press)

44

higo

HIG

Ohba et al. 1995

45

roskildiensis

ROS

Hinrinschen, Hansen and Daamgaard (Không công bố)

46

chanpaisis

CHA

Chanpaisaeng (Không công bố)

47

wratislaviensis

WRA Lonc et al. 1997

48

balearica

BAL

Caballero et al. (Không công bố)

49

muju

MUJ

Seung Hwan Park et al. (Không công bố )

50

navarrensis

NAV

Caballero et al. (Không công bố)

51

xiaguangiensis

XIA

Jian Ping Yan (Không công bố)

52

kim

KIM

Kim et al. (Không công bố)

Seleena, Lee, H. L. & Lecadet 1995

10


Kháng
nguyên H

Thứ huyết
thanh

Ngƣời đầu tiên nghiên cứu

Code

53

asturiensis

AST

Aldebis, Vargas-Osuna & Santiago-Alvarez 1996

54

poloniensis

POL

Damgaard et al. (Không công bố)

55

palmanyolensis PAL

Santiago-Alvarez et al. (Không công bố )

56

rongseni

RON

Li Rong Sen (in press)

57

pirenaica

PIR

Caballero et al. (Không công bố)

58

argentinensis

ARG

Campos-Dias et al. (Không công bố)

59

iberica

IBE

Caballero et al. (Không công bố)

60

pingluonsis

PIN

Li Rong Sen (in press)

61

sylvestriensis

SYL

Damgaard (Không công bố)

62

zhaodongensis

ZHA

Li Rong Sen (in press)

63

bolivia

BOL

Ferrộ-Manzanero et al. (Không công bố)

64

azorensis

AZO

Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)

65

pulsiensis

PUL

Khalique F. and Khalique A. (Không công bố)

66

graciosensis

GRA

Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)

67

vazensis

VAZ

Santiago-Alvarez et al. (Không công bố)

68

thailandensis

THA

Chanpaisaeng et al. (Không công bố)

69

pahangi

PAH

Seleena and Lee H. L. (Không công bố)

1.1.5. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
Kích thƣớc hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7
triệu bp. Trên thế giới ngƣời ta đã mô tả đƣợc bản đồ cấu trúc gen tự nhiên cho một
số chủng Bacillus thuringiensis [26]. Thể nhân (Nuclear Body) ở vi khuẩn là dạng
nhân nguyên thủy, chƣa có màng nhân nên không có hình dạng nhất định và đƣợc
gọi là vùng nhân. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Bt. Hầu hết
các chủng Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST,
các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [45]. Trong một
thời gian dài ngƣời ta cho rằng các protein tinh thể đƣợc mã hóa chung trên các
plasmid lớn. Khi sử dụng kỹ thuật lai ADN với các mẫu dò cho gen cry đã nhận
thấy chúng xuất hiện cả trên NST [23, 39].

11


1.1.5.1. Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng.
Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của
các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các
loài phụ Bt khác nhau. Một số nghiên cứu mối tƣơng quan về sự có mặt của
plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng. Các phƣơng pháp xử lý
plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng các gen mã
hoá protein diệt côn trùng thƣờng nằm trên các plasmid lớn có hệ số copy thấp.

Theo điều tra của Carlton và Gonzalez thì plasmid có mặt trong hầu hết các chủng
Bacillus thuringiensis, số lƣợng plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các chủng
nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen
tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào Bt. Ví dụ các plasmid trong Bt. aizawai và
kurstaki HD-1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng nằm ở nhiều vị trí khác nhau
trong tế bào [6, 34].
1.1.5.2. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis.
Trƣớc đây, khóa phân loại protein độc tố đƣợc Hoft và Whiteley đề nghị năm
1989 dựa trên tính tƣơng đồng giữa các trình tự acid amin. Dựa trên khóa phân loại
này, năm 1998, Crickmore và cộng sự đã đề xuất một khóa phân loại mới hoàn
thiện hơn. Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số protein và thay đổi cách viết
tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [29].
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển Bt có khả năng sinh ra 3 loại độc tố
diệt côn trùng chính là Cry (crystal δ-endotoxin), Cyt (Cytolysin) và Vip (Vegetative
Insecticidal Protein). Dựa vào tính tƣơng đồng của trình tự acid amin của các họ
độc tố này lại đƣợc chia thành các lớp khác nhau, cách viết tên độc tố với các bậc
cấu trúc đầy đủ đƣợc quy ƣớc nhƣ sau: họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1, 2,
3...), ký tự viết hoa (A, B...), ký tự viết thƣờng (a, b...), số đếm (1, 2, 3...), ví dụ nhƣ
độc tố Cry12Aa1. Tỷ lệ acid amin tƣơng đồng để phân chia các lớp độc tố nhƣ sau:
lớp 1 (Cry1, Cry2...) có độ tƣơng đồng dƣới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ

12


78%-95%, lớp 4 dƣới 99% [25, 29, 42 ]. Ngoài 3 họ độc tố trên Bt còn sinh ra một
số độc tố khác nhƣ hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase...[30].
1.1.5.2.1. Độc tố Cry.
Độc tố Cry (dạng chủ yếu là tinh thể độc) đƣợc mã hóa bởi các gen cry khác
nhau. Đây là họ độc tố quan trọng nhất, đƣợc phát hiện và nghiên cứu chi tiết nhất.
Tính đến năm 2005, đã phát hiện đƣợc 310 độc tố Cry khác nhau (thuộc 47 nhóm

từ Cry1- Cry47) [24, 37, 46].
*/ Cấu trúc chung của độc tố Cry:
Cấu trúc của protein tinh thể đã đƣợc làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên cứu tinh
thể bằng tia X với nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau đó đƣợc
mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng
(Domain) (Hình 1.3). Thứ tự các vùng đƣợc tính từ đầu N đến đầu C của chuỗi
polipeptid [24, 37, 46].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein tinh thể độc tố Cry.
Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn α đối song song (α- antiparallel)
trong đó chuỗi số 5 đƣợc bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này mang đầu N [46].
Vùng 2 có chứa 3 tấm β đối song song tạo thành một dạng hình học topo điển
hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này đƣợc gọi là cuộn lăng kính β (β-prism fold).
Vùng 2 đƣợc xem là quyết định tính đặc hiệu liên quan đến việc gắn độc tố vào
màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp.

13


Vùng 3 có chứa 2 cuộn xoắn, các tấm β đối song song tạo thành một kẹp β (βsandwich) hình học topo gọi là “jelly roll”, tham gia vào việc gắn thụ thể [46].
*/ Đặc điểm một số nhóm độc tố Cry:
- Nhóm Cry1: gồm trên 130 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A - Cry1L có
khối lƣợng 130kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy [50].
- Nhóm Cry2: gồm hơn 20 độc tố thuộc nhóm Cry2A. Các protein nhóm này
có khối lƣợng 70kDa, có độc tính với cả hai loài bộ cánh vảy và bộ hai cánh. Riêng
Cry2B và Cry2C tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng cánh vẩy [50].
- Nhóm Cry3: gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A - Cry3C có khối lƣợng
73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng [50].
- Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A - Cry4B tích lũy cả hai loại
tinh thể có khối lƣợng khoảng 70kDa và 130kDa. Nhóm này có hoạt tính với các

loài thuộc bộ hai cánh. Những protein này cùng với protein 27kDa do nhóm cyt1A
tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn [50].
- Nhóm gen Cry5: Mã hóa cho protein có khối lƣợng 81kDa, gây độc với côn
trùng bộ cánh vảy và cánh cứng [32].
Nhóm cry8: Nhóm gen cry8 mã hóa cho các protein có hoạt lực đối với côn
trùng thuộc bộ cánh cứng. Những nghiên cứu về gen cry8 vẫn còn rất mới mẻ và
chƣa đƣợc đầy đủ. Cho đến hiện tại, đã xác định đƣợc nhóm gen này gồm 39 gen
thuộc các dƣới loài Bt khác nhau. Gen cry8Aa1, cry8Ba1 đƣợc tách dòng từ
Bacillus thuringiensis var. kumamotoensis. Gen cry8Ea1, cry8Fa1, cry8Ha1 đƣợc
tách dòng từ Bt185. Gen cry8Da đƣợc tách dòng từ Bacillus thuringiensis var.
galleriae. Gần đây, một số gen cry8 mới đƣợc xác định: gen cry8Ia1 (Yan et al .,
2008), cry8Ea2 (Liu et al ., 2007)… Hầu hết các gen cry8 có khối lƣợng phân tử là
130 kDa [51, 52, 53].
1.1.5.2.2. Độc tố Cyt.

14


Độc tố Cyt (độc tố phân hủy tế bào) cũng có bản chất là protein và hình thành
thể vùi nhƣ độc tố Cry, nhƣng tính tƣơng đồng của trình tự acid amin giữa độc tố
Cyt và độc tố Cry hầu nhƣ không đáng kể. Độc tố Cyt đầu tiên đƣợc Waalwijk phát
hiện là Cyt1Aa1 vào năm 1985. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 22 độc tố Cyt
thuộc 2 nhóm, các độc tố này có trọng lƣợng 25-30 kDa. Độc tố này có thể làm
tăng khả năng diệt côn trùng của độc tố Cry [8, 9].
1.1.5.2.3. Độc tố Vip.
Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry đƣợc tạo ra ở một
số chủng Bt trong pha sinh trƣởng sinh dƣỡng của tế bào, các protein này gọi chung
là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) do gen vip mã hóa tổng hợp. Các độc tố
Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào [12]. Độc tố Vip
đƣợc phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch và cộng

sự.
Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa đƣợc tổng hợp trong suốt pha sinh dƣỡng
nhƣng nó không đƣợc tiết ra ngoài. Gen mã hóa protein Vip3A xuất hiện trong cả
các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus. Protein này có hoạt tính đối
với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy nhƣ: Agrotis ipsilon, Spodoptera
frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea. Khi côn trùng mẫn cảm ăn phải
độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải các tế bào biểu mô ruột giữa. Các đặc
tính vật lý của Vip3A biểu lộ tính độc nhƣ protein Cry [42, 43].
1.1.6. Cơ chế tác động của protein tinh thể diệt côn trùng.
Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau. Khả năng diệt
côn trùng của các loài Bt chỉ thể hiện khi tinh thể độc đƣợc côn trùng tiêu hóa.
Cơ chế hoạt động của protein Cry của Bt liên quan đến sự hòa tan của tinh thể
trong ruột giữa côn trùng, quá trình phân giải protein của tiền độc tố nhờ protease
ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào
màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion (Hình 1.4). Tinh thể bao gồm các tiền độc tố,

15