Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào chương 2 ths nguyễn thành luân

5/17/2013

Khoa CNSH & KTMT
Bài giảng Môn học

CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO

Chƣơng II

CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI
CẤY TẾ BÀO CƠ BẢN

Nội dung cơ bản
• Xác định sự sinh trưởng tế bào VSV
• Các phương pháp nuôi cấy tế bào VSV
• Các thiết bị nuôi cấy cơ bản VSV

Mục đích xác định sinh
trƣởng của tế bào
“Mọi sự sinh trưởng đều có thể được định
nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần
hóa học. Tăng đơn thuần khối lượng không
thể phản ánh đầy đủ sự sinh trưởng, do tế
bào có thể chỉ tăng hàm lượng các sản phẩm
dự trữ của chúng như là glycogen, poly-βhydroxybutyrite,…..”

1


5/17/2013

Mục đích xác định quá trình
sinh trƣởng/nuôi cấy tế bào
• Khảo sát quá trình sinh trưởng kết hợp với
sự nhân đôi sinh khối cùng với các đặc tính
xác định khác của sinh vật/ quần thể như:
protein, DNA, RNA và nước nội bào.
• Mặt khác, quá trình nuôi cấy nhằm cân bằng
& duy trì một thành phần hóa học không đổi.
• Môi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau đó
tế bào thích nghi thì nó sẽ ở trong trạng thái
sinh trưởng tối ưu.
• Chọn lọc và xác định số lượng tế bào, sinh
khối tế bào hoặc hoạt tính tế bào.

Phƣơng pháp đếm trực tiếp
• Haemocytometer:
Buồng đếm tế bào máu
dùng cho những tế bào
có đường kính ≥ 3 μm
• Petroff-Hausser
counting chamber:
Buồng đếm PetroffHausser được dùng
chủ yếu cho vi khuẩn
và phân tích mẫu tinh
trùng.

Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
• Các tế bào phát triển là tế bào có thể phân
chia và tạo ra khuẩn lạc. Phương pháp này
cho phép đếm các tế bào phát triển trên đĩa

nuôi cấy .
• Phương pháp đếm trên đĩa petri:
– Phương pháp đĩa trải/hộp trải (spread plate)
– Phương pháp đĩa rót/hộp đổ (pour plate).

2


5/17/2013

PP hộp trải
(Spreading plate)
Sinh khối sinh vật được
phát triển trong môi
trường canh (lỏng) và
sử dụng một thể tích
nhỏ hơn 100 - 200 μL
được trải khắp bề mặt
agar

Phƣơng pháp hộp trải
• Kỹ thuật hộp trải (Sự phân
tán tế bào dựa trên kỹ thuật
của Drigalsky) là 1 phương
pháp hoàn thiện hơn với
các ứng dụng rộng rãi trong
thực tập VSV trong các
phòng TN
• Rất nhiều kỹ thuật sử dụng
để xác định số lượng VK

trong 1 mẫu nghiên cứu.

Phƣơng pháp hộp đổ
(Pouring plate)
• Mẫu vật được trộn với
agar nóng chảy (đã để
nguội đến khoảng 60oC)
và được rót trên đĩa vô
trùng

3


5/17/2013

Dựa trên PP pha loãng nồng độ của R.Koch, các khuẩn
lạc được cố định trên đĩa petri sạch chưa có môi trường,
sau đó đổ môi trường có chứa agar đun nóng và làm
lạnh ở khoảng 45-55 độ C.

So sánh các phƣơng pháp

Streaking plate (PP Cấy ria)

4


5/17/2013

Ƣu điểm

• Có khả năng phân lập hàng triệu TB trên bề
mặt
• Những nhóm TB đơn lẻ phát triển dính vào
nhau với những tế bào khác
• Các khuẩn lạc phân lập riêng biệt
• Không lẫn lộn vào các khuẩn lạc khác
• Tạo dòng những nhóm tế bào VK đơn trong
môi trường vô trùng

Ƣu điểm
• Chỉ cần các thiết bị tối thiểu
• Các kết quả thu được nhanh
• Có thể quan sát các đặc điểm hình thái
của cơ thể

5


5/17/2013

Nhƣợc điểm
• Thường rất khó phân biệt các tế bào chết
và tế bào sống.
• Không thích hợp cho các dịch huyền phù có
mật độ thấp.
• Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó
quan sát dưới kính hiển vi và có thể không
thấy khi đếm.
• Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và
nhầm lẫn trong quá trình đếm.

• Không thích hợp đối với các tế bào xếp
thành cụm như là mycelium (thể sợi nấm)

Phƣơng pháp xác định tế bào
bằng máy đếm
• Ƣu điểm
– Tránh sự đơn điệu khi đếm trực tiếp bằng kính
hiển vi
– Kỹ thuật này cho phép không chỉ đếm được số
lượng tế bào, mà còn đo cả kích thước tế bào

• Nhƣợc điểm:
– Không thể phân biệt giữa tế bào và các phần tử
bẩn khác
– khó sử dụng với các cơ thể dạng chuỗi
– Không đem lại kết quả tốt với các cơ thể dạng hệ
sợi (ví dụ như nấm)

Máy đếm & chụp hình khuẩn lạc
(Colony counter)

6


5/17/2013

Phƣơng pháp xác định sinh khối
tế bào
• Các phƣơng pháp trực tiếp
– Trọng lượng khô của tế bào

– Độ đục của dịch huyền phù tế bào

• Các phƣơng pháp gián tiếp
Nguồn Carbon + nguồn Nitrogen + Phosphate + O2 → Sinh khối tế bào
+ CO2 + H2O + Sản phẩm + Nhiệt

–
–
–
–
–

Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng
Tạo thành các sản phẩm
Các thành phần tế bào
Giải phóng nhiệt
Độ nhớt

Các phƣơng pháp bất động tế bào

Phƣơng pháp gắn bề mặt
(Microcarriers)

7


5/17/2013

Microcarriers
• Vi thể mang (microcarrier) được xem là hỗn

hợp hỗ trợ cho sự phát triển các tế bào đính
trong bể phản ứng sinh học (bioreactor)
• Là các hạt hình cầu có kích thước 125250µm và độ đậm đặc của chúng nhằm để
duy trì trong các môi trường khuấy canh lỏng
nhẹ
• Gia tăng mật độ các tế bào đính protein hay
tăng sinh các TB virus trong mô hình sản xuất
công nghiệp (CNSH protein) hay vaccine.

• Phương pháp nuôi cấy tế bào vi thể mang được thực
hiện trong 1 bình xoay (spinner flask), mặc dù các
loại thùng/bình khác như bể phản ứng sinh học (bể vi
trọng lực hay bể dịch đệm) cũng có thể dùng cho
nuôi cấy vi thể mang
• Ưu điểm: trong công nghiệp sản xuất vaccine
– Dễ dàng so sánh, đo đạc số liệu
– Điều khiển các điều kiện phát triển TB trong bể phản ứng
sinh học phức tạp, điều khiển bằng máy tính
– Sự biến đổi tổng số TB trong khu vực tầng và thể tích ủ đòi
hỏi bắt buộc cho 1 quy trình vận hành sản xuất
– Biến đổi mạnh mẽ số lượng TB trong quy mô phòng TN kỹ
thuật

• Các loại Vi thể mang (microcarrier) trên thị
trường
– Vi thể mang dextran (Cytodex, GE Healthcare)
– Vi thể mang collagen (Cultispher, Percell)
– Vi thể mang polystyrene (SoloHill Engineering)
 Khác nhau ở tính xốp, trọng lực đặc hiệu, cấu hình
tối ưu, sự hiện diện của các thành phần động vật &

hóa chất bề mặt…..

8


5/17/2013

Phƣơng pháp tạo thể xốp (Porous Glass)
Thể xốp thủy tinh chứa khoảng
96% silica
Các màng dạng sợi rỗng tạo
thành một cấu trúc hình ống
thường được sắp hàng như là các
bó sợi song song bên trong một
buồng hình trụ.
Các tế bào được giữ lại trên
thành của các sợi rỗng trong khi
môi trường dinh dưỡng được
thông khí luân chuyển quanh các
sợi.
Loại màng này có thể cung cấp
thêm sự bảo vệ chống nhiễm bẩn
môi trường.
Các thể xốp thủy tinh thương mại
trên thị trường VYCOR-Glass (PVG) &
Controlled Pore Glass (CPG)

Phƣơng pháp tạo thể xốp
• Thủy tinh xốp (Porous glasses) có thể thu
nhận được qua việc tách chiết acid của thể

thủy tinh Borosilica gel kiềm tách pha
• Sản xuất 1 thể thủy tinh xốp với 1 kích cỡ xốp
kích cỡ khoảng 0.4-1000nm trong độ phân bố
xốp
• Có thể tạo ra các loại nấm mốc khác nhau,
các phân mảnh TB khác nhau, các màng tế
bào siêu mỏng, các tuýp và nhẫn.

• Trong CNSH, thủy tinh xốp có lợi thế trong
việc tinh sạch DNA và cố định enzyme hoặc
VSV.
• Rất phù hợp cho sự tổng hợp các
oligonucleotide.
• Các nucleotide khởi đầu được tập hợp ở phía
trong bề mặt. Chiều dài của chuỗi
oligonucleotide được quyết định bởi kích cỡ
thể xốp của thủy tinh

9


5/17/2013

Phƣơng pháp bao vi thể
(Ethylcellulose)

Ethyl cellulose
• Ethyl cellulose có nguồn gốc từ cellulose
chứa nhiều nhóm glucose bị chuyển hóa
nhóm hydroxyl thành nhóm ethyl ether. Số

lượng ethyl ether tùy thuộc vào nhà sản xuất
• Sản xuất chủ yếu dạng màng bao mỏng
• Sử dụng như là chất gia vị thức ăn như chất
bổ trợ chuyển đổi

Ƣu & nhƣợc điểm
• Ưu điểm của kỹ thuật bao vi thể
– là tạo một diện tích bề mặt lớn cho sự tiếp xúc của
cơ chất và tế bào.
– Màng bán thấm chỉ cho đi qua một cách chọn lọc
những thành phần có trọng lượng phân tử thấp

• Nhược điểm chính của hệ thống màng là
– Giá thành cao,
– Sự tắc nghẽn của màng đã làm trở ngại cho việc
chuyển khối
– Khó khăn trong việc thông khí

10


5/17/2013

Phƣơng pháp bao vi thể
(Emulsion)

Phƣơng pháp bao vi thể
(Emulsion)
• Phương pháp tạo thể nhủ (Emulsion) được
sử dụng ở cả 2 pha là: phân tán & liên tục ở

dạng lỏng.
• Ví dụ: ứng dụng PP này có thể thấy include
nước trộn dầu giấm, sữa, mayonnaise, và 1
số loại thể lưu cần loại bỏ cho các công việc
hàn kim loại (vàng, bạc…) cũng như ứng
dụng các chất keo (colloid) trong phim chụp
ảnh

Phƣơng pháp tự kết khối
• Các tế bào tự kết khối hoặc kết thành cụm
như len cũng có thể được xem như là các tế
bào được bất động
– Do kích thước lớn của chúng
– Ưu điểm tương tự như sự bất động bằng các
phương pháp khác.
– Ví dụ: nấm mốc sẽ tạo ra các tiểu thể tự nhiên, thì
các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men lại cần đến sự
kết cụm.
– Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo hoặc các
nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) có thể được
bổ sung để tăng cường quá trình.

11


5/17/2013

Phƣơng pháp nuôi cấy theo
điều kiện chọn lọc
• Hóa học: thành phần hóa học, cơ

chất,….
• Vật lý: pH, nhiệt độ, ….
• Sinh học: các tác nhân sinh học như
VK tương tác, virus, enzyme,…

Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí & kỵ khí

Nuôi cấy hiếu khí: có O2 và đa số là tự
động hóa các thiết bị nuôi cấy
Nguyên lí hoạt động:
Dựa trên khả năng sống, sinh
sản của vi sinh vật trong
những điều kiện thuận lợi về
nhiệt độ, khí oxi cung cấp, về
pH môi trường, về tốc độ
khuấy.
Tất cả các yếu tố này đều
được điều khiển PID, trên cơ
sở đó có thể điều khiển môi
trường sống của vi sinh vật
thích hợp.

Hệ thống nuôi cấy vi sinh tự động (Bioengineering, Thụy Sĩ)

12


5/17/2013

Nuôi cấy kỵ khí

Thiết bị nuôi cấy kỵ khí: tạo điều kiện môi
trƣờng không có O2

Tài liệu tham khảo
• Review of Medical Microbiology /E. Jawetz, J.
Melnick, E. A. Adelberg/ Lange Medical Publication,
Los Altos, California, 2002. – P.46-87.
• Medical Microbiology and Immunology:
Examination and Board Rewiew /W. Levinson, E.
Jawetz.– 2003.– P.14-16
• Handbook on Microbiology. Laboratory diagnosis of
Infectious Disease/ Ed by Yu.S. Krivoshein, 1989,
P. 29-74.
• Essentials of Medical Microbiology / W.A. Volk at
al., – Lippincott-Raven, Philadelphia-New-York

KẾT THÚC CHƢƠNG II

THANK YOU!

13