Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

4/01/2013
1
BÀI 4
CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI
SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ
PHI TRUYỀN THỐNG
Lớp phân tích vi sinh
GV: ThS. Nguyễn Thành Luân


Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
(Nhắc lại)
Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được
định lượng bằng nhiều phương pháp
 Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi
 Gián tiếp thông qua:
 Phương pháp đo độ đục
 Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác
định
 Định lượng một cách thống kê bằng phương
pháp pha loãng tới hạn (MPN).
4/01/2013
2
Phƣơng pháp đếm trực tiếp
• Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh
chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu.
• Nhƣợc điểm:
- Không phân biệt được tế bào sống và tế
bào chết
- Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật
thể khác trong mẫu

- Khó đạt được độ chính xác cao
- Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật
có mật độ thấp.
Phƣơng pháp đếm trực tiếp
• Buồng đếm hồng cầu
• Buồng đếm Breed
• Kính hiển vi huỳnh quang
THIẾT BỊ GÌ??
4/01/2013
3
Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
•Trong phương pháp này cần thực hiện
pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với
mật độ tế bào thích hợp

•Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong
khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
•Phương pháp này dễ sai số nên
cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba
đĩa.

•Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép
định lượng vi sinh vật ở mật độ
thấp trong mẫu
4/01/2013
4
Phƣơng pháp MPN
(Most Probable Number)

 Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác
suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích
mẫu
 Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả
định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại
Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp.
 Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ
chính xác của phương pháp này càng lớn.
Phƣơng pháp đo độ đục
• Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh
vật.

• Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục
bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610
nm.

• Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục
có thể được dùng để so sánh mức độ tăng
trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong
môi trường lỏng
4/01/2013
5

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA
• Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết
cho định danh VSV
• Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm
kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa.
• Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa

để định danh VSV:
• Cách truyền thống
• Sử dụng các bộ KIT
• Sử dụng các thiết bị tự động

4/01/2013
6

Thử nghiệm khả năng lên men
• Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn
CH của các VSV
• Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH
môi trường
• Các loại carbohydrate
• Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …
• Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …
• Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose
• Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO
• Các loại đường rượu: chứa chức -OH

4/01/2013
7
Phenol Red Carbohydrate Broth
Trypticase

10g

NaCl

5g

Cao
thịt
1g

Phenol red

(7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%)

0,018g

Carbohydrate
*

1
g
Hấp ở 115
o
C trong 15 phút
Thử nghiệm khả năng lên men
• Môi trường: Phenolred broth
base bổ sung 0,5-1% đường
cần thử nghiệm
• VSV sử dụng được nguồn
đường trong môi trường sẽ
làm giảm pH  thay đổi màu
chất chỉ thị phenolred
• Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng
• Phản ứng (-): môi trường có

màu đỏ
4/01/2013
8
Thử nghiệm Citrate
• Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat
như là nguồn cacbon duy nhất.
• Cở sở sinh hóa:
• VSV sử dụng citrate, sinh ra CO
2
làm kiềm
hóa MT
• VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm
duy nhất tạo ra NH
3
làm kiềm hóa MT
Thử nghiệm Citrate
Môi trường Simmon citrate agar

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g
Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g
NaCl 5g
Sodium citrate 2g
MgSO
4
0,2g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 13g
4/01/2013
9
Thử nghiệm Citrate

• Chú ý
- Cấy lượng sinh khối vừa đủ
- Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm

Đối chứng trắng
Pứ âm tính Pứ dương tính
Thử nghiệm Urease
• Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease
• Cơ sở sinh hoá:
(NH
2
)
2
CO + H
2
O  2 NH
3
+ CO
2

 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)
• Môi trường sử dụng:
• Urea Broth (Rustigian – Stuart)
• Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)
4/01/2013
10
Môi trƣờng Urea Broth
Urea

20g

Cao nấm mem

0,1g

Na
2
HPO
4

9,5g

K
2
HPO
4

9,1g

Phenol red

0,01g

Nước cất

1 lít

•Thực hiện
• Chuẩn bị môi trường
• Cấy VSV vào 5ml môi

trường
• ủ 37
o
C/24 giờ
• Quan sát
Thử nghiệm Urease
4/01/2013
11
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
S
• Mục đích: phát hiện khả năng sinh H
2
S

• Cơ sở sinh hóa:

Acid amin chứa S H
2
S

Thiosulfate H
2
S

 H
2
S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen
(FeS, PbS)
desulfohydrase

thiosulfate reductase
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
S
• Để phân biệt các loài thuộc họ
Enterobacteriaceae
và giống
Proteus
• Môi trường sử dụng:
• KIA, TSI (thạch nghiêng)
• SIM, PIA (thạch sâu)
• BSA (thạch đĩa)
Cấy vsv lên môi trường Ủ (37
o
C, 24 – 48h)
4/01/2013
12
Thử nghiệm khả năng sinh H
2
S
• Đọc kết quả:

Xuất hiện màu đen trong môi
trường
Không xuất hiện màu đen trong môi
trường
(+)
(-)
(+) ĐC
Thử nghiệm khả năng sinh H

2
S
(+)
(+)
(-)
Pancreatic digest of
casein (casitone)

20.0 g
Peptic digest of animal
tissue (beef extract)

6.1 g
Ferrous ammonium
sulfate

0.2 g
Sodium thiosulfate

0.2 g
Agar

3.5 g
4/01/2013
13
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
• Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym
tryptophanase
Chủng VSV MT canh trypton

Thuốc thử
Kovac’s
Pứ dương tính Pứ âm tính
37
o
C / 24h
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
• Là phản ứng giúp phân biệt
•
E. coli
(+) với
Klebsiella
(-)
•
Proteus

mirabilis
(-) với
Proteus
khác (+)
•
Bacillus

alvei
(+) với
Bacillus
khác (-)
…
• Đối chứng (+)
Proteus

rettgeri
(-)
Serratia

marcescens
4/01/2013
14
Thử nghiệm KIA/TSI
• KIA: Kligler iron agar (trang 99)
Pepton 20g
Lactose 20g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium citrate 0,5g
Sodium thiosulphate 0,5g
Agar 15g
Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2
Thử nghiệm KIA/TSI
• TSI: Triple sugar iron agar (trang 106)
Pepton 20g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Glucose 1g
NaCl 5g
Feric ammonium sulphate o,2g
Sodium thiosulphate 0,2g
Agar 13g

Phenol red 0,025g
Nước cất 1 lít
pH 7,4±0,2

4/01/2013
15
Thử nghiệm KIA/TSI
• Mục đích: phát hiện khả năng
• sử dụng các nguồn cacbonhydrate
• sinh H
2
S
• tạo hơi (gas)
Ủ 37oC/24 giờ
Quan sát:
Phần nghiêng / phần sâu / hơi /
H
2
S
Thử nghiệm KIA/TSI
1 2 3 4 5 6 7 8 10 9 11
ĐC
4/01/2013
16
Thử nghiệm MR (Methyl red)
• Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì
các acid bền trong quá trình lên men glucose.
• Cơ sở sinh hóa:
• Chất chỉ thị pH: methyl red

• MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường
càng acid
• MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có
tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính
 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37
o
C

dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0
Thử nghiệm MR (Methyl red)
 Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)
Chủng VSV
ủ 2 – 5 ngày
37
o
C
Pứ âm tính
Pứ dương tính
ĐC
MR-VP broth
4/01/2013
17
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
• Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin)
trong quá trình lên men glucose
• Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm
khí hoàn toàn.
2 pyruvate acetoin + 2 CO

2
4/01/2013
18
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
• Môi trường sử dụng: MR-VP
• Phương pháp tiến hành:
• Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP
• Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37
o
C
• Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ
• Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ.
Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
• Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng
(+) : Enterobacter cloacea
(-) : E. coli
• Đọc kết quả:
(+): màu đỏ trên môi trường
(-): mặt môi trường không đổi màu
(+) (-)
4/01/2013
19
Thử nghiệm Bile Esculin
•Mục đích: xác định khả năng thủy giải
glucoside esculin thành esculetin và
glucose khi có sự hiện diện của muối
mật.
•Cơ sở sinh hoá:
•Esculin là hợp chất nhân tạo
•Esculetine được phóng thích phản ứng

với Fe
2+
tạo thành phức hợp màu đen
Môi trường Bile Esculine Agar
Beef extract 3g
Pepton 5g
Esculin 1g
Mật bò (Oxgall) 40g
Ferric citrate 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1 lít
4/01/2013
20
Glucose
Esculetine
Phân tử Esculine
Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine
Thử nghiệm Bile Esculin
4/01/2013
21
Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)
Thử nghiệm Malonate
• Mục đích
Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng
malonate như nguồn carbon duy nhất
• Cơ sở sinh hoá
Malonate là chất cạnh tranh với succinate
Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng
phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác 
tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường

4/01/2013
22
Thử nghiệm Malonate
• Môi trường sử dụng:
Malonate broth (bromothymol
blue)

• Dương tính: MT chuyển màu
xanh da trời
• Âm tính: MT không đổi màu và
không sinh khối
(+) (-) Đ
C
pH <6,0 6,0 – 7,6 pH >7,6
Thử nghiệm catalase
•Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase.
• Cơ sở sinh hoá:
• Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý

• H
2
O
2
H
2
O + O
2
(bọt khí)
(hydrogen peroxide)
catalase

4/01/2013
23
Thử nghiệm catalase
• Thực hiện
• VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)
• Đặt VSV lên lam kính sạch
• Nhỏ H
2
O
2
30%
• Quan sát sau 1-2 giây
• Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
• Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện
Thử nghiệm catalase
4/01/2013
24
Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H
2
O
2
30%
Thử nghiệm decarboxylase
• Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác
phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin
Cấu trúc của phân tử
Amino acid
4/01/2013
25

Ba thử nghiệm quan trọng
• Lysine decarboxylase (LDC)
• Ornithine decarboxylase (ODC)
• Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine
dehydrolase (ADH)

Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ
được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ
chất tương ứng

• Cơ sở sinh hoá
• Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi
màu chất chỉ thị
• Môi trường sử dụng:
Decacboxylase Basal Medium
chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8)
Thử nghiệm decarboxylase
pH <5,2
5,2
–
6,8
pH >6,8