Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 1 - ThS. Nguyễn Thành Luân

5/17/2013
1
CHƢƠNG MỞ ĐẦU
GIỚI THIỆU MÔN HỌC
ThS. Nguyễn Thành Luân
Email:
KHOA CNSH & KTMT

BÀI GIẢNG CÁC PHƢƠNG PHÁP
NUÔI CẤY TẾ BÀO
ĐỀ CƢƠNG MÔN HỌC
Tên học phần: CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI
CẤY TẾ BÀO
M học phần: 08220058
S tín chỉ: 2 (2, 0, 4)
Trnh đ: Dành cho sinh viên đại học
Hệ đào tạo: Đại học

Mục tiêu môn học
– Trình bày đƣợc kiến thức chung về nuôi cấy tế
bào, những hiểu biết chung về môi trƣờng và
điều kiện nuôi cấy; cũng nhƣ các phƣơng pháp
nuôi cấy cơ bản ở các mô tế bào khác nhau nhƣ
vi sinh vật, thực vật hoặc động vật.

– Hiểu đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện
ngoại cảnh đến khả năng nuôi cấy và sinh
trƣởng, phát triển của tế bào cũng nhƣ xuất hiên
các biến dị của mô hoặc tế bào sinh vật khi có
sự thay đổi các yếu tố ngoại cảnh.
5/17/2013

2
Nội dung cơ bản của môn học
─ Cơ bản về nuôi cấy tế bào
─ Cấu trúc cơ bản của tế bào và sự di
truyền của nó sau khi nuôi cấy.
─ Cơ chế điều hòa và hoạt động của hệ
gen đối với tế bào nuôi cấy.
─ Các phƣơng pháp và kỹ thuật áp dụng
cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào.
─ Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật nuôi cấy
mô & tế bào.

Tài liệu học tp
• Sách, giáo trình chính
[1] Nguyễn Hoàng Lộc. Giáo trình Công
nghệ tế bào, NXB Đại học Huế. 2006
[2] Bùi Trang Việt. Nuôi cấy mô và tế bào
thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục. 2005
[3] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai,
Trần Thị Việt Hồng. Sinh lý học người và
động vật. Tủ sách Đại học Khoa học Tự
nhiên TP HCM. 2000
Tài liệu tham khảo
 Novakovic, G.V. & Freshney, R.I. Culture
of Specialized Cells – Culture of Cells for
Tissue Engineering, Wiley-Liss, New
Jersey, USA. 2006
 Mather, J.P. & Roberts, P.E. Introduction
to Cell and Tissue Culture: Theory And
Technique, Plenum Press, New York.

1998.

5/17/2013
3
Tiêu chí đánh giá môn học
 Dự lớp: 80% trở lên tính theo số tiết
lên lớp
 Thi giữa học phần: 0%
 Thi kết thúc học phần: 70%
 Khác: 30% (Thảo luận, tiểu luận…)

Đánh giá tiểu luận (30%)
• Seminar + tiểu luận theo nhm
• Thời gian: 15 phút/nhm, phải có đầy đủ thành
viên báo cáo
• Chủ đề về 1 tài liệu chuyên ngành về:
– Nuôi cấy tế bào VSV
– Nuôi cấy tế bào thc vt
– Nuôi cấy tế bào đng vt
• Chú trọng vào các phƣơng pháp nuôi cấy hiện
đại, ứng dụng cao
• Mi nhm tiểu luận: <= 5 ngƣi
BÁO CÁO TIỂU LUẬN
• Sinh viên tự chọn lọc tên đề tài phù hợp
về các lĩnh vực nuôi cấy tế bào vi sinh
vật, thực vật & động vật.
• Chọn lọc phƣơng pháp nuôi cấy hiện đại,
theo quy trình nuôi cấy theo công nghiệp
(thành phẩm).
• Ƣớc lƣợng rõ ràng giá cả, phân tích ƣu

và nhƣợc điểm của thiết bị và hiệu suất
sử dụng cho đối tƣợng cụ thể.
5/17/2013
4
Cấu trúc bài báo cáo seminar
• Bao gồm các phần:
– ĐẶT VẤN ĐỀ
– TỔNG QUAN
– PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: chú trọng
– KẾT QUẢ DỰ KIẾN
– THẢO LUẬN & KẾT LUẬN.
– KIẾN NGHỊ (NẾU CÓ)

BÁO CÁO DƢỚI DẠNG FILE PPT ĐƢỢC GHI
ÂM
THỜI HẠN NỘP BÀI
LỚP TRƢỞNG TỔNG HỢP CÁC FILE
CỦA CÁC NHÓM VÀO ĐĨA VÀ GỞI ĐĨA
VỀ KHOA VÀO NGÀY 05/07/2013
(Không nhận bài sau ngày trên)

BÌA ĐĨA GHI: BÀI TIỂU LUẬN MÔN…
LỚP:…………….
Thi kết thúc học phần
• Hình thức thi: Trc nghiệm

• Bao gồm tất cả nội dung đã đƣợc học trong
toàn bộ môn học và giáo trình liên quan.

• Gồm 4 phần chính: Đại cƣơng nuôi cấy tế

bào, PP nuôi cấy TB VSV, Thực vật, Động
vật (Có câu hỏi tiếng Anh)


5/17/2013
5
ĐỀ CƢƠNG CHI TIẾT
S
TT

Nội dung
Số tiết
1
Chương 1: Mở đầu
2
2
Chương 2: Sinh trưởng và bất động của tế bào
4
3
Chương 3: Động học sinh trưởng của tế bào
4
4
Chương 4:
Thiết kế hệ lên men 4
5
Chương 5: Nuôi cấy tế bào vi sinh vật
4
6
Chương 6: Nuôi cấy tế bào động vật
4

7
Chương 7: Nuôi cấy tế bào thực vật
4
8
B
o co tiu luận 4
Các giảng viên phụ trách môn học
• ThS. Nguyễn Thành Luân (PP nuôi cấy
TB VSV - 3 tuần đầu)
• ThS. Phạm Văn Lc (PP nuôi cấy TB
thực vật - 2 tuần tiếp theo)
• ThS. Lại Đnh Biên (PP nuôi cấy TB
động vật - 3 tuần cuối)
CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU
5/17/2013
6
ĐẠI CƢƠNG VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
• Khái niệm Công nghệ sinh học hiện đại
• Lịch sƣ̉ hình thành Công nghệ tế bào
• Các quá trình sinh học trong công nghệ
tế bào
• Tại sao lại là: Nuôi cấy tế bào?
• Các ƣu và nhƣợc điểm của công nghệ
tế bào

Công nghệ sinh học hiện đại
• “Công nghệ sinh học hiện đại là các quá
trình sản xuất ở quy mô công nghiệp mà
nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là
các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật và

động vật). Mi tế bào sống của cơ thể sinh
vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này
đƣợc xem nhƣ một lò phản ứng nhỏ”.
Công nghệ sinh học hiện đại
• Thuật ngữ “Công nghệ sinh
học” thƣờng đƣợc sử dụng.
Vậy CNSH là gì?

• Những kỹ thuật mới nhƣ DNA
tái tổ hợp (DNA recombinant)
và dung hợp tế bào (cell
fusion), đƣợc xem là lĩnh vực
công nghệ sinh học hiện đại.
5/17/2013
7
Câu hỏi
• Hãy cho biết bản chất của phƣơng
pháp DNA tái tổ hợp và dung hợp tế
bào?

• Các ứng dụng của 2 phƣơng pháp trên

Nhu cầu của CNSH hiện đại
• Các dƣợc phẩm:
– Sản xuất Insulin để chữa bệnh đái tháo
đƣờng
– Sản xuất các Hormone sinh trƣởng ngƣời
để điều trị bệnh còi của trẻ em
– Các Interferon (IFNs) để chống viêm nhiễm,
vaccine phòng bệnh và các kháng thể đơn

dòng dùng để chẩn đoán
QUY TRÌNH CÔNG
NGHỆ NUÔI CẤY
TẾ BÀO ĐIỂN HÌNH
5/17/2013
8
Nhu cầu của CNSH hiện đại
• Các con giống sạch bệnh hoặc khoẻ mạnh
hơn, các vật nuôi dùng làm thực phẩm c
sản lƣợng cao c thể đƣợc phát triển
• Các loài cây trồng quan trọng đƣợc biến
đổi di truyền để c các tính trạng chống
chịu stress
• Chống chịu chất diệt cỏ và kháng côn
trùng
• Phát triển các vi sinh vật đƣợc biến đổi di
truyền (genetically modification organisms)
Recombinant DNA (rDNA) - Cloning
 Là những kỹ thuật cho
phép thao tác trực tiếp
nguyên liệu di truyền
của các tế bào riêng
biệt.
 Có thể đƣợc sử dụng
để phát triển các vi
sinh vật sản xuất các
sản phẩm mới cũng
nhƣ các cơ thể hữu
ích khác.
5/17/2013

9
Mục tiêu chính của công nghệ rDNA
• Gắn một gen ngoại lai (foreign gene) mã
hóa cho một sản phẩm mong muốn vào
trong các dạng DNA mạch vòng (plasmid
vector) của vi khuẩn

• Chuyển gene vào trong một cơ thể vật
chủ  gen ngoại lai c thể biểu hiện để
sản xuất sản phẩm của n từ cơ thể này.
Dung nạp tế bào (cell fusion)
Dung nạp tế bào
• Là quá trình hình thành một tế bào lai đơn
(single hybrid cell) với nhân và tế bào chất
từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp các
đặc điểm mong muốn của cả hai loại tế
bào này.
• Ứng dụng trong việc ứng dụng sản xuất
tế bào lai trong sản xuất kháng thể đơn
dòng, ghp mô tế bào,…
5/17/2013
10
Công nghệ nuôi cấy tế bào
• Các công nghệ DNA tái tổ hợp hoặc dung
nạp tế bào đƣợc khởi đầu bởi những
nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối
cùng có thể phát triển thành một loại tế bào
mới có thể sản xuất sản phẩm có  nghĩa
thƣơng mại
 Đòi hỏi phải phát triển thành quy trình

công nghiệp với một công nghệ khả thi và
c hiệu quả kinh tế  Nhu cầu tìm hiểu các
phƣơng pháp nuôi cấy tế bào tối ƣu nhất.
Lịch sử hình thành
Từ khi nào chúng ta đã biết có công nghệ
nuôi cấy tế bào?

Công nghệ nuôi cấy tế bào ngày nay khác
với công nghệ nuôi cấy tế bào ngày xa xƣa
nhƣ thế nào?

Mục đích của nuôi cấy tế bào hiện đại?
Lịch sử hình thành
“Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều
đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế
bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc
sinh vật” (Schleiden và Schwann, 1838).
5/17/2013
11
Lịch sử hình thành
Sydney Ringer (1836 – 1910),
ngƣời Anh khám phá ra dung
dịch Ringer’s Solution quyết
định nồng độ ƣu trƣơng từ các
loại muối gồm 6.5g NaCl, 0.42g
KCl, 0.25g CaCl
2
and 1 mole
Natri bicarbonate

Ứng dụng trong tất cả các thí
nghiệm in vitro về các mô và cơ
quan (cơ, tim của chim, cá,
động vật có vú )
Lịch sử hình thành
Vào năm 1885, Roux
chuyển 1 mẫu đĩa môi
trƣờng nuôi cấy tế bào
thần kinh of 1 phôi tế
bào gà và duy trì trong 1
môi trƣờng muối saline,
mở đầu cho việc phát
triển công nghệ nuôi cấy
tế bào.
Wilhelm Roux (1850 – 1924)
ngƣời Đức
Lịch sử hình thành
• Từ 1907–1910, sáng
chế ra mô tế bào nhân
tạo từ tế bào thần kinh
ếch trong môi trƣờng
chứa lymphocytes
Ross Granville Harrison
(Mỹ)
(1870 – 1959)
5/17/2013
12
Lịch sử hình thành
• Đến năm 1960,
Melcher và

Bergman là những
tác giả đầu tiên tách
và nuôi cấy thành
công tế bào đơn
của thực vật trong
các bình lên men ở
môi trƣờng nhân
tạo.

Mục đích tm hiểu
• Các chất xúc tác sinh học và tế bào đƣợc
chọn lọc hoặc sửa đổi di truyền phải thích
hợp cho các hoạt động sản xuất
• Phù hợp với mô hình sản xuất quy mô
công nghiệp ứng dụng
• Tìm hiểu các phƣơng pháp tối ƣu nhất
cho nhu cầu thu nhận sinh khối 1 sản
phẩm thƣơng mại
Các quá trình sinh học (Bio-processing)
– Phải thu đƣợc các chất xúc tác sinh học tốt
nhất (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực
vật,hoặc enzyme)
– Tạo ra môi trƣờng tốt nhất c thể cho sự xúc
tác bằng cách thiết kế các bioreactor/fermenter
thích hợp với phƣơng thức tối ƣu nhất.
– Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hn
hợp phản ứng trong một phƣơng thức kinh tế
nhất.
NHC LI
5/17/2013

13
Bio-prossessing
Kỹ thuật tạo dòng tế bào
Bể phản ứng sinh học
5/17/2013
14
Bể phản ứng sinh học
Theo anh/chị, bể phản ứng sinh học là
gì?
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là
chọn lọc các tế bào
ở giai đoạn phát
triển tối ƣu nhất
trong quá trình sinh
trƣởng và phát triển
của tế bào sinh vật
sống gồm 4 giai
đoạn là: thích nghi,
tăng trƣởng, cân
bằng và suy tàn.
Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
• Điểm khác biệt giữa phƣơng pháp nuôi
cấy tế bào đơn thực vật và động vật,
VSV ở:
– Mức độ vô trùng
– Tồn tại dƣới dạng huyền phù
– Tốc độ phân chia  sinh khối
– Phƣơng thức sinh dƣỡng
– Các chất đƣợc tạo ra trong quá trình trao

đổi chất
– Cấu trúc cơ thể sinh vật

5/17/2013
15
Các dạng nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào vi sinh vật
 Nuôi cấy tế bào vi
khuẩn

 Nuôi cấy virus và các
bacteriophage

 Nuôi cấy tế bào VSV
eukaryotes: nấm men,
nấm mốc, tảo (algae),
ĐV nguyên sinh
(metazoa)

Sơ lược về lịch sử phát hiện và giới thiệu
kháng sinh penicillin

Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do A. Fleming


Kháng sinh penicillin
5/17/2013
16
Penicillin chrysogenum

• Thuộc họ hiếu khí
bắt buộc,
• Là loại nấm sợi bào
tử hở.
• Khi mới phát hiện
trong môi trường
đặc, chúng tạo ra hai
dạng khuẩn ty:
khuẩn ty khí sinh và
khuẩn ty dinh dưỡng
màu trắng
Dựa vào tính chất của canh trường
Nuôi cấy chìm

Nuôi bề mặt
5/17/2013
17
Hiệu quả kinh tế
• Với nguồn cơ chất chính là glucoza và lên
men theo phương pháp chìm
• Nồng độ penicillin G trong dịch lên men
những năm 80 - 90 của thế kỷXX đạt
khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất
khoảng 40 - 50 kg penicillin G/m
3
dịch lên
men ).

Nuôi cấy tế bào thực vật
 Nuôi cấy mô tế bào

thực vật khởi nguồn từ sự
tách chiết các nhóm mô
từ rễ, lá, mầm (explant
culture) thành các mô sẹo
(callus) trên môi trƣờng
dinh dƣỡng in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực
vật là sự nuôi cấy vô
trùng các cơ quan, mô, tế
bào thực vật trên môi
trường nhân tạo được
kim soát.

5/17/2013
18
Nuôi cấy hoa lan Mokara
Hình . Lan Mokara đỏ
 Lan Mokara là một loài
hoa đẹp có giá trị kinh tế
cao.
 Mokara có hoa nhiều
màu sắc được rất nhiều
người ưa thích & là loại
hoa có lượng tiêu thụ lớn
trên thị trường.
Nuôi cấy tế bào côn trùng
• Ruồi giấm (Drosophila melanogaster)
– Nghiên cứu phản ứng sinh hóa học
– siRNA (RNA thầm lặng)

• Các loài ấu trùng của bƣớm, châu chấu
và sâu
− Recombinat protein
 Xác định các nhóm RNA hoặc DNA khó
xác định ở các nhóm sinh vật bậc cao
Nuôi cấy tế bào động vật
• Đa dạng:
– Nuôi cấy tế bào gốc
– Sản xuất vaccine
– Biệt hóa dòng tế bào động vật
– Hoạt chất chống ung thƣ
– Kháng thể đơn dòng
– …….
 Ứng dụng các thử nghiệm thành công
trên ngƣời phục vụ cho mục đích y học
5/17/2013
19
Công nghệ tế bào gốc (stem cell)
Sản phẩm của quá trình sinh học
• Sản phẩm biến dƣỡng của sinh vật
• Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid bo
(fatty acid), amino acid,…
• Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine,
berberin, ginsenosid, palitaxel,
bacteriocin, …
• Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng stress,
phòng vệ chống vi sinh vật, côn trùng,…
Ứng dụng trong tách chiết hợp chất sinh học thứ cấp
• Hợp chất ginsenosid

từ cây Nhân sâm
(Panax ginseng):
– Tác dụng đến hệ thần
kinh trung ƣơng
– Gia tăng sức đề kháng
– Tăng cƣờng co bóp cơ
tim
– Hạ đƣờng huyết

5/17/2013
20
Saponin
• Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi
lắc với nƣớc, c tác dụng nhũ ha và tẩy sạch.
• Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất
loãng.
• Độc với cá và động vật máu lạnh; c tác dụng
diệt những loài thân mềm nhƣ giun, sán, ốc
sên.
• Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt.
• Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các
chất 3-ß-hydroxysteroid khác

Ứng dụng nuôi cấy TB trong y dƣợc
• Bao gồm:
– Sản xuất các hoạt chất nhƣ Diosgenin,
Codeine, Morphine, Atropine, Hyoscy-
amine, Scopolamine, Digoxin, Digitoxin,
Quinine, Reserpine, Artemisinin
– Vaccine

– Hormone tăng trƣởng/kích thích
– Kháng thể đơn dòng
– Tế bào gốc trong cấy ghép mô/tế bào
Chọn lọc phƣơng pháp làm tăng sản lƣợng
• Điều kiện môi trƣờng thích hợp
• Chọn lựa chủng c năng suất cao
• Biến đổi tiền chất
• Xử l với các chất cảm ứng
• Cố định tế bào
• Tiết sản phẩm ra môi trƣờng
• Gây đột biến tế bào
• Phát sinh hình thái

5/17/2013
21
Cố định tế bào
• Một hệ thống cố định c thể duy trì sự sống của
tế bào qua một khoảng thời gian dài và phóng
thích phần lớn sản phẩm ra môi trƣờng ngoại
bào ở dạng ổn định:
• Sự cố định thƣờng bị hạn chế
• Sinh khối ban đầu phải đƣợc nuôi cấy dạng
huyền phù tế bào
• Sản phẩm bắt buộc tiết ra môi trƣờng
• Sản phẩm bị thoái biến
• Ngăn cản sự khuếch tán của tế bào

Tiết sản phẩm ra môi trƣờng
• C thể làm tăng khả năng sản xuất
những hợp chất thứ cấp bằng cách kích

thích cho tế bào tiết chúng ra ngoài môi
trƣờng.
• Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi
trƣờng, ngƣời ta cố gắng làm tăng tính
thấm của màng tế bào nhƣng kết quả đạt
đƣợc vẫn rất hạn chế.

Gây đột biến tế bào
• Các dạng đột biến điều hòa và đột biến khuyết dƣỡng đƣợc
sử dụng rộng rãi để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm nhƣ
amino acid, nucleotide, kháng sinh,…
• Sự gia tăng hoạt động biến dƣỡng bằng cách sử dụng các đột
biến điều hòa c thể thực hiện
• Việc chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích nuôi
cấy là một yếu tố quan trọng để sản xuất ra các loại sản phẩm

5/17/2013
22
Phát sinh hình thái
Nuôi cấy lông rễ (chuyển
plasmid Ri vào vết thƣơng
trên mô)
Chọn lọc môi trƣờng thích hơp
• Điều kiện môi trƣờng thích hợp
– Thành phần các chất trong môi trƣờng
nuôi cấy, chất điều hòa sinh trƣởng thực
vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay
chuyển, ánh sáng,…
Ví dụ: Auxin thƣờng đƣợc bổ sung vào môi
trƣờng để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và n sẽ

đƣợc giữ lại với một hàm lƣợng rất thấp hoặc
loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các chất biến
dƣỡng

Các lƣu ý trong sử dụng phƣơng
pháp nuôi cấy tế bào
• Không nên nuôi cấy tế bào một cách đại trà mà
không tính toán đến khả năng tạo ra những sản
phẩm đặc biệt của loài đ.
• Không phải tất cả các cơ quan đều c khả năng
tạo ra chất mà ta quan tâm.
• Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành
tuyển chọn để nâng cao năng suất tạo ra các sản
phẩm bậc 2.
• Bổ sung cơ chất tƣơng ứng.
• Tìm ra môi trƣờng đặc hiệu cho từng loại tế bào

5/17/2013
23
Các ƣu điểm
• Điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ôn hòa:
quá trình sinh học ít ảnh hƣởng so với quá
trình hóa học
• Tính đặc hiệu: 1 enzyme chỉ 1 hoặc 2 cơ
chất xúc tác
• Tính hiệu lc: enzyme xúc tác nhanh,
mạnh so với chất xúc tác khác
• Các tài nguyên c thể đổi mới
• Công nghệ DNA tái tổ hợp: h trợ việc chọn
lọc dòng/giống

Các ƣu điểm
• Điều kiện nuôi cấy c thể đƣợc kiểm soát
và c thể đƣợc tối ƣu cho việc sản xuất
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.
• Tế bào c thể đƣợc chọn lọc và cải thiện
bằng cách nhân dòng in vitro
• C thể dễ dàng nghiên cứu chuyển ha
các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.

Các nhƣợc điểm
• Các hỗn hợp sản phẩm phức tạp: xác
định khó khăn và khó tách chiết
• Các môi trƣng nƣớc long: nhỏ và
đắt tiền
• S nhiễm bẩn: dễ bị lấn át bởi các VSV
ký sinh /cộng sinh.
• Khuynh hƣớng hay biến đổi: do môi
trƣờng hay đột biến
5/17/2013
24
KẾT THÚC CHƢƠNG I
THANK YOU FOR
YOUR ATTENTION!