Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào chương 3 ths nguyễn thành luân

5/17/2013

TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CNSH & KTMT
BÀI GIẢNG CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO

Chƣơng III

HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ
BÀO VI SINH VẬT
GV: Nguyễn Thành Luân


Hệ thống nuôi cấy TB VSV
Bể phản ứng sinh học (bioreactor) hay
còn gọi là hệ thống lên men (fermenter
system) là loại thiết bị chủ yếu sử dụng
trong nuôi cấy tế bào VSV
Sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi
các tế bào sống hoặc các thành phần tế
bào in vivo (enzyme).

• Trong phòng thí nghiệm, các tế bào
thường được nuôi cấy trong các bình tam
giác trên máy lắc ổn nhiệt (thermal shaker)
hoặc chế tạo ra các hệ thống khác nhau
dựa trên các dụng cụ hiện có.
• Dựa trên đòi hỏi của mô hình/hệ thống
nuôi cấy tế bào VSV: điều kiện môi trường,
tốc độ nuôi cấy & thời gian nuôi cấy.

1


5/17/2013

Các dạng hệ thống cơ bản
Theo cấu tạo thiết bị:
• Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (Stirred
Tank) và nuôi cấy hình ống (Plug Flow)
• Hệ thống nuôi cấy lắng ly tâm
(Segregated Reactor)
• Nuôi cấy đồng nhất (homogenous
reactor) và không đồng nhất
(heterogenous reactor)

Phân loại hệ thống nuôi cấy
• Theo mô hình
– Nuôi cấy mẻ (batch culture), mẻ bổ sung cơ
chất (fed-batch culture) & liên tục (continuous
culture)
– Nuôi cấy dạng cột (spin column culture) & nuôi
cấy dạng vòng (loop culture)
– Nuôi cấy cân bằng phản ứng tế bào
– Nuôi cấy mô & nuôi cấy tế bào một lần
– Nuôi cấy bổ trợ TB (Cell support system)
– Bể phản ứng nuôi cấy tế bào (Cell bioreactors)

Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy

Hình: Sơ đồ hệ thống nuôi cấy dùng trong sản xuất
penicillin

Là 1 dạng lên men liên
tục trong nuôi cấy tế
bào
Đối với hoạt động sản
xuất ở quy mô lớn, thì
hệ thống nuôi cấy thùng
khuấy (stirred-tank
fermenter, STF) được
sử dụng rộng rãi nhất
để thiết kế cho quá trình
nuôi cấy quy mô công
nghiệp.

2


5/17/2013

Điều kiện vận hành hệ thống
• Cường độ pha trộn (mixing intensity) có
thể rất khác nhau bằng cách chọn loại
cánh khuấy (impeller) thích hợp và các
tốc độ khuấy khác nhau
• Nó có thể được dùng cho cả hai trường
hợp lên men hiếu khí (aerobic) và yếm
khí (anaerobic) trong một phạm vi rộng
các loại tế bào khác nhau bao gồm vi

sinh vật, động vật và thực vật,…

Ƣu điểm của hệ thống
• Là một trong những hệ thống lên men
quy mô lớn đầu tiên được phát triển trong
công nghiệp dược, bia, rượu…
• Do hệ lên men thùng khuấy thường được
làm bằng thép không rỉ và hoạt động
trong điều kiện ôn hòa nên tuổi thọ của
thiết bị rất lâu

Nhƣợc điểm của hệ thống
• Bộ phận (cánh) khuấy tiêu thụ một lượng lớn công
suất và có thể gây nguy hiểm cho những hệ thống
nuôi cấy tế bào mẫn cảm với lực trượt (shear
force) như tế bào động vật có vú hoặc tế bào thực
vật  khả dụng cho nuôi cấy VSV
• Lực trượt của chất lỏng trong hỗn hợp được tạo ra
bởi gradient tốc độ của các thành phần tốc độ cao
do khi chất lỏng rời khỏi vùng trung tâm, thì tốc độ
của nó ở vị trí trên và dưới cánh khuấy (có khoảng
cách bằng chiều rộng cánh khuấy) sẽ giảm.

3


5/17/2013

• Khi tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy trên đường
kính của nó tăng thì cấu hình tốc độ ít có

dạng đặc trưng của parabol mà trở nên tù
hơn và nó tạo ra lực trượt ít hơn do
gradient tốc độ lớn dần lên
 Hạn chế trong việc có thể ứng dụng thành
công hệ thống lên men thùng khuấy trong
nuôi cấy tế bào động vật hoặc tế bào thực
vật

Hệ lên men dòng nút (plug-flow
fermenter, PFF)
• Còn được gọi là hệ lên men mẻ (batch
fermenter) hệ lên men lý tưởng có khả
năng pha trộn tốt sao cho các thành phần
đồng nhất trong một kết cấu ở mọi thời
điểm
• Chất dinh dưỡng (cơ chất) và tế bào đi vào
một đầu của ống hình trụ và tế bào sẽ sinh
trưởng trong khi chúng đi qua ống này

Hệ lên men dòng nút (plug-flow
fermenter, PFF)

4


5/17/2013

• Nuôi cấy theo đường ống dài và thiếu bộ
phận khuấy nên đã ngăn cản sự pha trộn
hoàn toàn của chất lỏng  tế bào thay đổi

dựa trên tính chất của chiều dòng chảy
• Một hệ lên men dòng ống mà không có
những biến thiên hướng tâm thì được gọi
là hệ lên men dòng nút (PFF)

Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture)
• Đơn giản & sử dụng
rộng rãi trong sản
xuất vaccine quy mô
công nghiệp & các
sản phẩm rRNA
protein
• Cho phép sinh trưởng
& sản sinh tế bào
trong 1 bình chứa kín

HỆ THỐNG NUÔI CẤY MẺ

5


5/17/2013

Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture)
• Hạn chế về môi trường (do cung cấp 1
lần) nên khi không còn cơ chất, TB dừng
phát triển và chết  dễ thoái hóa TB
trong hệ thống
• Nếu muốn tiếp tục nuôi cấy, phải tạo môi
trường phụ bổ sung bằng việc thêm các

tế bào trong môi trường nuôi cấy cũ vào
trong môi trường dinh dưỡng mới ban
đầu (tăng sinh)

Nuôi cấy mẻ (batch culture)
• Tốc độ khởi đầu của phản ứng xúc tác tự
động chậm do nồng độ của cơ chất ban
đầu thấp.
• Tốc độ phản ứng tăng lên khi các tế bào
sinh sản và sau đó sẽ đạt đến tốc độ tối
đa.
• Khi lượng cơ chất giảm và các sản phẩm
độc được tích lũy, thì tốc độ phản ứng
giảm xuống ở giá trị thấp hơn

Cách lắp đặt hệ thống mẻ trong
quy mô phòng thí nghiệm nhỏ
Nguyên liệu:
• 250 mL Erlenmeyer flask.
• Vải mùng /miếng gạt y tế
vừa với 1 Pasteur pipette
• Không khí được bơm vào
trong môi trường duy trì
nồng độ CO2 và O2
• Kéo, bông mỡ (cotton)

6


5/17/2013

• Bƣớc 1: Cắt 2 lớp
của bông mỡ (10 X
10 cm) và đặt vào
giữa miếng vải
mùng đã được
chuẩn bị.

• Bước 2: Gấp các
góc của miếng vải
mùng lại thành 1
khối tròn cho cả 4
góc
.

• Bước 3: Lấy 1 đầu
nhọn của cây kéo và
khoan 1 lỗ nhỏ cho
Pasteur pipette.
• Cho Pasteur pipette
đâm xuyên qua lỗ và
cố định trên miệng
của bình Erlenmayer.

7


5/17/2013

• Thêm môi trường và

tế bào nuôi cấy vào
bình, cho không khí đi
vào bình thông qua 1
máy sục khí
• Đặt môi trường nuôi
cấy ra ngoài ánh
sáng/dưới ánh đèn
nếu nuôi cấy VSV tự
dưỡng

Các pha tăng trƣởng của hệ thống
Các pha

Sự tăng trƣởng

Mật độ tế bào

Đặc điểm

1

lag

zero

Thích nghi cơ học của các tế bào với
sự thay đội diều kiện sống

2

Gia tốc

Gia tăng

Không đáng kể

3

Pha log
(exponential)

Tăng liên tục

Gia tăng mật độ thay đổi môi trường
của tế bào

4

Chậm phát triển TB

Giảm sút nhanh

Tác dụng của những điều kiện thay
đổi xuất hiện

5

Ổn định

zero

1 hay nhiều thành phần dinh dưỡng
(hoặc ánh sáng) bị cạn kiệt đến mức
nguy hại cho sự phát triển của tế bào

6

Suy vong

Tiêu cực (độc tố)

Quãng thời gian của pha ổn định và
sự giảm sút các tỷ lệ tế bào phụ
thuộc hoàn toàn vào cấu tạo của tế
bào VSV

Hệ thống nuôi cấy liên tục
(Continuous culture system)
Môi trường nuôi cấy được
chứa đựng trong 1 bể chứa
lớn.
Không khí được thổi vào
khu vực rỗng trong bình
chứa. Áp lực không khí sẽ
đẩy môi trường đi qua
đường ống kết nối với môi
trường chứa tế bào nuôi cấy.
Bằng việc đóng mở khóa
trên đường ống môi trường,
có thể kiểm soát việc thêm

môi trường vào bình nuôi
cấy
.

8


5/17/2013

Hệ thống nuôi cấy liên tục
(Continuous culture system)

Sơ đồ hệ thống nuôi cấy liên tục

Hệ thống nuôi cấy liên tục
(Continuous culture system)
• Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng rộng rãi cho
cả mục đích sản xuất công nghiệp & nghiên cứu (theo
Kubitschek 1970; Tempest 1970; Veldkamp 1976,
1977; Rhee 1980; Munawar và cộng sự, 1989)
• Được nghiên cứu nhiều trong các nghiên cứu VSV
hoặc các phương pháp VSV môi trường như tảo,
nấm, VK kỵ khí gây độc cho môi trường
(ecotoxicology theo Rhee 1980, 1989).
• Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng từ nghiên
cứu của Novik and Szilard (1950) với sự phát triển hệ
thống “chemostat”, và Monod (1950) người đặt tên hệ
thống nuôi cấy là 1 “bactogen”

Lắp đặt hệ thống nuôi cấy liên

tục trong phòng thí nghiệm
• Chuẩn bị môi trường
nuôi cấy trong 1 bể
chứa khoảng 6-7 lít môi
trường
• Thêm vào 500mL sau
đó cứ thêm 100 mL
môi trường nuôi cấy
mỗi ngày đảm bảo tỷ lệ
pha loãng 20% và thể
tích đạt được là 6-7 lít
trong 2 tuần.

9


5/17/2013

Hệ thống nuôi cấy liên tục
(Continuous culture system)
• Fogg and Thake (1987) làm rõ ràng hệ thống nuôi cấy
liên tục “turbidostat” và “chemostat”
• Trong hệ thống “turbidostat”, môi trường dinh dưỡng
chỉ được thêm vào khi số lượng tế bào đạt ngưỡng kỳ
vọng khi được đo lường qua mật độ quang (OD) của
tế bào. Tại điểm này, môi trường sẽ bắt đầu thêm vào
và tế bào đạt sẽ được thu nhận. Nếu quá số lượng
cho phép, sẽ tiến hành pha loãng và lặp lai từ đầu.
• Trong hệ thống chemostat, môi trường được duy trì ở
1 tỷ lệ nhất định kiểm soát hoàn toàn tỷ lệ sinh trưởng

và độ phân bố tế bào.
.

Phân biệt Chemostat vs Turbidostat

Turbidostat

Chemostat

Turbidostat vs Chemostat
Các yếu tố
Turbidostat
Chemostat
PP kiểm tra tốc độ sinh
Bên trong
Bên ngoài
trƣởng
Tỷ lệ sinh trƣởng của tế
Bằng hoặc gần đạt µmax
Từ 0 – gần đạt µmax
bào
Tác dụng của việc gia Chỉ gia tăng cơ chất phản
tăng nồng độ của các ứng khi có sự thay đổi của Gia tăng trong điều kiện
gia tăng nồng độ cơ chất
chất dinh dƣỡng trong
máy đo cường độ ánh
bể nuôi cấy
sáng (photometer)
Thể tích nuôi cấy
Cố định

Cố định
Điều kiện môi trƣờng

Cố định

Cố định

Thời gian nuôi cấy

Không xác định

Không xác định

Các biến đổi µmax tại tỷ lệ
Các loại đột biến đƣợc Biến đổi µmax và các dạng pha loãng cao, các đột
chọn lọc qua việc nuôi khác nhau của những loại biến Ks tại nơi có tỷ lệ pha
cấy kéo dài
biến đổi trung gian
loãng thấp và 1 số dạng
biến đổi trung gian

10


5/17/2013

Turbidostat vs Chemostat
• Trong chemostat, tốc độ dòng chảy được
cài đặt ở một giá trị đặc biệt và tốc độ sinh
trưởng của nuôi cấy sẽ điều chỉnh tốc độ

dòng chảy này.
• Hoạt động chemostat dễ dàng hơn
turbidostat, do nó có thể được thực hiện
bằng cách đặt máy bơm ở một tốc độ dòng
chảy không đổi.

Turbidostat vs Chemostat
• Turbidostat đòi hỏi một thiết bị cảm quang
(optical sensing device) và một bộ điều
chỉnh (controller)
• Turbidostat chỉ thực hiện được với các tế
bào có khả năng hấp thụ ánh sáng như
tảo, TB thực vật, VSV quang dưỡng
(photocells)

Batch vs continuous culture
• Trong nuôi cấy liên tục, dinh dưỡng được
cung cấp đến tế bào theo 1 tỷ lệ nhất định
không đổi và theo 1 thể tích nhất định,
lượng tế bào cũng tương đương (Số lượng
TB nuôi cấy đạt được pha ổn định ở cả tế
bào nuôi cấy đi vào và đi ra)  ổn định
• Nuôi cấy mẻ tạo ra sinh khối nhiều & thời
gian sử dụng cơ chất nhanh nhưng dễ bị
thay đổi cơ chất (do VSV sử dụng & biến
đổi theo từng pha)

11

5/17/2013

Batch vs continuous culture
• Nuôi cấy liên tục đáp ứng được nhu cầu
dinh dưỡng của TB nhưng khó thay đổi
cơ chất và VSV (in vivo)  phức tạp
• Nuôi cấy mẻ đòi hỏi việc đáp ứng nhu
cầu sinh trưởng của TB nhưng dễ dàng
chuyển qua cơ chất khác (in vitro)  đơn
giản hơn

Batch vs continuous culture
• Hầu hết các hệ lên men sản xuất là một hệ
thống nuôi cấy liên tục (cánh khuấy) hoạt
động với nồng độ tế bào mà ở đó giá trị của
là tối thiểu do nó đòi hỏi thời gian lưu ngắn
nhất.
• Nếu nồng độ cuối cùng của tế bào được
hướng tới ở trong pha tĩnh, thì hệ lên men
mẻ là chọn lựa tốt hơn nuôi cấy cánh khuấy
(liên tục - CSTF), vì thời gian lưu cần thiết
cho nuôi cấy mẻ là ngắn hơn của CSTF

Các hệ thống nuôi cấy khác

12


5/17/2013

Mục đích
• Nhằm để cải thiện hoặc nhược điểm của
hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (tiêu thụ
công suất lớn) hoặc các yêu cầu đặc biệt
của một quá trình nuôi cấy nhất định
– Sục khí tốt hơn,
– Chuyển nhiệt hiệu quả,
– Tách hoặc giữ lại tế bào,
– Bất động tế bào,
– Giảm bớt thiết bị và giá thành của sản phẩm,
– Không được thiết kế cho quy mô lớn.

Hệ thống nuôi cấy dạng cột

Các hệ lên men cột: (a) cột bong bóng (bubble column), (b) cột hình nón
(tapered column), (c) cột bong bóng có khay sàng lọc (sieve-tray bubble
column), (d) cột bong bóng có khay sàng lọc với bơm ở bên ngoài, (e) cột
nhồi (packed-bed) với bơm ở bên ngoài.

Hệ lên men cột bong bóng
• Hệ lên men đơn giản nhất là hệ lên men
cột bong bóng (còn gọi là hệ lên men
tháp-tower fermenter), thường bao gồm
một bình trụ dài, có bộ phận phun khí ở
dưới đáy
• Tuy nhiên, hệ lên men cột bong bóng
thường bị hạn chế ở trường hợp lên men
hiếu khí và việc tăng các bong bóng
không thể cung cấp một sự pha trộn đầy
đủ cho sự sinh trưởng tối ưu

13


5/17/2013

Hệ lên men chóp và có khay sàng lọc
• Hệ lên men cột hình chóp ngược có thể duy
trì lưu tốc không khí cao trên một đơn vị
diện tích ở phần thấp hơn của hệ lên men
mà ở đó có nồng độ tế bào cao.
• Một vài khay sàng lọc có thể được cài đặt
trong cột để tăng hiệu quả tiếp xúc khí-chất
lỏng và phá vỡ sự kết khối của bong bóng
khí (hệ lên men có khay sàng lọc)

Hệ lên men cột nhồi
• Để tăng cường sự pha trộn mà không có
các phần chuyển động bên trong
• Dịch lên men (môi trường) có thể được
bơm ra ngoài và quay vòng (tuần hoàn)
bằng cách dùng một bơm chất lỏng ở bên
ngoài

Hệ thống nuôi cấy dạng vòng

Các hệ lên men vòng: (a) Lực đẩy không khí, (b) Lực
đẩy không khí có bơm bên ngoài, (c) Áp lực chu kỳ ICI.

14

5/17/2013

Hệ thống nuôi cấy dạng vòng
• Hệ lên men vòng là hệ lên men thùng (tank
fermenter) hoặc cột (column fermenter) có
vòng lưu thông chất lỏng,
• Nó có thể là một ống thông gió ở giữa
hoặc là một cái vòng ở bên ngoài.
• Tùy thuộc vào sự lưu thông chất lỏng
được tạo ra như thế nào, được phân loại
thành ba kiểu: lực đẩy không khí (air-lift),
vòng khuấy (stirred loop) và vòi phun (jet
loop)

Hệ lên men áp lực chu kỳ ICI
• Thuộc Imperial Chemical Industries Ltd.,
England
• Là một hệ lên men dùng lực đẩy không
khí với một vòng bên ngoài (outer loop)
được phát triển cho lên men hiếu khí đòi
hỏi có sự chuyển nhiệt.
• Môi trường và không khí được đưa vào
trong các phần cao hơn và thấp hơn

Vai trò của việc bơm không khí
• Cung cấp oxygen cần thiết cho sự sinh
trưởng của tế bào
• Tạo ra sự lưu thông tự nhiên của chất

lỏng trong hệ lên men thông qua một cái
vòng. Bộ phận trao đổi nhiệt để làm lạnh
môi trường lỏng được cài đặt vào trong
cái vòng đó.
• Hệ lên men này đã được chứng minh là
tạo ra một tốc độ hấp thụ oxygen cao trên
một đơn vị thể tích

15


5/17/2013

Ƣu & nhƣợc điểm của hệ
thống nuôi cấy cơ bản

Fed-batch culture

Fed-batch culture
 Hệ thống nuôi cấy mẻ bổ sung cơ chất
là quá trình công nghệ hóa hệ thống nuôi
cấy mẻ bằng việc bổ sung cơ chất dinh
dưỡng để kiểm soát sinh trưởng VSV
 Sử dụng trong bể phản ứng sinh học
nhằm thu nhận lượng tế bào với mật độ
cao
 Hầu hết dung dịch bổ sung (feed
solution) là đậm đặc nhằm hạn chế việc
pha loãng nhiều lần trong bể phản ứng
sinh học

 Kiểm soát việc thêm các cơ chất trực
tiếp ảnh hưởng đến tỷ lệ sinh trưởng của
VSV và hạn chế việc trao đổi cơ chất tràn
lan.
 VD: Bổ sung acetate cho nuôi cấy
Escherichia coli, lactic acid cho
Lactobacillus, ethanol cho
Saccharomyces cerevisiae), hạn chế
oxygen trong nuôi cấy kỵ khí.

16


5/17/2013

Hệ thống nuôi cấy dạng túi
(Bag system)

Hệ thống nuôi cấy chai xoay
(Roller bottle system)

Các dạng bể phản ứng sinh học
• Cánh khuấy đơn giản (Simple Stirred
Tank Bioreactor)
• Airlift Bioreactor (Vận chuyển khí)
• Membrane Stirred Tank Bioreactor (cánh
khuấy màng lọc)
• Spin Filter Stirred Tank Bioreactor (cánh
khuấy cột lọc)
• Vibromixer (máy trộn bằng gây chấn

động)
• Fluidized Bed Bioreactor (Thảm lỏng)

17


5/17/2013

Các dạng bể phản ứng sinh học
• Hollow fiber
bioreactor

• Multiple membrane
plate bioreactor

KẾT THÚC CHƢƠNG III

Tài liệu tham khảo
• Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design.
Marcel Dekker, Inc. New York, USA.
• Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and
Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York,
USA.
• Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess
Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John
Wiley & Sons, New York, USA.
• Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA.
• Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic
Concepts. 2nd ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA.
• Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical

Engineering Handbook (Principles, Process Design, and
Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA.

18


5/17/2013

CHÂN THÀNH CẢM ƠN &
CHÚC CÁC BẠN MAY MẮN

19