Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Giới thiệu một số kỹ thuật
bảo quản vi sinh vật (tt)

5. Một số phương pháp phổ biến
sử dụng trong bảo quản các nhóm
vi sinh vật cụ thể:
5.2. Bảo quản vi tảo:
Vi tảo thông thường được bảo
quản theo 3 phương pháp: Cấy
truyền, lạnh sâu và đông khô. Các
phương pháp đã được trình bày chi
tiết trong phần vi khuẩn. Một số


điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo
là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha
cân bằng, phương pháp lạnh sâu
cho kết quả tốt hơn phương pháp
đông khô.

5.3. Các phương pháp dùng cho
bảo quản nấm sợi:
a. Phương pháp cấy truyền:
Phương pháp này thường
được ứng dụng với các sợi nấm có
bào tử. Các chủng nấm sợi được
nuôi trên môi trường thạch thích
hợp và để cho sợi nấm phát triển
đến mức độ cực đại, sau đó là quá

trình hình thành bào tử, các ống
giống này sẽ được bảo quản theo
các cách khác nhau:
Các ống thạch được để
trong tủ lạnh (4-7 OC).
Bảo quản trong thạch
dưới lớp dầu: Các ống thạch
được bảo quản dưới lớp dầu
parafin có tỷ trọng tương đối là
0.83- 0.89 đã được khử trùng ở
O
nhiệt độ 121 C trong 15 phút.
Lớp dầu cách bề mặt thạch
khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo
quản là 15-20 OC.
Bảo quản trong nước,
nấm sợi được nuôi trên môi
trường thạch đĩa. Sau khi sợi
phát triển cực đại thì cắt thành
-


từng miếng nhỏ kích thước
khoảng 6 mm2 và cho vào lọ
nước đã thanh trùng. Bảo quản
tại nhiệt độ phòng.
b. Bảo quản nấm sợi có bào
tử trong silicagel:
Chuẩn bị:
1, Lọ đựng silicagel (10-15ml)

có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa)
thanh trùng ở nhiệt độ 170 OC
trong 3 giờ.
2, Silicagel: Loại trong suốt,
không có màu, kích thước và số
lượng hạt silicagel đưa vào
không quá 1/3 thể tích của lọ,
°
thanh trùng ở nhiệt độ 170 C
trong 3 giờ.


3, Môi trường sữa tách bơ
(Skimmilk) 20% khử trùng ướt
O
(115 C/20 phút).
4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa
petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ
theo từng chủng, môi trường
nuôi cấy mà thời gian thu bào tử
thích hợp khác nhau (10-15
ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho
vào ống nghiệm chứa bào tử nấm
sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền
phù bào tử có mật độ cao nhất (đối
với một số chủng có số lượng bào
tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ

một vài ống thạch bào tử khác
nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch
bào tử cho vào lọ đựng silicagel.
Chú ý silicagel hút nước và sinh
nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử
vào phải được thực hiện trong chậu
nước đá. Lượng dịch bào tử đưa
vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt
silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay
lắc đều đảm bảo các hạt silicagel
đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán
nhãn, ghi các thông tin cần thiết
như số mã chủng, ngày bảo quản,
môi trường và nhiệt độ thích hợp...
3, Lọ silicagel được đậy nắp
cẩn thận nhưng không vặn chặt


(nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong
bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC
trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn
giấy parafil giữ trong 4OC.
Kiểm tra độ sống sót sau khi
bảo quản:
Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng
que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt
silicagel để trên mặt thạch môi

trường mầm thóc (Maltagar), lắc
đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên
mặt môi trường. Để ở nhiệt độ
thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc
nấm theo thời gian thích hợp.
c.
Bảo quản nấm sợi có bào
tử theo phương pháp đông khô
(freez-drying):


Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch
(sonic cleaner) trong 15 phút sau đó
O
khử trùng 170 C trong 3 giờ.
2, Môi trường sữa tách bơ
(Skimmilk) 20% khử trùng ướt
(115OC/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể
đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ
theo từng chủng môi trường nuôi
cấy mà thời gian thu bào tử thích
hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho
vào ống nghiệm chứa bào tử nấm

sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền
phù bào tử có mật độ cao nhất (đối
với một số chủng có số lượng bào
tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ
một vài ống thạch bào tử khác
nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch
bào tử cho vào ống đông khô (0,2 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13
ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi
các thông tin cần thiết như mã số
chủng, ngày bảo quản, môi trường
và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy
bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Giữ ở -80°C trong 3 giờ
trước khi tiến hành đông khô, đồng
thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt


độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông
khô của Dura-Stop, bật máy DuraDry, khi mức độ chân không đạt 45
minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt
O
độ Dura-Stop lên -5 C, để qua
đêm.
4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop
lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết,
tắt máy hút chân không nhưng
không tắt Dura-Dry.
5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối
tube mẫu vào hệ thống manifold,

bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn
ống khi độ chân không đạt 45-48
minitor, nhiệt độ -55OC.


Chú ý: Trong trường hợp chỉ
dùng Dura-Dry có thể được thực
hiện như sau:
Tiến hành các bước
1,2,3,4 như trên.
Mẫu được để tiền đông
khô ở -80°C trong 3 giờ. Bật
máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt
độ -60oC đến -55oC, độ chân
không 45 minitor, gắn ống
mẫu với hệ thống manifold
tiến hành hàn ống khi độ chân
không đạt 45-48 minitor, nhiệt
độ -55oC.
Kiểm tra độ sống sót sau khi
đông khô:
-


1, Mở ống đông khô bằng
cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn
và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt.
2, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 1ml nước cất vô trùng từ
ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất

vô trùng làm tan đều mẫu đông
khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù
sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước
cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí
khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên
môi trường thạch đĩa thích hợp và
nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo
một hướng như hình vẽ:


3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao
quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ
thích hợp.
4, Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.
Khá:
50 – 100 khuẩn
lạc.
Trung bình: 10-50 khuẩn
lạc.
Kém: < 10 khuẩn lạc.
Không mọc.


Bảo quản được thực hiện với
các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên,
có một số nấm sợi mà khuẩn lạc
mọc tràn lan thì có thể đánh giá
như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc
đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ

đông khô là thành công nếu như số
khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa
bề mặt môi trường trong đĩa petri.
Các mẫu có số lượng khuẩn lạc
mọc dưới mức trên phải làm tăng
mật độ bào tử trước khi đông khô
như thay đổi môi trường sinh bào
tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù
bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử
nấm sợi.


d. Bảo quản nấm sợi bằng
phương pháp đông khô trực
tiếp:
Phương pháp đông khô trực tiếp
thực hiện tương tự như phương
pháp đông khô đã trình bày ở trên
và được thực hiện như sau:
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic
cleaner) trong 15 phút sau đó
khử trùng 170oC trong 3 giờ.
2, Môi trường L-drying chuẩn
có thành phần như sau:
Đệm phosphat: 0.1M :
100 ml.
Monosodium glutamat: 3 g
Adonitol: 1.5 g.

(Khử trùng ở 115oC/20
phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể
đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ
theo từng chủng môi trường nuôi
cấy mà thời gian thu bào tử thích
hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy
khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh
trùng ở trên cho vào ống nghiệm
chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy
tạo dịch huyền phù bào tử nấm có
mật độ cao nhất (đối với một số
chủng có số lượng bào tử thấp thì
có thể tạo dịch bào tử từ một vài
ống thạch bào tử khác nhau).


2, Dùng pipet pasteur lấy dịch
bào tử cho vào ống đông khô (0,2
ml), thông thường chuẩn bị 13 ống
cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các
thông tin cần thiết như số mã
chủng, ngày bảo quản, môi trường
và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy
bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Đồng thời bật máy DuraDry, khi mức độ chân không đạt 45
minitor, nhiệt độ -75oC, lần lượt nối

ampoule mẫu vào hệ thống
manifold (chú ý khoá van chân
không khi nối ampoule mẫu với
tube manifold sau đó lại mở ra, để
đảm bảo độ chân không cần thiết
khi làm đông khô phải lần lượt đưa
mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho


phép). Khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ -55oC tiến
hành quá trình làm khô trong 3 giờ.
4, Hàn kín ampoule mẫu:
Khi máy cô Dura-Dry đang
chạy để đảm bảo độ chân không
cần thiết, lần lượt khoá van cho
từng ampoule mẫu và tiến hành hàn
với các mẫu này tại vị trí ống bị
thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt
nóng phần ống thắt cho đều các
phía và xoay đều cho thuỷ tinh
chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn
lửa gas để cắt rời phần trên (nối với
manifold) và phần dưới chứa mẫu.
Hết đợt lại khoá các van của các


ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần
lượt như trên.
Kiểm tra chất lượng ngay sau
khi bảo quản:

Để kiểm tra độ sống sót
của mẫu nấm sợi bảo quản, có
thể thực hiện theo cách đã
được mô tả ở phần đông khô.
Kiểm tra độ thuần chủng:
các mẫu được cấy trên môi
trường thích hợp và quan sát
hình thái và các đặc điểm sinh
học đặc trưng cần thiết để đánh
giá khả năng tạp nhiễm và đặc
tính sinh học.
Thí nghiệm đánh giá
nhanh thời gian bảo quản: các
-


mẫu sau đông khô trực tiếp
được giữ ở 37oC trong 2 tuần.
Độ sống sót của mẫu bảo quản
giảm trong 2 tuần ở 37oC
tương đương với bảo quản 10
năm ở 4oC.
e. Bảo quản nấm sợi bằng
phương pháp lạnh sâu -80 oC và
o
nitơ lỏng (-196 C):
Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng