GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH học phần 1

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1.

Khái niệm về Công nghệ Sinh học (CNSH)

Công nghệ Sinh học (Biotechnology) là một thuật ngữ xuất hiện cách đây
khoảng 25 năm sau khi có khi có những thành tựu của công nghệ gen (kỹ thuật tái tổ
hợp DNA). Có nhiều đònh nghóa khác nhau về CNSH, tuy nhiên đònh nghóa theo Liên
đoàn Công nghệ Châu âu được nhiều người chấp nhận nhất:
Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp có sự
tham gia của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa
trên các thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của
cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người.
Như vậy CNSH không phải là một môn khoa học như hoá, lý, sinh học, hay
sinh học phân tử, … mà là một phạm trù sản xuất (công nghệ). Tác nhân sinh học ở
mức độ cơ thể như động vật, thực vật, ở mức độ tế bào như tế bào vi sinh vật và ở
mức độ dưới tế bào như gen, enzyme.
Công nghệ sinh học có tính chất liên ngành, nó ứng dụng những thành tựu
của nhiều ngành khoa học vào sản xuất như di truyền học, hoá sinh học, sinh lý học,
vi sinh vật học, hoá học, tin học, cơ khí, …
Từ đònh nghóa trên cho thấy công nghệ gen không phải là CNSH mà nó chỉ
là một thành phần chủ chốt, là cơ sở, là động lực để thúc đẩy sự phát triển cực kỳ
nhanh chóng của công nghệ sinh học.
1.2. Phân loại công nghệ sinh học
Tuỳ theo cách nhìn khác nhau mà công nghệ sinh học được phân loại theo các
kiểu khác nhau. Xét về tác nhân sinh học tham gia vào quá trình CNSH có thể
chia thành các nhóm sau:
-

CNSH động vật (Animal Biotechnology)

-

CNSH thực vật ( Plant Biotechnology)

-

CNSH vi sinh vật (Microbial Biotechnology)

-

CNSH enzyme hay CN enzyme (Enzyme Biotechnology)

Ngoài ra còn có các khái niệm khác như CN protein (Protein Engineering),
CN gen (Gene Engineering). CN gen và CN protein luôn luôn xuyên suốt và là công
nghệ chìa khoá nằm trong CN thực vật, CN động vật và CN vi sinh vật.
Dựa trên đối tượng phục vụ người ta cũng có thể chia CNSH thành:
-

CNSH nông nghiệp

-

CNSH y tế

-

CNSH môi trường

1

-

CNSH năng lượng

-

CNSH vật liệu

-

CNSH chế biến thực phẩm

-

CNSH hoá học…

Cách đây trên 8000 năm con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong sản xuất
bia, phomat, yoghurt, dấm. Do đó một số tác giả lại cho rằng CNSH đã được con
người sử dụng từ rất lâu. Vì vậy CNSH có thể chia thành hai nhóm:
-

CNSH cổ điển (Ancient Biotechnology)

-

CNSH hiện đại (Mordern Biotechnology)

Trong bài giảng này sẽ được trình bày theo cách phân loại CNSH theo đối
tượng phục vụ.

1.3.

Lòch sử phát triển của CNSH

Điểm lại lòch sử cho thấy tổ tiên chúng ta cũng đã biết sử dụng các qui trình
CNSH trong thực tiễn cuộc sống của mình như làm bánh mì, nấu rượu bia, làm
phomat... Tuy nhiên họ không hiểu bản chất của các quá trình công nghệ ấy mà
hành động theo kinh nghiệm và cảm tính.
Đến cuối thế kỷ 19, Pasteure đã chỉ ra rằng vi sinh vật đóng vai trò quyết
đònh trong các quá trình lên men . Kết quả nghiên cứu của Pasteure là cơ sở cho sự
phát triển của ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu cơ như aceton,
ethanol, butanol, isobutanol... vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20.
Dần dần các quá trình lên men sản xuất dung môi hữu cơ được thay thế bằng
ngành công nghiệp sản xuất hoá chất từ dầu mỏ. Cũng trong giai đoạn này đã có
những xu hướng cải tiến công nghệ lên men truyền thống. Ví dụ: trong công nghệ
lên men ethanol nếu bổ sung vào môi trường lên men bisulphite (HSO 3-) thì quá trình
tích luỹ sẽ theo hướng tạo glycerol thay vì hướng tích luỹ ethanol. Glycerol rất cần
để chế tạo thuốc nổ.
Giai đoạn phát triển quan trọng thứ hai là quá trình phát triển của CNSH sản
xuất thuốc kháng sinh penicilin. Năm 1928 Alexander Fleming đã phát hiện được
khả năng kháng khuẩn của nấm mốc Penicillum notatum. Tuy nhiên đến năm 1940
sản xuất penicillin được sản xuất trên qui mô lớn. Thuốc kháng sinh penicillin đã
cứu hàng triệu thương binh trong thế chiến thứ hai. Trong thời kỳ này có một số cải
tiến kỹ thuật và thiết bò lên men vô trùng cho phép làm tăng đáng kể năng suất lên
men. Ngày nay ngành công nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh có doanh thu trên 16
tỷ USD (1994).

2

Sau thế chiến thứ hai, là giai đoạn hoàn thiện các qui trình CNSH truyền
thống, như tối ưu hoá quá trình lên men, chọn lọc và tạo ra các chủng vi sinh vật đột
biến siêu tổng hợp, làm tăng năng suất lên men. Song song với những kết quả này
các nghiên cứu sinh học phân tử, hoá sinh học có bước phát triển nhảy vọt làm cơ sở
cho sự hình thành và phát triển cực kỳ nhanh chóng của CNSH hiện đại. Đầu tiên
phải kể đến công trình của Watson và Crick về mô hình xoắn kép DNA (1953). Sau
đó là sự phát hiện hàng loạt các cấu trúc bậc I của các phân tử protein như insulin
của Sanger (1955). Sự phát hiện của restriction enzyme vào năm 1968 là công cụ
quan trọng của kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Năm 1972 đánh dấu một mốc quan trọng
của CNSH khi Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) đã tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp trong in
vitro. Từ thành công này mở đầu cho sự phát triển như vũ bão của công nghệ gen,
một cuộc cách mạng thực sự đối với sự phát triển sinh học và là động lực thúc đẩy
sự phát triển mạnh mẽ của CNSH, ngành công nghệ của thế kỷ 21.
1.4.

Triển vọng phát triển của CNSH ở thế kỷ 21

Như nhiều nhận đònh của các nhà khoa học và kinh tế thì thế kỷ 21 sẽ là kỷ
nguyên của CNSH và công nghệ thông tin. Một điều lý thú là hai nghành công nghệ
mũi nhọn của thế kỷ 21 này có mối quan hệ chặt chẽ, tương hỗ cùng thúc đẩy nhau
phát triển không ngừng. Ví dụ: máy tính giúp các nhà sinh học xây dựng nhanh
chóng mô hình phân tử protein, enzyme, thuốc, tìm ra mô hình ưu việt nhất như cho
hoạt tính sinh học cao hơn, chòu nhiệt tốt hơn bằng cách tạo ra cầu nối –S-S-. Máy
tính giúp các nhà sinh học thực hiện nhanh hơn chương trình giải mã bộ gen. Ngược
lại CNSH ngày nay đang mở ra một tiềm năng to lớn cho công nghệ máy tính. Đó là
các dự án triển vọng sản suất các chip sinh học (bọ điện tử). Đó là việc phát hiện ra
phân tử protein Bacteriorhodopsine của vi khuẩn Halobacterium hấp thụ ánh sáng và
dẫn đến biến đổi cấu trúc nội tại giống như lý thuyết nhò phân (có, không) cơ bản
của máy tính. Chip sinh học có khả năng lưu trữ thông tin rất lớn 1 bit/1nm 3 so với
1bit/1012nm của máy tính hiện nay. Số lượng bài toán giải được trong 1s là 10 20 so

với 1012 của máy tính nhanh nhất. Ngoài ra chip sinh học ít tiêu tốn năng lượng.
Triển vọng tiếp theo của CNSH phải kể đến các chương trình giải mã bộ gen
của người, vi sinh vật, thực vật (GENOMICS). Đáng chú ý nhất là chương trình giải
mã bộ gen người với 3 tỷ nucleotide, chứa hơn 100.000 gen hiện nay đã có những
bước tiến đáng kể và dự tính là đến năm 2010 sẽ giải mã và xác đònh chức năng của
tất cả các gen. Thành tựu này có ý nghóa quan trọng trong liệu pháp gen, chữa trò tận
gốc các bệnh di truyền, bệnh ung thư, AIDS và nhiều bệnh khác. Công việc này
cũng tiến hành tương tự với vi sinh vật, thực động vật và sẽ là một trong những
thành tựu vó đại nhất của con người trong tìm hiểu sinh giới.

3


Các triển vọng khác trong nông nghiệp là các động vật chuyển gen
(transgenic animal), thực vật chuyển gen (transgenic plant), tiếp tục được phát triển
và nhân rộng. Đưa các gen kháng thuốc diệt cỏ, các gen tổng hợp thuốc trừ sâu sinh
học, gen tạo nốt sần cố đònh nito, gen cho năng suất cao, chất lượng tốt, dễ bảo quản
cho cây trồng. Đối với vật nuôi chuyển gen kháng bệnh, tăng chất lượng thòt, tạo
dòng vô tính (như cừu Dolly) để sản xuất ra hàng loạt vật nuôi cho năng suất và chất
lượng thòt tốt. Ngoài ra đưa các gen mã hoá cho hocmon, vaccin, thuốc vào trong
thực vật, tuyến sữa của vật nuôi để con người phòng và chữa bệnh bằng cách ăn
chuối hoặc uống sữa.
Tài nguyên sinh học và môi trường cũng là một lãnh vực hứa hẹn những phát
triển và ứng dụng của CNSH trong thế kỷ 21. Chúng ta tin tưởng rằng CNSH thế kỷ
21 sẽ giúp con người phát triển bền vững hơn nữa tài nguyên và môi trường sống
của mình.

4

5


CHƯƠNG II: KỸ THUẬT TÁI TỔ HP DNA
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA technology) thường được gọi là
kỹ thuật di truyền ra đời trên cơ sở hàng loạt những thành tựu của sinh học phân tử,
hoá sinh học, vi sinh vật học, di truyền học, … Kỹ thuật tái tổ hợp DNA bao gồm một
tập hợp các kỹ thuật tách, cắt, nối ghép, chuyển và biểu hiện gen như mong muốn.
Sự ra đời của kỹ thuật tái tổ hợp DNA bắt đầu từ những năm 1972-1973 khi
nhóm nghiên cứu của Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) lần đầu tiên tạo được một phân từ
DNA tái tổ hợp từ ba nguồn vật liệu khác nhau là bộ gen của virus SV 40 gây bệnh
ung thư ở khỉ, một phần của bộ gen phage λ và các gen của operon lactose của vi
khuẩn E. coli. Đến năm 1977 có thể coi là một mốc lòch sử của kỹ thuật tái tổ hợp
DNA với thành tựu của Boyer tạo ra hoc môn của não Somatostatin từ E. coli được
chuyển gen. Sau đó một năm cũng Boyer tạo ra insulin (hoc môn tuyến t) từ E.
coli.
Có hai phát hiện quan trọng là công cụ cơ bản của kỹ thuật di truyền là sự
phát hiện restriction enzyme và vector plasmid.
2.1. Các enzyme rectriction endonuclease
Năm 1962 Arber lần đầu tiên đã chứng minh rằng vi khuẩn có những
enzyme đặc biệt có khả năng phân biệt được DNA của mình và DNA lạ. Các
enzyme này có khả năng hạn chế (rectriction) sự phát triển của các phage trong tế
bào vi khuẩn bằng cách phân huỷ DNA của phage một cách đặc hiệu, do đó các
enzyme này được gọi là enzyme cắt hạn chế (restriction enzyme). Các restriction
enzyme có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.
Các restriction enzyme là một endonuclease nghóa là chúng cắt liên kết
phospho diester của phân tử DNA ở những điểm đặc hiệu nằm trong chuỗi DNA.
Các restriction enzyme chia làm ba nhóm, nhưng nhóm II là nhóm thường được sử
dụng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Các restriction enzyme nhóm II nhận biết DNA
mạch kép ở những trình tự nhận biết và cắt ngay điểm nhận biết hoặc kế cận. Các

trình tự nhận biết (recognition sequences) thường có 4 – 6 cặp nucleotide, đôi khi
tới 8 cặp nucleotide. Những trình tự nhận biết đối xứng đảo ngược nhau gọi là
palindrom.
Mỗi một restriction enzyme có trình nhận biết đặc trưng. Nếu vò trí cắt của
restriction enzyme ở giữa trình tự nhận biết thì tạo nên chuỗi DNA đầu bằng (blunt
ends) . Ví dụ:
-

Enzyme Hae III (Từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium) có trình tự:

---G G C C------C C G G---Trình tự nhận biết

----G G
C C-------C C
G G---Đầu bằng

Hae III

6


Nếu vò trí cắt nằm cạnh trình tự nhận biết thì tạo ra đầu lệch, còn gọi là đầu
dính (cohesive ends). Khi tạo thành đầu dính vì các base bổ sung nhau nên phân tử
DNA dễ gắn lại với nhau như lúc chưa bò cắt . Ví dụ:

7


-

Enzyme EcoR I ( Từ vi khuẩn E.coli):

----G A A T T C---EcoR I
----C T T A A G---Trình tự nhận biết của EcoR I

----G
A A T T C-------C T T A A
G---Đầu dính .

----G G A T C C---Bam HI- Enzyme Bam
----G HI (Từ GViA Tkhuẩ
C C---n Bacillus
----C amyloliquefaciens)
C T A G G-------C C T A G
G---Trình tự nhận biết của Bam HI
Đầu dính

Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 500 restriction enzyme với
trên 120 trình tự nhận biết khác nhau.
2.2. Thu nhận gen
Ngay từ năm 1969 Becwitt và Shapiro đã phân lập được gen từ operon lactose
của E.coli bằng các phương pháp vật lý và di truyền vi sinh cổ điển. Ngày nay
nguồn gen được thu nhận bằng ba phương pháp:
2.2.1. Tách thu nhận gen từ bộ gen
Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của kỹ thuật tái tổ
hợp DNA. Toàn bộ bộ gen của sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn 15.000 –
20.000 cặp base bằng phương pháp cơ học hoặc bằng restriction enzyme. Sau đó
các đoạn DNA này được gắn vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp. Đây là phương
pháp mang tính chất ngẫu nhiên, mò mẫm vì bộ gen của sinh vật chứa rất nhiều
gen nên rất khó phân lập được gen cần thiết một cách chính xác (Ví dụ: ở người

có trên 100.000 gen). Tuy nhiên phương pháp này hiện nay vẫn sử dụng để
thành lập ngân hàng gen của các sinh vật (bank of genomic DNA).
2.2.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học
Năm 1969 nhóm của Khorana đã tổng hợp nhân tạo được gen đầu tiên là gen
mã hoá tổng hợp tRNA của alanin của nấm men. Gen này có chiều dài 77 cặp
nucleotide, nhưng do không có trình tự điều hoà nên không hoạt động.
Để tổng hợp nhân tạo gen bằng phương pháp hoá học cần biết được trình tự
nucleotide của gen. Trình tự nucleotide của gen được xác đònh phương pháp
nghiên cứu trình tự axit amin của protein mà gen mã hoá hoặc bằng các phương
pháp xác đònh trình tự nucleotide.

8


Lần đầu tiên vào năm 1977, Itakura và Boyer đã tổng hợp thành công gen mã
hoá cho hoc mon somatostatin của động vật có vú, và gen này đã biểu hiện
trong tế bào E. coli. Sau thành công này nhiều gen đã được tổng hợp nhân tạo
như gen mã hoá cho protein như gen tổng hợp hoc mon tăng trưởng của người
somatotropin, hoc mon trò tiểu đường insulin.
2.2.3. Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng
Đây là phương pháp mà ngày nay kỹ thuật tái tổ hợp DNA sử dụng rộng rãi.
Phương pháp này dựa vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên
mã ngược là reverse transcriptase. Đây là enzyme xúc tác cho quá trình tổng
hợp nên DNA một mạch từ khuôn mRNA. DNA tổng hợp từ mRNA gọi là cDNA (complementary DNA). Từ c-DNA mạch đơn sẽ tổng hợp thành c-DNA
mạch kép nhờ enzyme DNA polymerase và nuclease S1 (hình 2.1).

Hình 2.1: Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Eukaryote quá trình phiên mã xảy ra khá phức tạp. Sau khi mRNA được
tổng hợp từ gen (tiền mRNA) thì mRNA phải trải qua giai đoạn trưởng thành
(splicing) cắt bỏ những đoạn intron và nối các đoạn exon lại và ra tế bào chất để

tổng hợp protein. Như vậy nếu tách được m RNA trưởng thành để tổng hợp cDNA thì
gen sẽ mã hoá một cách chính xác cho protein.

9


Để tách mRNA người ta dựa vào tính chất của mRNA có gắn đuôi poly A nên
rất dễ tách nó ra khỏi hỗn hợp RNA bằng cách cho hỗn hợp chảy qua cốt có gắn
poly T. Ngoài ra cơ thể động vật có nhiều tế bào chuyên hoá như tế bào tuỷ
xương tổng hợp hồng huyết cầu do đó trong tế bào này rất giàu mRNA của
globin, hoặc tuyến tơ của tằm chứa nhiều mRNA mã hoá tổng hợp fibroin do đó
rất dễ tách mRNA.
Bằng phương pháp này người ta đã tổng hợp được gen globin của người, động
vật, chim, gen mã hoá ovalbumin trứng, fibroin tơ tằm, inteferon của người…
2.3. Các vector chuyển gen
Để chuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác có thể thực hiện biến nạp
bằng DNA hoặc bơm thẳng DNA vào tế bào. Tuy nhiên bằng cách đơn giản này
hiệu quả thấp vì phần lớn DNA lạ xâm nhập vào tế bào sẽ bò phân huỷ, DNA
không tái tổ hợp thì không thể tự sao chép thành nhiều bản, do đó nó sẽ mất
dần.
Vì vậy cần phải có các vector để vận chuyển gen. Vector chuyển gen là một
phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được
gen cần chuyển. Các vector phải thoả mãn yêu cầu tối thiểu sau đây:
-

Có trình tự khởi sự sao chép ori (Origin) để có thể tự sao chép mà tồn tại
độc lập.

-

Có các trình tự nhận biết (recognition sequence) để các restriction
enzyme cắt và gắn gen lạ vào. Các trình tự nhận biết này phải cách xa
trình tự khởi sự sao chép để tránh bò cắt nhầm.

-

Có các trình tự điều hoà (promoter) để có thể phiên mã gen lạ.

-

Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện gen lạ trong quá trình chọn
lọc tế bào tái tổ hợp.

-

Các vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể mang một
lượng tối đa DNA lạ. Hơn nữa kích thước của vector nhỏ thì dễ dàng xâm
nhập vào vi khuẩn và sao chép nhanh, hiệu quả hơn.

2.3.1. Các vector chuyển gen là plasmid
Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5 kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc
thể, được tìm thấy lần đầu tiên ở vi khuẩn. Sự sao chép của plasmid không phụ
thuộc vào sự sao chép của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Plasmid thường mang các gen
kháng thuốc kháng sinh như gen kháng tetracilin (Tc R), gen kháng ampicilin (ApR).
Mỗi tế bào vi khuẩn chứa tới hàng trăm plasmid. Các vector plasmid có thể nhận 8-9
kb DNA lạ.

10

Ví dụ: plasmid pBR 322 là một plasmid thông dụng, pBR 322 có 4363 bp,
mang hai gen kháng thuốc kháng sinh là Ap R và TcR và 20 vò trí nhận biết duy nhất
duy nhất của các restriction enzyme (hình 2.2). 11 trong số đó nằm vào các gen
kháng thuốc kháng sinh nên việc gắn xen một gen lạ vào một trong các vò trí đó sẽ
làm mất tính kháng kháng sinh tương ứng, điều này rất tiện lợi để chọn lọc tế bào tái
tổ hợp.

Hình 2.2: Cấu trúc plasmid pBR 322 với 20 trình tự nhận biết của restriction
enzyme.
Hiện nay plasmid đã trải qua ba thế hệ, các plasmid không ngừng được cải
tiến, ngày càng có thêm nhiều đặc tính q cho kỹ thuật tái tổ hợp.
2.3.2. Các vector phage
Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn. Việc sử
dụng các phage làm vector có nhiều ưu điểm hơn so với plasmid :
-

Phage được trang bò một hệ thống xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và có
khả năng sinh sôi rất nhanh vì vậy hiệu quả xâm nhiễm của phage cao
hơn nhiều so với plasmid.

-

Kích thước đoạn gen lạ mà vector phage mang được lớn hơn rất nhiều so
với plasmid. Phage có thể tiếp nhận gen lạ có kích thước từ 15-23 kb.

Phần lớn các vector phage sử dụng hiện nay đều bắt nguồn từ phage λ. Phage
λ có kích thước là 48502 bp. Tuy nhiên phage λ có 1/3 số base không quan trọng
(stuffer) có thể cắt bỏ để tăng khả năng nhận gen lạ có kích thước lớn hơn .
2.3.3. Các loại vector khác

11


Nhóm này bao gồm các vector ít thông dụng hơn, như các vector cosmid,
nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men, nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú.
Trong đó các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú (MAC- Mammifere
Artificial Chromosome) là hệ thống mới nhất đang được phát triển . ở vector này
trình tự TEL (telomeric sequence-trình tự đầu cuối của nhiễm sắc thể) và trình tự
CEN (centromeric sequense- trình tự trung tâm của nhiễm sắc thể) có nguồn gốc từ
người, điều này cho phép đưa MAC vào tế bào động vật có vú và giữ chúng ổn đònh
trong tế bào. MAC thường được ứng dụng trong liệu pháp gen.

2.4. Tạo plasmid tái tổ hợp
Có ba phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp là phương pháp sử dụng đầu dính
(cohesive ends), phương pháp sử dụng các đoạn nối (polylinkers) và phương pháp
dùng enzyme terminal transferase.
2.4.1. Phương pháp sử dụng đầu dính (cohesive ends)
Ở phương pháp này vector chuyển gen là plasmid (DNA vòng tròn) được cắt
bởi một loại restriction enzyme (Ví dụ: EcoRI) chuyển thành dạng thẳng có hai đầu
dính là AATT và ngược lại. Phân tử DNA lạ cũng được cắt bởi enzyme EcoRI để tạo
thành các đoạn DNA có hai đầu dính. Trộn lẫn DNA của vector và DNA lạ đã được
cắt bởi EcoRI lại với nhau, các đầu dính của DNA lạ và vector bổ sung sẽ bắt cặp
với nhau. Enzyme ligase sẽ nối DNA lạ và DNA của vector lại với nhau bằng cầu
phosphodiester tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp (hình 2.3).

12


Hình 2.3: Gắn DNA lạ vào vector bằng phương pháp dùng đầu dính.
2.4.2. Phương pháp dùng các đoạn nối (linkers)

Các đoạn nối (linkers) là các đoạn oligonucleotide có chiều dài từ 10-20
nucleotide được tổng hợp hoá học. Trong mỗi đoạn linker phải mang một trình tự
nhận biết đặc hiệu của một restriction enzyme nào đó. Sau đó dùng enzyme DNA
ligase của phage T4 nối các đoạn này với DNA lạ. Cắt vector chuyển gen và DNA lạ
nối linker bằng restriction enzyme tương ứng với trình tự nhận biết của linker (dó
nhiên vector chuyển gen phải có trình tự nhận biết của restriction enzyme đó).tạo ra
đầu dính ở hai đầu vector và DNA lạ. Nhờ đó mà DNA lạ có thể gắn vào vector khi
hỗn hợp với nhau và có sự xúc tác của ligase (hình 2.4). Phương pháp này thường
dùng trong trường hợp DNA lạ và vector không có cùng trình tự nhận biết của
restriction enzyme. Ví dụ : mạch kép cDNA, hoặc DNA có đầu bằng (blunt ends).

13


Hình 2.4: Phương pháp dùng các đoạn nối linkers tạo DNA tái tổ hợp.
2.4.3. Phương pháp dùng enzyme terminal transferase.
Enzyme terminal transferase có hoạt tính xúc tác tổng hợp các đoạn
homonucleotide (ví dụ: GGGG hoặc CCCC) ở đầu 3 ’-OH của chuỗi DNA để hình
thành đầu dính cho DNA lạ và vector chuyển gen (hình 2.5).

14


Hình 2.4: Phương pháp dùng enzyme terminal transferase gắn DNA lạ vào
vector.
Vector chuyển gen và DNA lạ cần gắn được cắt bởi exonuclease hoặc
restriction enzyme (Ví dụ: Pst I). Sau đó vector được ủ với enzyme terminal
transferase và một loại nucleotide (dGTP), kết quả tạo thành ở hai đầu mút 3 ’OH
của vector một đoạn poly G (3’ GGGGG). Đoạn DNA lạ sau khi cắt bởi exonuclease
cũng được ủ với enzyme terminal transferase nhưng bổ sung vào môi trường ủ là

dCTP để tạo đuôi 3’ CCCCC bổ sung với đuôi GGGGG của vector. Nhờ đó mà DNA
lạ có thể gắn vào vector do bắt cặp bổ sung giữa G và C. Giai đoạn cuối cùng là
dùng enzyme DNA polymerase I lấp chỗ trống và ligase hàn dính DNA lạ với vector
tạo nên DNA tái tổ hợp. Với phương pháp này có thể gắn DNA lạ vào bất kỳ vector
chuyển gen nào.
2.5. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
Sau khi tạo được DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp sẽ được đưa vào tế bào (vi
khuẩn, tế bào động vật hoặc thực vật) để gen lạ hoạt động. Quá trình này gọi là biến
nạp.
2.5.1. Hoá biến nạp
Để biến nạp DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn thì dùng tế bào vi khuẩn không
chứa plasmid xử lý với CaCl2 lạnh kèm theo sốc nhiệt ở 42 0C trong 2 phút thì DNA
tái tổ hợp có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn.
Đối với tế bào động vật có vú thì khó biến nạp hơn. Người ta sử dụng
phsphate canxi làm trung gian cho DNA tái tổ hợp biến nạp. Hiệu quả thấp, chỉ từ 12% tế bào hấp thụ.
2.5.2.Điện biến nạp
Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ (ngắt quãng) có thể giúp tế bào hấp thụ
được DNA tái tổ hợp. Vì vậy phương pháp này gọi là điện biến nạp
(electrotransformation). Phương pháp này có hiệu quả biến nạp cao hơn hoá biến
nạp nhưng tỷ lệ tế bào bò chết do sốc điện cao, có thể từ 50-70%.
2.5.3. Phương pháp vi tiêm
Đối với các tế bào động vật có vú có thể tiêm thẳng DNA vào tế bào (thường
là hợp tử) như hình chụp (hình 2.6).

15


Hình 2.6: Tiêm DNA lạ vào tế bào trứng (hợp tử) của chuột.

2.5.4. Phương pháp bắn DNA vào tế bào

Ở tế bào thực vật có vách tế bào rất dày cấu tạo bằng cellulose vì vậy rất
khó biến nạp. Để khắc phục khó khăn này người ta dùng phương pháp bắn DNA vào
tế bào. DNA thường được bọc trong các hạt kim loại như vàng, tungsten có kích
thước khoảng 4 µm và được bắn bào tế bào. Phương pháp này rất phổ biến để tạo
thực vật chuyển gen.
Ngoài các phương pháp trên đối với các vector cấu tạo từ virus chúng có hệ
thống tự xâm nhiễm vào tế bào rất hiệu quả vì vậy hiệu quả biến nạp rất cao.
2.6. Phương pháp chọn lọc, tạo dòng và biểu hiện gen
Sau khi tiến hành biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn , công việc
tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của DNA lạ mong muốn, chọn lọc đúng những tế
bào có mang DNA lạ và nhân lên thành dòng và tạo điều kiện cho sự biểu hiện của
gen lạ này (DNA lạ).
2.6.1. Phương pháp xác đònh dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
2 Do hiệu suất tái tổ hợp vàbiến nạp thường thấp, vì vậy dòng vi khuẩn mọc lên sẽ
có ba loại:
3

- Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid.

4

- Tế bào nhận được plasmid không mang gen la.ï

5

- Tế bào nhận được plasmid tái tổ hợp.

6 Hiện nay có nhiều phương pháp để chọn lọc dòng vi khuẩn có mang gen tái tổ
hợp như phương pháp lai DNA với mẫu thử đánh dấu phóng xạ, phương pháp sử
dụng kháng thể. Tuy nhiên hai phương pháp đơn giản nhất và sử dụng đầu tiên là

phương pháp bổ sung α và phương pháp dùng các gen kháng kháng sinh đánh dấu.
7

+ Phương pháp bổ sung α:

16


8 Nhiều vector chuyển gen có mang gen lacZ (mã hoá cho enzyme βgalactosidase). Khi trong môi tường nuôi cấy có chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-galactose) thì enzyme β-galactosidase sẽ phân huỷ X-gal cho ra màu xanh.
Khi gắn gen lạ vào vector người ta sẽ cho gắn vào giữa gen này làm cho nó mất hoạt
tính β-galactosidase, khi đó chất X-gal có màu trắng. Vì vậy sau khi nuôi cấy hỗn
hợp tế bào vi khuẩn tái tổ hợp trên môi trường có bổ sung X-gal thì khuẩn lạc nào
màu trắng chứng tỏ có mang gen lạ để chọn lọc và nhân lên thành dòng (cloning).
9

+ Phương pháp sử dụng gen kháng kháng sinh đánh dấu:

10 Một số vector plasmid thương mang gen kháng ampicillin (Ap R) và kháng
tetracillin (Tc R). Khi gắn gen lạ vào vector người ta thương chủ tâm gắn vào vò trí
của một trong hai gen này và làm mất hoạt tính kháng thuốc của nó (ví dụ : mất hoạt
tính gen Tc R). Khi cấy vi khuẩn đã được biến nạp trên môi trường có thuốc kháng
sinh là ampicillin và tetracillin thì những vi khuẩn bò ức chế bởi tetracillin chứng tỏ
bò mất hoạt tính kháng tetracillin do xen đoạn gen lạ và được chọn lọc ra nhân lên
thành dòng.
2.6.2. Sự biểu hiện của gen được tạo dòng
Không phải tất cả các gen lạ khi được tái tổ hợp và đưa vào tế bào đều có thể
biểu hiện. Sự biểu hiện của gen được trải qua hai bước là:
-

Gen đó được phiên mã để tông hợp nên mRNA.

-

m RNA đó có đầy đủ chức năng để tham gia vào quá trình dòch mã tổng
hợp nên protein.

Vì vậy để cho gen biểu hiện tối đa cần có các yêu cầu sau:

2.7.

-

Cần có một số lượng các bản sao hợp lý của vector plasmid trong một tế
bào

-

Gen phải có một promoter mạnh để phiên mã tốt.

-

mRNA phải có có trình tự khởi đầu, kết thúc, có điểm bám của ribosome
(rbs) cho quá trình dòch mã

-

Gen tái tổ hợp phải có sự ổn đònh lâu dài.

Một số ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp DNA

Tóm tắt các bước của kỹ thuật tái tổ hợp DNA và một số ứng dụng của nó
được trình bày trong hình 2.7 và sẽ đề cập trong các chương sau.

17


Hình 2.7: Kỹ thuật tái tổ hợp DNA và một số ứng dụng
CHƯƠNG III: CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHIỆP
Trong chương này đề cập một cách khái quát những qui trình công nghệ trong
công nghiệp thực phẩm và hoá chất có sự tham gia của vi sinh vật cũng như những
đóng góp của CNSH hiện đại để nâng cao hiệu suất của các qui trình trên.
3.1. CNSH trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trước đây trong công nghiệp thực phẩm, các nghiên cứu CNSH chủ yếu tập
trung để hoàn thiện qui trình công nghệ lên men truyền thống (như nghiên cứu về tối
ưu môi trường nuôi cấy, thiết bò nồi lên men, …). Hiện nay các nghiên cứu CNSH chủ
yếu liên quan đến việc tạo ra các chủng mới có năng suất sinh học cao, có thể bằng
phương pháp gây đột biến hoặc hiện đại hơn là ứng dụng kỹ thuật di truyền trong tạo
dòng (cloning) và các kỹ thuật lên men hiện đại như kỹ thuật cố đònh tế bào,
enzyme.
CNSH trong công nghiệp thực phẩm gồm có các qui trình chế biến sữa, chế
biến tinh bột, qui trình sản xuất nước uống lên men, qui trình sản xuất thực phẩm
giàu protein, …
3.1.1. Công nghiệp chế biến sữa
Các qui trình chế biến sữa như sản xuất phoma, sữa chua, đã có từ rất lâu.
Tuy nhie6 các qui trình truyền thống sử dụng chủng vi khuẩn tự nhiên
(Lactobacillus, Streptococus) có mặt trong sữa để lên men do đó khó kiểm soát, chất
lượng không ổn đònh và hiệu quả không cao. Ngày nay nhờ việc tạo ra các chủng có
hoạt tính cao, thuần khiết nên có thể điều khiển các quá trình lên men này một cách
có đònh hướng và rút ngắn được qui trình sản xuất, nâng cao và ổn đònh chất lượng.
Ví dụ: qui trình sản xuất phoma truyền thống như sau:

Lên men, tạo acid
Tách sữa đông
Sữa
Đông tụ
L.bulgaricus
đun nóng, tạo hình
18
S. lactis

Tạo mùi vò
Ủ chín

4 – 20 tháng

Phoma


Lê

Ơ bước (1) sữa được lên men với các vi khuẩn lên men tạo axit gây đông tụ
protein, để rút ngắn giai đoạn này ngày nay người ta thường thêm renin (enzyme
gây đông tụ sữa của bê non) thúc đẩy quá trình đông tụ. Sau khi tách sữa đông sẽ
đun nóng, tạo hình, thêm muối để ủ chín. Giai đoạn ủ chín rất dài (ở nhiệt độ thấp)
với mục đích tạo hương vò để tăng chất lượng phoma. Để rút ngắn giai đoạn này mà
không làm giảm chất lượng của phoma, gần đây người ta tìm được enzym peptidase
của Bacillus subtilis rất thích hợp với mục đích này, làm rút ngắn thời gian ủ chín
còn một nửa thời gian.
3.1.2. Công nghệ sinh học trong chế biến tinh bột
Trong công nghiệp chế biến tinh bột chủ yếu là tạo ra các sản phẩm thuỷ
phân của tinh bột. Cho đến những năm 50 tinh bột chủ yếu được thuỷ phân bằng

axit. Ngày nay công nghệ này được thay thế hoàn toàn bằng enzyme như amylase,
glucoamylase của nấm mốc Aspegillus niger, các enzyme này có thể chòu được nhiệt
độ 1000C vì vậy rất thuận tiện cho công nghệ thuỷ phân tinh bột.
Ngày nay công nghệ chế biến tinh bột quan trọng nhất là sản xuất siro
fructose-glucose dùng trong công ngiệp nước giải khát, công nghiệp bánh kẹo. Công
nghệ này được thực hiện theo qui trình sau:
Hồ hoá, amylase
Tinh bột

Glucose isomerase
Glucose

siro glucose, fructose

Glucoamylase.
Sau khi thuỷ phân tinh bột thành đường glucose, một phần glucose sẽ được
đồng phân hoá thành fructose (ngọt hơn đường saccharose 1,5 lần) bằng enzyme
glucose isomerase, tạo thành một hỗn hợp siro với 51% glucose và 42% fructose.
Ngày nay công nghệ này có những bước cải tiến đáng kể đó là sử dụng enzyme
glucose isomerase cố đònh, theo số liệu gần đây cho thấy Công nghệ enzyme cố đònh
glucose isomerase có thể sử dụng liên tục trong 6 tháng, 1kg enzyme cố đònh có thể
sản xuất được 22000 kg sản phẩm. Công nghệ này hiện nay rất phát triển ở Mỹ và
hàng năm trên thế giới sản xuất trên 7 triệu tấn sản phẩm siro glucose-fructose.
3.1.3.Công nghệ sản xuất nước uống lên men
Trong công nghệ sản xuất nước uống lên men chủ yếu là sử dụng nguyên
liệu đường, và chủng vi sinh lên men là Saccharomyces cerevisiae để lên men
nguyên liệu đường thành ethanol. Quan trong nhất phải kể đến qui trình sản xuất
bia.

19

_______________________________________________________________
Nguyên liệu

Giai đoạn chuẩn bò

Sản xuất bia

Sản phẩm phụ

_______________________________________________________________
Lúa mạch

Mầm mạch

Nghiền

Phế thải làm thức ăn

GS
Nước
Đường mía
Hoa bia

Bể chứa

Bể trộn

Dòch đường

Sấy

Đun dòch đường

Thức ăn gia súc
Phân hữu cơ

Làm lạnh
Thùng giữ bia

Ủ bia

Bia tươi

Vô chai
3.1.4. Sản phẩm giàu protein
Sinh khối tế bào vi sinh vật hay protein đơn bào (SCP, single cell protein)
luôn có hàm lượng protein rất cao (40-50% chất khô), vi sinh vật lại sinh sản, tăng
sinh khối rất nhanh và dễ sản xuất với qui mô lớn, vì vậy ngày nay CNSH rất chú ý
đến lãnh vực này. Một ưu điểm nữa của công nghệ này là hầu hết các qui trình đều
sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến
giấy, dầu mỏ, vì vậy nó có lợi ích to lớn là vừa giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường và tạo được sản phẩm giàu protein .
Đáng chú ý nhất là các qui trình sản xuất SCP của hãng BP(Anh) sản xuất
protein nấm men từ dầu mỏ có tên thương mại là Toprina. Nhật cũng có qui trình
tương tự với công suất 200.000 tấn/năm. Liên xô (cũ) cũng đã từng sản xuất SCP với
sản lượng 1 triệu tấn /năm. Hiện nay công ty ICI(Anh) có dự án sản suất 700.000
tấn/năm lấy tên thương mại là Pruteen. Dự án này sử dụng vi khuẩn Methyllophilus
methylotrophus AS 1 có hiệu suất lên men rất cao nhờ được cải biến di truyền bằng
cách gắn một plasmid có mang gen mã hoá cho enzyme glutamate dehydrogenase.

Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm SCP hiện nay chỉ sử dụng cho chăn nuôi vì
mặc dù hàm lượng protein cao nhưng không hấp dẫn, và ngon miệng. Ngoài ra do
hàm lượng axit nucleic trong sản phẩm rất cao dễ gây ra bệnh thống phong (Goutte).
Ngoài SCP từ nấm men và vi khuẩn còn có một sản phẩm giàu protein khác,
có nhiều triển vọng là từ tảo. Trong đó đáng chú ý nhất là tảo Spirulina loài tảo này
cũng đã có mặt ở Việt nam khá lâu. Hiện có một pilot nuôi trồng công nghiệp ở
Bình thuận.
3.2. Công nghệ sinh học trong sản xuất hoá chất

20


CNSH ngày nay là cơ sở cho nhiều qui trình sản xuất các sản phẩm hoá học
như dung môi hữu cơ, axit hữu cơ, kháng sinh, axit amin, và trong công nghiệp khai
khoáng như khai thác đồng, vàng, …
3.2.1 Lên men sản xuất dung môi hữu cơ
Trước đây các dung môi hữu cơ như acetone, butanol, isopropanol được sản
xuất bằng cách chưng cất gỗ, ngày nay nó được thay thế bằng qui trình lên men yếm
khí nhờ vi khuẩn Clostridium acetobutylicum trên môi trường chứa tinh bột. Quá trình
diễn ra như sau:

Tinh bột

Glucose

Acetyl-CoA

Glucoso-6-P

Trioso-3-P

Acetone

Pyruvate
Isopropanol

Butyrate

n-Butanol.
.

Acetoacetyl-CoA

3.2.2. Sản xuất axit hữu cơ
Axit acetic là axit hữu cơ thông dụng nhất, riêng ở Mỹ hàng năm sản xuất và
tiêu thụ trên 1,5 triệu tấn, tương đương 500 triệu USD. Công nghệ trước đây là sản
xuất axit acetic bằng cách lên men rượu ethanol. Hiện nay ở các nước tiến công
nghệ này được thay thế hoàn toàn bằng công nghệ sử dụng vi khuẩn chòu nhiệt biến
đổi cellulose thành axit acetic. Gần đây nhất là việc sử dụng công nghệ sản xuất
acetic từ CO2 và H2 nhờ vi khuẩn Acetobacter và Clostridium.
Ngoài ra các axit khác như axit lactic, axit citric ngày nay sản xuất với qui mô
công nghiệp đều sử dụng lên men vi sinh vật. Ví dụ : axit lactic được lên men từ vi
khuẩn Lactobacillus bulgaricus . Ngày nay người ta đã sử dụng công nghệ cố đònh tế
bào vi khuẩn L. bulgaricus trong gel anginate để sản xuất liên tục. Thời gian bán
phân huỷ của chế phẩm này 100 ngày.
3.2.3. Sản xuất axit amin
Sản xuất axit amin bắt đầu sản xuất công nghiệp vào năm 1908 bằng cách
thuỷ phân gluten của bột mì (Nhật), công nghệ này duy trì tới 50 năm. Bắt đầu từ
năm 1957 cũng các nhà khoa học Nhật đã phát hiện khả năng tích luỹ axit amin rất
cao của vi sinh vật và thay thế công nghệ cũ bằng lên men vi sinh vật. Sản xuất axit
amin hàng năm trên thế giới thu được hàng tỷ USD (1,9 tỷ năm 1979).

Ngày nay axit amin chủ yếu được sản xuất bằng công nghệ lên men sử dụng
các chủng đột biến của Corynebacterium, Brevibacterium, E.coli, … Các chủng này
có thể thể sản xuất một lượng lớn axit amin (20-30g/lit) nhờ các đột biến này ít mẫn
cảm với cơ chế ức chế ngược (feedback). Một số công nghệ mới trong sản xuất axit
amin là sử dụng enzyme cố đònh. Gần đây kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã được ứng

21


dụng trong công nghệ sản xuất axit amin. Một số trường hợp thành công trong sản
xuất tryptophan và treonin đã tăng hiệu suất từ 20 lên 60 g/lit.
3.2.4. Sản xuất kháng sinh và thuốc steroid
Công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc kháng sinh hàng năm thu trên 10 tỷ
USD. Kháng sinh được tổng hợp chủ yếu nhờ nấm mốc và xạ khuẩn như sản xuất
kháng sinh penicillin từ nấm mốc Penicillum, kháng sinh streptomycine từ xạ khuẩn
Streptomyces.
Hiện nay công nghệ sản xuất kháng sinh chủ yếu sử dụng các chủng đột
biến. Ví dụ: chủng Penicillum notatum do Fleming phát hiện chỉ có khả năng tổng
hợp 3 mg/lit, sau nhiều quá trình chọn lọc đột biến đã tạo ra chủng cho hiệu suất
7000 mg/lit. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp kháng sinh cũng
được nghiên cứu kỹ lưỡng để có thể thu được hiệu suất cao nhất.
Có rất nhiều tiến bộ trong CNSH sản xuất thuốc kháng sinh như sử dụng
enzyme cố đònh để tổng hợp và cải biến thuốc, sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào để
tạo kháng sinh lai, có phổ tác dụng rộng và gần đây nhất là sử dụng kỹ thuật tái tổ
hợp DNA để tạo tổ hợp kháng sinh có phổ rộng và năng suất lên men cao.
Một ví dụ điển hình của CNSH trong sản xuất thuốc là con đường sinh tổng
hợp cortisone. Nếu tông hợp bằng con đường hoá học thì mất 27 phản ứng phức tạp
và giá thành là 200 USD/g. Các nhà khoa học đã tìm ra chủng nấm Rhizopus có thể
thực hiện được công việc này và giá thành hạ xuống chỉ còn 6USD/g.
3.2.5. Công nghệ sinh học trong khai khoáng

Lần đầu tiên vào năm 1947 người ta phân lập được vi khuẩn Thiobacillus
ferrooxidans từ nước thải hầm mỏ. Sau đó người ta lần lượt phát hiện được khá nhiều
vi khuẩn khác nhau tham gia vào quá trình tuyển quặng, trong đó quan trọng hơn cả
là Leptospirillum ferroxidans có khả năng oxy hoá quặng pyrite chứa nhiều FeS.
Chúng có khả năng sống trong những điều kiện rất khắc nghiệt như pH thấp, nồng
độ kim loại độc cao. Ví dụ điển hình là ở mỏ Bingham Canyen (Mỹ) có trữ lượng
cao 3,6.109 tấn, nhưng hàm lượng Cu thấp (< 0,4%) vì vậy rất tốn kém nếu sử dụng
công nghệ nhiệt luyện. Người ta tiến hành phun tẩm ùt quặng bằng nước (pH=1,53,0) tạo điều kiện cho vi khuẩn Thiobacillus ferrooxidans phát triển giúp hoà tan
quặng Cu2S thành CuSO4 với hàm lượng khoảng 0,75-2,2 g/l. Sau đó đồng được tủa
bằng cách thêm sắt:
CuSO4

+

Fe

Cu

+

FeSO4

Ngoài công nghệ khai thác đồng bằng vi sinh vật, ngày nay người ta còn ứng
dụng công nghệ này trong khai thác vàng, uranium.

22


23