Enzyme giới hạn và hệ thống hạn chế cải biên ,

Enzyme giới hạn và hệ thống hạn chế - cải biên (Restriction modification
system)
Vào năm 1962, lần đầu tiên Werner Arber đã chứng minh rằng: Có những
enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân
biệt DNA của mình và DNA lạ của phage. Các enzyme này hạn chế khả năng
sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách
đặc hiệu.
Vào năm 1970, Hamilton Smith phát hiện ở vi khuẩn Haemophilus
influenzae Rd enzyme giới hạn và đặt tên cho nó HindII.
Với những thí nghiệm tiếp theo, Arber và cộng sự tại trường Đại học Geneva
đã phát hiện ra nhiều chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ được DNA từ
loài khác xâm nhập vào chúng nhờ kết hợp của hai quá trình enzyme.
Hai quá trình enzyme được thống nhất trong một hệ thống gọi là hệ thống
hạn chế - cải biến, nhằm phân hủy DNA lạ và bảo vệ DNA của mình.
- Sự hạn chế được thực hiện nhờ sự hoạt động của các enzyme cắt hạn chế
(RE - Rectriction Enzyme). Đó chính là các endodesoxyribonuclease đặc biệt
có thể nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu trong chuỗi DNA sợi đôi và
cắt cả hai sợi DNA đó.
- Sự cải biến là sự thay đổi DNA của bản thân tế bào theo con đường đặc biệt
của mỗi loài, khiến DNA đó khác với DNA của loài khác và không phải là cơ
chất của enzyme cắt hạn chế. Nhờ đó mà DNA của tế bào chủ được bảo vệ.


Sự cải biên được thực hiện nhờ các enzyme metylase (mêtyl hoá) có trong tế
bào vi khuẩn. Enzyme này sẽ metyl hoá cytosine ở vị trí (C5) và adenine
(trên N của C6) thuộc vùng giới hạn (chuỗi đích).
Ví dụ: Ở Enzyme Hind III, sau khi được metyl hoá (dấu chấm) ở adeninee,
chuỗi đích này không được nhận biết bởi enzyme Hind III nữa, do đó, DNA
không bị cắt:

Vậy enzyme hạn chế và enzyme cải biên có cùng một đối tựơng nhận biết là

chuỗi nucleotide đặc hiệu trong DNA ngoại lai và DNA của tế bào chủ, nhằm
hạn chế sự sinh sản của DNA ngoại lai và bảo vệ DNA của mình. Tuy nhiên,
cũng có một số loại enzyme có cả hai chức năng hạn chế và cải biên.
Ví dụ: Enzyme EcoRI với chuỗi đích là:



Tính đặc hiệu vị trí của enzim cắt giới hạn - RE - Rectriction Enzyme
Rectriction Enzyme loại II bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết
chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại
vị trí nhận biết.
1- Trình tự nhận biết của RE:
Có thể nói các RE này là những công cụ thực thụ để cắt các DNA. Sự cắt này
xảy ra ở một vùng đặc biệt được nhận biết bởi enzyme. Mỗi một enzyme
nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi
là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi.
Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối
xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn
giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình
tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi bazơ. Ví dụ như
đoạn DNA được đóng khung sau:

2- Các kiểu cắt của RE:


Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa
palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả
năng tự kết hợp trở lại.
Ví dụ: HpaI

Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra
hai đầu lệch nhau một vài bazơ. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung
có thể bị bắt cặp trở lại. Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng có
chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính
bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo ra
những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một
phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền.


Ví dụ: EcoRI

3- Số lượng đoạn cắt:
Một RE có khả năng thao tác trên toàn bộ chiều dài của một phân tử DNA.
Số lượng đoạn cắt phụ thuộc vào số chuỗi đích của một RE có trên phân tử
DNA mà nó thao tác. Sử dụng RE khác nhau, sẽ bị cắt khác nhau và tạo ra
lượng đoạn cắt khác nhau.
Ví dụ: EcoRI


Nếu chuỗi này có 5 lần trong một phân tử DNA thì enzyme EcoRI sẽ cắt tại 5
điểm trên phân tử DNA đó:
- Ta sẽ được 5 đoạn nếu DNA dạng vòng
- Ta sẽ được 6 đoạn nếu DNA dạng thẳng
4- Kích thước đoạn cắt:
Vì vùng giới hạn được phân bố một cách ngẫu nhiên dọc theo một phân tử
DNA mà được tạo thành bằng cách tổ hợp 4 loại bazơ nitơ (A,T,C,G) nên
kích thước mỗi đoạn cắt phụ thuộc số cặp bazơ của mỗi chuỗi đích.
Nếu vùng nhận biết (chuỗi đích) của enzyme là 6 cặp bazơ sẽ sinh ra các
đoạn có kích thước trung bình 46 = 4.096 bazơ ≈ 4,1kb.
Nếu vùng nhận biết của enzyme là 4 cặp bazơ sẽ sinh ra các mảnh có kích

thước là 44 = 256 bazơ ≈ 0,26kb.
Tuy nhiên một số RE nhận biết các vùng rất hiếm gặp trong DNA. Ví dụ như
NotI có chuỗi đích (GC\GGCCGC), khi cắt cho các mảnh có kích thước
khoảng 1.000kb. PvuI có chuỗi đích (CGAT\CG) cho mảnh khoảng 300kb.