phân lập các dõng vi khuẩn sống nội sinh trong cây xuyên tâm liên (andrographis paniculata nees) mọc hoang ở tỉnh an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÕNG VI KHUẨN SỐNG NỘI SINH
TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN
(Andrographis paniculata Nees)
MỌC HOANG Ở TỈNH AN GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

NGUYỄN THỦY TIÊN
MSSV: 1097158
LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC K35

Cần Thơ, tháng 05/2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÕNG VI KHUẨN SỐNG NỘI SINH
TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN
(Andrographis paniculata Nees)
MỌC HOANG Ở TỈNH AN GIANG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

PGS. TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

NGUYỄN THỦY TIÊN
MSSV: 1097158
LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC K35

Cần Thơ, tháng 05/2015


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)

(ký tên)

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Nguyễn Thủy Tiên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2015

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp
đỡ nhiệt tình của các bạn.
Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn
đến:
Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường

Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện luận văn.
PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh
vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ
những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi
phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công.
Cần Thơ, ngày 10 tháng 05 năm 2015

Nguyễn Thủy Tiên


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đai Học Cần Thơ

TÓM TẮT
Từ xưa thuốc kháng sinh đã được sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây
bệnh ở người. Tuy nhiên, các chất kháng sinh tổng hợp được sử dụng thường gặp trở
ngại do tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Nhưng nhiều cây dược liệu lại không
gặp phải bất lợi này. Xuyên tâm liên là một cây có tính kháng khuẩn. Vì vậy, việc phân
lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Xuyên tâm liên được thực hiện nhằm tìm
được một số dòng vi khuẩn có tính kháng khuẩn góp phần thay thế kháng sinh tổng
hợp. Kết quả là có mười tám dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ các bộ phận
rễ, thân và lá của cây Xuyên tâm liên. Đa số các dòng vi khuẩn này có dạng hình que,

gram âm và có khả năng chuyển động. Chúng có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA
và có khả năng hòa tan lân khó tan. Dòng TR7 là dòng tổng hợp được lượng
ammonium cao nhất (1,37 μg/ml). Lượng IAA được tổng hợp nhiều nhất là 83,73
μg/ml do dòng TR1 tổng hợp. Có mười dòng có khả năng hòa tan lân, trong đó dòng
có hiệu quả tốt nhất là TT4 (47,62%), TR2 (60,19%) và TT2 (94,44%). Kết quả khảo
sát khả năng kháng khuẩn trên 3 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas
hydrophila và Staphylococcus aureus cho thấy có 6 dòng có khả năng kháng
Escherichia coli, 4 dòng có tính kháng Aeromonas hydrophila và 3 dòng có khả năng
kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus. Trong đó có 2 dòng có khả năng kháng được
cả hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila, 1 dòng có khả năng
kháng được cả hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Hai
dòng vi khuẩn TR1 và TL3 được nhận diện lần lượt là Enterobacter ludwigii dòng
CSR19B với tỷ lệ tương đồng 96% và Kosakonia radicincitans dòng DSM 16656 với
tỷ lệ tương đồng 95%.
Từ khóa: Enterobacter ludwigii, kháng khuẩn, Kosakonia radicincitans, vi khuẩn
nội sinh, Xuyên tâm liên.

Ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đai Học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................

TÓM TẮT ....................................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................... vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU........................................................................................... 1
1.1

Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1

1.2

Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1

Tổng quan về Tỉnh An Giang ......................................................................... 3

2.2

Giới thiệu về cây Xuyên Tâm Liên ................................................................. 4

2.3

Tác dụng của Xuyên tâm liên trong y học ..................................................... 5

2.4

Giới thiệu vi khuẩn nội sinh ............................................................................ 6

2.5

Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp ....................................................... 8

2.5.1

Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................... 8

2.5.2

Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................ 9

2.5.3

Vi khuẩn Enterobacter .............................................................................. 12

2.6

Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ......................................................... 13

2.6.1

Phân hủy sinh học ..................................................................................... 13

2.6.2

Khả năng cố định đạm............................................................................... 14

2.6.3

Khả năng hòa tan lân khó tan .................................................................... 14

2.6.4

Khả năng tổng hợp Auxin Indole-3-acetic acid (IAA) ............................. 15

2.6.5

Đối kháng sinh học.................................................................................... 16

2.6.6

Sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh .................................................................. 16

2.7

Một số vi khuẩn gây bệnh sử dụng trong nghiên cứu ................................ 16

2.7.1

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila .............................................................. 16

2.7.2

Vi khuẩn Escherichia coli ......................................................................... 18

Ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

2.7.3

Trường Đai Học Cần Thơ

Vi khuẩn Staphylococcus aureus .............................................................. 18

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21
3.1

Phƣơng tiện nghiên cứu................................................................................. 21

3.1.1

Thời gian – Địa điểm thực hiện ................................................................ 21

3.1.2

Dụng cụ - thiết bị....................................................................................... 21

3.1.3

Vật liệu ...................................................................................................... 21

3.1.4

Hóa chất..................................................................................................... 22

3.2

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 23

3.2.1

Phương pháp xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ............. 23

3.2.2

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. ................... 25

3.2.3

Đo kích thước tế bào vi khuẩn .................................................................. 26

3.2.4

Nhuộm Gram vi khuẩn .............................................................................. 27

3.2.5

Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. . 28

3.2.6

Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. .... 30

3.2.7

Đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan ..................................................... 31

3.2.8

Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập ...... 31

3.2.9

Nhận diện và định danh vài dòng vi khuẩn tiêu biểu ................................ 32

3.3

Xử lý thống kê ................................................................................................ 35

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 36
4.1

Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn ............. 36

4.1.1

Kết quả phân lập vi khuẩn ......................................................................... 36

4.1.2

Đặc điểm khuẩn lạc ................................................................................... 37

4.1.3

Đặc điểm tế bào vi khuẩn .......................................................................... 39

4.2

Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn

phân lập đƣợc .......................................................................................................... 41
4.3

Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các

dòng vi khuẩn đã đƣợc phân lập ............................................................................ 44
4.3.1

So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ

rễ (nhóm 1).............................................................................................................. 45
Ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

4.3.2

Trường Đai Học Cần Thơ

So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ

thân và lá (nhóm 2) ................................................................................................. 46
4.3.3
4.4

Nhận xét .................................................................................................... 47

Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã đƣợc

phân lập. ................................................................................................................... 48
4.4.1

So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ

(nhóm 1) .................................................................................................................. 50
4.4.2

So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ

thân và lá (nhóm 2) ................................................................................................. 51
4.4.3
4.5

Nhận xét .................................................................................................... 52

Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc ................ 53

4.5.1

Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli .............................................. 54

4.5.2

Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila .................................... 55

4.5.3

Khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................... 57

4.5.4

Nhận xét .................................................................................................... 58

4.6

Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR .................. 59

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 62
5.1

Kết luận ........................................................................................................... 62

5.2

Đề nghị ............................................................................................................ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 63
PHỤ LỤC .........................................................................................................................

Ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đai Học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Công thức môi trường PDA ............................................................................ 21
Bảng 2. Môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) .............................................................. 22
Bảng 3. Thành phần môi trường Nfb (Krieg el al., 1984) ............................................. 22
Bảng 4. Thành phần các chất trong phản ứng PCR ....................................................... 32
Bảng 5. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Xuyên tâm liên ......... 36
Bảng 6. Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA .................... 38
Bảng 7. Đặc tính vi khuẩn phân lập trên môt trường PDA ........................................... 39
Bảng 8. Hiệu quả hòa tan lân (%) của các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Xuyên tâm
liên khi được hủng trên môi trường NBRIP đặc ........................................................... 41
Bảng 9. Lượng IAA (μg/ml) của các dòng vi khuẩn ở rễ.............................................. 44
Bảng 10. Khả năng tạo ammonium (μg/ml) của các dòng vi khuẩn ở rễ ...................... 50
Bảng 11. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli ........................................ 54
Bảng 12. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn A. hydrophila ............................ 55
Bảng 13. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus .............. 56
Bảng 14. Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Xuyên
tâm liên .......................................................................................................................... 59
Bảng 15. Hiệu suất hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được tổng hợp ..............

Bảng 16. Đường chuẩn hàm lượng IAA ...........................................................................
Bảng 17. Hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được tổng hợp .....................
Bảng 18. Hàm lượng IAA (µg/ml) của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân và lá ............
Bảng 19. Đường chuẩn hàm lượng NH4+ ..........................................................................
Bảng 20. Hàm ượng ammonium (μg/ml) của các dòng vi khuẩn phân lập được tổng
hợp .....................................................................................................................................
Bảng 21. Khả năng tạo ammonium (μg/ml) của các dòng vi khuẩn phân lập được ở
thân và lá ............................................................................................................................
Bảng 22. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn E. coli ............................................
Bảng 23. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila ..................
Bảng 24. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................
Ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đai Học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Xuyên Tâm Liên (Adrographis paniculata Nees) ............................................. 4
Hình 2. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .................................................................. 9
Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis dòng 168 ...................................................................... 10

Hình 4. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................................................................... 20
Hình 5. Vòng pellicle tạo được sau 48h ủ của các bộ phận rễ, thân, lá ....................... 24
Hình 6. Dung dịch xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ .................................... 28

Hình 7. Dung dịch xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ....................................... 30
Hình 8. Vi khuẩn phát triển tạo thành vòng pellicle trong môi trường Nfb ................. 35
Hình 9. Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............. 37
Hình 10. Vi khuẩn Gram âm (TT4) và vi khuẩn Gram dương (TT2) .......................... 40
Hình 11. Vòng halo do các dòng vi khuẩn tạo ra khi chủng vào trong môi trường
NBRIP đặc .................................................................................................................... 41
Hình12 . Hàm lượng IAA (μg/ml) do các dòng vi khuẩn nội sinh tổng hợp được qua
các ngày 2, 4, 6 sau khi chủng ...................................................................................... 43
Hình 13. Lượng IAA do các dòng vi khuẩn ở thân và lá tạo ra ................................... 46
Hình 14. Hàm lượng ammonium (μg/ml) do các dòng vi khuẩn nội sinh tổng hợp được
qua các ngày 2, 4, 6 sau khi chủng ............................................................................... 49
Hình 15. Lượng ammonium (μg/ml) do các dòng vi khuẩn phân lập từ thân và lá tổng
hợp được ........................................................................................................................ 52
Hình 16. Các dòng vi khuẩn TR1, TL2 tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc sau khi ủ 1
ngày .............................................................................................................................. 55

Ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đai Học Cần Thơ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
16S-rRNA

16S ribosomal RNA

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Bp

Basepairs

DNA

Deoxyribonucleic Acid

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

EDTA

Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid

EtBr

Ethidium bromide

IAA

Indol -3- acetic acid

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato dextrose agar

PGPR

Plant Growth Promoting Rhizobacteria

STT

Số thứ tự

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris EDTA

VKNS

Vi khuẩn nội sinh

VSV

Vi sinh vật

Ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Cây xuyên tâm liên có tên dược là Herb Andrographitis và tên khoa học là
Andrographis paniculata thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) một thời gắn bó với tủ thuốc
gia đình, trạm y tế và cả một số bệnh viện ở nước ta. Nó được dùng thay thế kháng
sinh cho nhiều bệnh kèm theo sốt do cả vi khuẩn và virus. Xuyên tâm liên là vị thuốc
dành cho những người bị các bệnh kèm theo sốt, các bệnh của gan và mắt. Các thầy
thuốc Ấn Độ dùng nó trong đơn thuốc trị bệnh bạch biến, rối loạn tiêu hóa ở trẻ nhỏ,
dùng để kích thích tiêu hóa và trị các bệnh giun sán thông thường.
Trên các tạp chí y học quốc tế, một số nghiên cứu lâm sàng đã công bố về tác
dụng chữa bệnh của xuyên tâm liên: Bệnh cảm cúm thông thường, thử nghiệm có đối
chứng của Burgos và cộng tác viên (1999). Các tác giả kết luận, xuyên tâm liên là
thuốc trị cảm cúm có tác dụng tốt hơn hẳn các phương pháp điều trị được biết và

không có tác dụng phụ có hại nào cho người bệnh.
Các nghiên cứu của Thụy Điển cũng chứng minh tác dụng rất khả quan của
xuyên tâm liên đối với các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp do vi khuẩn và virus.
Hiện nay, việc sản xuất thuốc với thành phần chính là cây và lá xuyên tâm liên có
tác dụng kháng viêm, tiêu độc, thanh nhiệt, kháng virus, nâng cao sức đề kháng của cơ
thể đang được nhiều doanh nghiệp dược trong nước chú ý. Thuốc này chính là giải
pháp an toàn cho người mắc các bệnh cảm cúm, đau bụng, sốt, mụn nhọt, kiết lỵ, viêm
họng, cảm mạo. Điều đặc biệt là thuốc có nguồn gốc thảo dược nên rất an toàn, dùng
lâu ngày không bị tác dụng có hại nào như các thuốc kháng sinh Tây y.
Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất
(Wedelia chinensis), cây Diếp cá (Houttuynia cordata), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus
urinaria), cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata)… đã được nghiên cứu chứng
tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và
các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen
bao gồm các chất α-pinen, camphen,...Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus
pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006;
Shu-Chen và ctv, 2008).

Ngành Công nghệ sinh học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Các vi sinh vật sống nội sinh trong cây hoặc ở vùng rễ cây, có cả trong cây dược

liệu giúp kích thích cây trồng phát triển tốt bởi chúng có khả năng cố định nitơ, phân
giải lân, tổng hợp các hormone tăng trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức
chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến
dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây. Đặc biệt, một số chủng vi
sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi
chúng sống bên trong cây dược liệu. Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm
các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella…
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập được các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Xuyên tâm liên
(Andrographis paniculata) tại An Giang có các đặc tính tốt như khả năng kháng
khuẩn, tổng hợp NH4+, IAA và có khả năng hòa tan lân khó tan.

Ngành Công nghệ sinh học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về Tỉnh An Giang
(Nguồn: />w=introduction&provinceId=1159)

Vị trí địa lý
An Giang thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long với diện tích 3536.7 km², phía
đông và phía bắc giáp tỉnh Đồng Tháp gần 107,628 km² đứng thứ 4 trong khu

vực đồng bằng sông cửu long về diện tích sau tỉnh Kiên Giang, tỉnh Cà Mau và tỉnh
Long An, phía tây Bắc giáp Campuchia với đường biên giới dài gần 100 km, phía
nam và Tây Nam giáp tỉnh Kiên Giang đường biên giới khoảng 69,789 phía đông nam
giáp thành phố Cần Thơ chiều dài đường biên giới gần 44,734 km.
Điều kiện tự nhiên
a. Địa hình
An Giang có 2 dạng chính là đồng bằng và đồi núi. Đồng bằng ở có 2 loại chính
là đồng bằng phù sa và đồng bằng ven núi. Đồi núi kéo dài gần 100 km khởi đầu từ xã
Phú Hữu huyện An Phú, qua xã Vĩnh Tế thị xã Châu Đốc, bao trùm lên gần hết diện
tích 2 huyện Tịnh Biên và Tri Tôn, về tận xã Vọng Thê và Vọng Đông rồi dừng lại ở
thị trấn Núi Sập huyện Thoại Sơn. Đồi núi ở An Giang được phân chia thành 6 cụm và
2 núi độc lập: Cụm núi Sập; Cụm Ba Thê; Cụm núi Phú Cường; Cụm núi Cấm; Cụm
núi dài; Cụm núi Tô. Núi độc lập: Núi Nổi; Núi Sam.
b. Khí hậu
An Giang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, trong năm có 2 mùa rõ rệt
là mùa mưa và mùa khô. Nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 27oC, lượng mưa trung
bình năm khoảng 1130 mm. Độ ẩm trung bình 75 – 80%. Khí hậu cơ bản thuận lợi cho
phát triển nông nghiệp.
c. Tài nguyên thiên nhiên
An Giang có 37 loại đất khác nhau, hình thành 6 nhóm đất chính, trong đó chủ
yếu là nhóm đất phù sa trên 151.600 ha, chiếm 44,5%. phần lớn đất đai điều màu mỡ
vì 72% diện tích là đất phù sa hoặc có phù sa, địa hình bằng phẳng, thích nghi đối với
nhiều loại cây trồng.

Ngành Công nghệ sinh học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Toàn tỉnh có trên 583 ha rừng tự nhiên thuộc loại rừng ẩm nhiệt đới, đa số là cây
lá rộng, với 154 loài cây quý hiếm thuộc 54 họ, ngoài ra còn có 3.800 ha rừng tràm.
Tài nguyên khoáng sản khá phong phú, với trữ lượng khá đá granít trên 7 tỷ m3,
đá cát kết 400 triệu m3, cao lanh 2,5 triệu tấn, than bùn 16,4 triệu tấn, vỏ sò 30 – 40
triệu m3, và còn có các loại puzolan, fenspat, bentonite, cát sỏi,…
2.2 Giới thiệu về cây Xuyên Tâm Liên

Hình 1. Xuyên Tâm Liên
(Adrographis paniculata Nees)
(* Nguồn: www.lrc-hueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/X/XuyenTamLien.htm&key=&char=X
ngày 15/12/2014)

Xuyên Tâm Liên có tên khoa học là Adrographis paniculata (Burm.f.)
Nees, thuộc họ Ô rô (Acanthaceae). Còn có tên khác là Cồng cộng, Lãm hạch liên hay
Hùng bút. Xuyên tâm liên là cây thân thảo sống 1 – 2 năm, mọc thẳng đứng, cao
khoảng 40 - 100 cm, thân vuông, phân nhiều cành, các cành mọc theo 4 hướng. Lá đơn
mọc đối, có cuống ngắn, mép có răng cưa nhỏ. Hoa tự chùm thưa ở nách lá và đầu
cành. Hoa màu trắng điểm những đốm màu hồng tím. Quả nang, thon hẹp, có lông rất
nhỏ. Hạt đen hình cầu. Mùa hoa vào khoảng tháng 9 - 12, mùa quả vào tháng 1 - 2.
Xuyên tâm liên có nguồn gốc từ ấn Độ, sau đó được du nhập vào các nước khác
như Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Indonesia, Australia và
Ngành Công nghệ sinh học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Trung Quốc. Cây cũng được nhập sang tận vùng Trung Mỹ. Ở các nước châu á, Xuyên
tâm liên chủ yếu được trồng, đồng thời cũng thấy mọc hoang trong tự nhiên.
Xuyên tâm liên là cây ưa sáng, hoặc có thể bị che bóng một phần trong ngày.
Cây ưa mọc trên đất ẩm, khi mưa không bị đọng nước. Nhiệt độ thích hợp cho cây
sinh trưởng phát triển là 22 - 26o C, lượng mưa 1500 - 2500 mm/năm.
Trong cây và lá có các acid hữu cơ, tanin, chất nhựa, đường,... Trong lá có các
hoạt chất deoxyan-drographolide 0,1% hay hơn, andrographolide 1,5% hay hơn,
neoandrographolide 0,2%, homoandrographolide, panicolide. Còn có andrographan,
andrographon, andrographosterin. Rễ chứa mono-O-methylwithtin, andrographin,
panicolin,

apigenin-7,4'-dimethyl

ether.

Toàn

cây

chứa

14-deoxy-11-

oxoandrographolide, 14-deoxy -11,12-didehydroandrographolide,... và các panniculide
A, B, C.
2.3 Tác dụng của Xuyên tâm liên trong y học
Từ thời bao cấp, Xuyên tâm liên luôn có mặt trong các vườn thuốc Nam ở vùng
nông thôn, tại nhiều thành phố khác nhiều người còn trồng xuyên tâm liên ngay trong
chậu cảnh, để sử dụng chữa bệnh trong gia đình mình, vị thuốc chỉ cần sử dụng với
liều nhỏ nên mỗi nhà trồng một cây là đủ dùng.
Theo y học cổ truyền
- Xuyên tâm liên có vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu
thũng, giảm đau.
- Dùng điều trị lỵ cấp tính, viêm dạ dày, viêm ruột, cảm mạo, phát sốt, viêm
họng, viêm amidan, viêm phổi, rắn độc cắn.
Theo y học cổ truyền Trung Quốc
- Xuyên tâm liên được dùng điều trị cảm cúm, sốt, viêm họng, viêm thanh quản,
loét miệng, loét lưỡi, ho cấp và mãn tính, viêm ruột kết, tiêu chảy, lỵ, nhiễm khuẩn
đường tiết niệu, mụn nhọt, lở loét, rắn độc cắn.
- Ở một số nước khác, Xuyên tâm liên còn được dùng để chữa ho gà, ban lở
ngứa, rối loạn kinh nguyệt, tăng huyết áp, thấp khớp, lậu, bệnh gan, vô kinh, …
Theo y học hiện đại

Ngành Công nghệ sinh học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

- Dịch chiết Xuyên tâm liên, androgapholid có trong Xuyên tâm liên có tác dụng
ức chế phản ứng viêm trên thí nghiệm gây phù bàn chân chuột bằng kaolin…
- Tác dụng giảm đau với chuột gây đau bằng tiêm phúc mạc dung dịch acid
acetic 0,6%.
- Trên thử nghiệm lâm sàng thể hiện tác dụng điều cảm sốt, ho, viêm xoang và
tác dụng dự phòng cảm lạnh.
- Tác dụng giảm huyết áp đáng kể với dịch chiết ở phân đoạn butanol. Tác dụng
này phụ thuộc vào liều trên huyết áp tâm thu.
- Giảm đáng kể hẹp lỗ động mạch chậu do xơ vữa động mạch của thỏ có chế độ
ăn giàu cholesterol.
- Tác dụng ngăn cản kết tập tiểu cầu do kích thích sản sinh andenosin
monophosphat, ức chế sự tạo thành các yếu tố đông máu.
- Andrographolid có tác dụng bảo vệ gan và so sánh với silymarin cho thấy tác
dụng mạnh hơn.
- Tác dụng chống tiêu chảy do ức chế sự tiết dịch của niêm mạc đường tiêu hoá.
- Có hoạt tính ức chế trên một số chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus,
Mycobacterium tuberculosis… Xuyên tâm liên đã được thử nghiệm lâm sàng về điều
trị viêm phế quản cấp tính và mãn tính.
- Trong điều trị lao phổi đã so sánh tác dụng của viên Panilin (từ Xuyên tâm liên)
với pyrazinamid trong phác đồ điều trị lao, cho thấy có kết quả tương tự giữa hai phác
đồ này.
Một số bài thuốc sử dụng Xuyên tâm liên và cách dùng
- Chữa lỵ trực khuẩn cấp tính, viêm dạ dày, viêm ruột, cảm sốt, sưng tấy, rắn độc
cắn: Xuyên tâm liên, Kim ngân hoa, Sài đất; sắc uống.
- Chữa viêm phổi, sưng amidan: Xuyên tâm liên, Huyền sâm, Mạch môn; sắc
uống.
- Chữa viêm gan nhiễm khuẩn: Xuyên tâm liên, cỏ Nhọ nồi, Diệp hạ châu đắng;
sắc uống với thời gian điều trị từ 2 - 4 tuần.
- Chữa bỏng: Xuyên tâm liên nấu với nước, rửa hàng ngày.

2.4 Giới thiệu vi khuẩn nội sinh
Ngành Công nghệ sinh học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng
(Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo
3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots),
thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như
Azotobacter,

Bacillus,

Beijerinckia,

Derxia,

Enterobacteriaeae

(Klebsiella,

Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia,
Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich,

2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các
vị trí bị tổn thương của lá (Roos and Hattingh, 1983).
Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví
xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng
trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể vi
khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền
của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều
kiện môi trường (Pillay and Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái
lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích
thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn
nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et
al., 1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với cả sức ép vô sinh và hữu
sinh (Hallmann et al., 1997).
Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất
trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự
phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum
(Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân,
kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al. (2000) đã phát
hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng
Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn
với cây lúa hoang.
Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm
vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây.
Ngành Công nghệ sinh học

7

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

2.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣờng gặp
2.5.1

Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng
dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường
khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài
Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh
học.
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di
động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên
men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và
phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin,
cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất
dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas syringae ( Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie
et al., 1996). Khả năng phân giải phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng
hợp chất khác nhau. Phospho được tích luỹ trong rác khi động thực vật chết đi, những
hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất
phospho vô cơ khó tan. Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho
vô cơ. Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và
Pseudomonas. Các loài có khả năng phân giải mạnh là B. megatherium, B. mycoides
và Pseudomonas sp.

Trong số các loài Pseudomonas spp., P.fluorescens là được chú ý nghiên cứu
hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn
có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004).
Pseudomonas fluorescens:
Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc tùng mao,
sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy
làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao
đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước. Nhiệt độ
tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25 - 30oC.
Ngành Công nghệ sinh học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Hình 2. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
(*Nguồn: ngày 15/12/2014)

Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của
Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta
cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn
công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh
vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho
việc cạnh tranh Fe. Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi
sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen

cyanide.
Theo Sivamani et al., (1987) cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể
được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum
gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris.
2.5.2

Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh
nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí
hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong
thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể
phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,…
nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử
dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,… Một vài loài
Ngành Công nghệ sinh học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như

Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì
cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là
30 -450C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC .
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 -10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
10ellulose…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ
môi trường, …
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
a. Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu. Vi khuẩn
này nguyên tên là Vibrio subtilis (1835), đến năm 1872 được đổi tên thành Bacillus
subtilis. Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que, có nội bào
tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Vi khuẩn này thường được tìm
thấy ở tự nhiên trong đất và thực vật (Julia E.B et al., 2002). Bacillus sinh trưởng dưới
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào có thể đơn hoặc chuỗi và
chuyển động bằng tiêm mao. Bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm
giữa tế bào. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng
acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu,
2000). Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian
rất dài dưới các điều kiện khác nhau (Perez et al., 2000).

Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis dòng 168
Ngành Công nghệ sinh học

10

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

(*Nguồn: ngày 14/12/2014)

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như
subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin,
chlorotetain, mycobaccillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có
tính kháng khuẩn là các chất kháng sinh không được tổng hợp bằng ribosome (Leclère
V et al., 2005).
Bacillus subtilis thường được sử dụng để điều trị các bệnh tiêu chảy, viêm ruột,
viêm đại tràng…. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc bổ sung B. subtilis vào
chế độ ăn uống có thể có một số tác dụng có lợi về khả năng tiêu hóa (Aliakbarpour et
al., 2012; Kim et al., 2012; Sen et al., 2012; Zhang et al., 2012; Tsukahara et al.,
2013). Hơn nữa, B. subtilis LS 1-2 được báo cáo là có tác dụng sâu rộng về hình thái
đường ruột, mật số vi khuẩn và tình trạng miễn dịch của lợn cai sữa (Lee SH et al.,
2014). B. subtilis sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh bằng cách kích thích vi khuẩn có lợi, qua
đó cải thiện sức khỏe đường ruột, giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy gián tiếp và nâng cao
hiệu suất tăng trưởng (Hu Y et al., 2014).
b. Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích
thước 0,7 – 0,9 x 1,8 – 3m, nội bào tử ( 0,6 – 0,8 x 1 – 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí
hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt
độ giới hạn 15-50o C, nhiệt độ tối ưu 30 – 40oC.
Bacillus amyloliquefaciens là vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong công nghệ
sinh học. Một lượng lớn enzyme ngoại bào do chúng và các chủng Bacillus khác tiết
ra đã giúp ngành vi sinh công nghiệp sản xuất một loạt các enzyme cũng như các chất
hóa sinh tốt trong nhiều thập kỷ, ví dụ như enzyme amylase (Promita Deb et al.,
2013), protease (Đỗ Thị Bích Thủy, 2012).

c. Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,
Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí…
Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm
cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh.

Ngành Công nghệ sinh học

11

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)µm, có khi dài hơn,
chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5)µm
nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng
phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm.
Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar, C Valli Nachiyar (2011) trên cây bứa mủ
vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các
chủng vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi và Klebsiella pneumonia.
d. Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa là vi khuẩn gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc
lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus
polymyxa có kích thước (0,6 –1) x (2 –7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi
ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh.Bào tử hình bầu

dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 –2,6) µm, nằm giữa tế bào.
Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng
cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy
người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường
có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh
polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công
nghiệp dược.
2.5.3

Vi khuẩn Enterobacter

Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ – Proteobacteria , hầu hết là vi khuẩn
gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này
sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong cá mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi
khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật (Hwangbo et al., 2003) đã phân lập được loài
Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả
năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng
cách sản xuất hợp chất 2 – ketogluconic acid.
 Kosakonia radicincitans

Ngành Công nghệ sinh học

12

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Kosakonia radicincitans (trước đây gọi là Enterobacter radicincitans) thuộc họ
Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gram âm, di chuyển, có dạng hình cầu hoặc que ngắn
với chiều dài 0,8 – 1,2 µm, rộng 1,0 – 1,6 µm. Khuẩn lạc có màu be, đường kính 2 –
3mm, nhầy. Sinh trưởng tốt trên môi trường giàu dinh dưỡng như tryptone-soy agar,
R2A agar, nutrient agar và MacConkey Agar. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng
30oC, không phát triển dưới 10oC và trên 45oC (P. Kampfer et al., 2005).
Kosakonia radicincitans có khả năng tổng hợp đạm, auxinine và sản xuất
cytokinine, giúp cải thiện tốc độ tăng trưởng của thực vật và năng suất của các loại
cây trồng trong nông nghiệp, giúp cây chống lại một số tác nhân gây bệnh tiềm năng
khác (A. K. Brock et al., 2012).
 Enterobacter ludwigii
Enterobacter ludwigii (E. ludwigii) là vi khuẩn gram âm, hình que, di chuyển dễ
dàng, có những đặc tính chung của các chi Enterobacter. E. ludwigii có thể được phân
biệt với các loài Enterobacter khác bởi sự tăng trưởng của nó trên myo-inositol và 3-0methyl-D-glucopyranose (Harald Hoffman et al., 2005).
Theo Aarab et al., (2013) Enterobacter ludwigii phân lập từ nốt rễ của cây họ
đậu Lupinus hirsutus L. có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA trong môi trường có
hoặc không có bổ sung L-tryptophan và khả năng hòa tan lân khó tan, giúp thúc đẩy
tăng trưởng độ dài chồi và trọng lượng khô cho cây Lúa khi thử nghiệm. Ngoài ra, E.
ludwigii thúc đẩy tăng trưởng trọng lượng tươi và chiều dài rễ, chồi ở cây Lolium
perenne (Mauricio Shoebitz et al., 2009).
2.6 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
2.6.1

Phân hủy sinh học

Siciliano et al., (2001) ghi nhận cây trồng phát triển tốt trong đất nhiễm các hóa
chất độc hại có vi khuẩn nội sinh trong cây chứa những gen có khả năng phân hủy độc
chất này. Thực tế cho thấy nhiều cánh đồng nhiễm nitro-acromatics và những vi khuẩn

nội sinh trong cây trồng tại đây chứa những gen phân hủy nitro-acromatics, những vi
khuẩn nội sinh còn tồn tại trong đất vùng rễ của cây trồng hay có trong đất (Ryan et
al., 2008). Theo Van Aken et al., (2004) những dòng vi khuẩn cộng sinh thực vật như
Methylbacterium phân lập từ cây Polar lai (Populus deltoids x nigra), cũng có khả
năng phân hủy nitro-acromatics như 2,4,6-trinitro-toluene.
Ngành Công nghệ sinh học

13

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 - 2015

Trường Đại Học Cần Thơ

Sự phát hiện những vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy sinh học giúp cho
chúng ta có thể sử dụng trực tiếp như là các chế phẩm sinh học phân hủy độc chất hay
cắt chuyển gen có khả năng phân hủy độc chất vào những vi khuẩn khác và dùng
chúng để làm sạch môi trường…
2.6.2

Khả năng cố định đạm

Đạm là chất dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật.
Trong không khí có rất nhiều đạm (78%) nhưng cây trồng không hấp thu trực tiếp
được. Các vi sinh vật cố định đạm có khả năng hút đạm (N2) thành dạng đạm mà cây
trồng hấp thụ được nhờ sự xúc tác của enzyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase cấu
tạo bởi hai thành phần: protein sắt và protein sắt-molbden. Như vậy là cây trồng có thể
sử dụng nguồn đạm vô tận trong không khí nhờ sự giúp đỡ của các vi sinh vật cố định

đạm. Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của enzyme nitrogenase có thể được viết tóm
tắt như sau:
N2 + 6e- + 12 ATP + 12H2O  3NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+
Quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng nối tiếp nhau
N2 +2H+  [NH=NH] + 2H+  [NH2-NH2] + 2H+  2NH3
Ammonia được rạo ra trong chu trình tiếp tục đồng hóa tạo thành những acid
amin cung cấp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
2.6.3

Khả năng hòa tan lân khó tan

Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng. Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch
đất. Vì vậy, cây trồng chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong đất. Lân ở dạng khó
tan trong đất cây trồng không hút được. Có nhiều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen...
hàm lượng lân trong đất khá cao, nhưng cây không hút được vì lân ở dạng khó tan
(Cao Ngọc Điệp, 2011)
Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được
tích tụ là kết quả của việc bón phân lân thường xuyên. Tuy nhiên, một lượng lớn
phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh
chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây. Hiện tượng cố định và kết
tủa P trong đất thường phụ thuộc lớn vào pH và dạng đất. Trong đất acid, lân bị cố
định bởi oxide và hydroxide của nhôm và sắt, trong khi ở đất kiềm nó bị cố định bởi
Ngành Công nghệ sinh học

14

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học