Giáo trình HPLC (sắc ký lỏng ao áp)

Trờng đại học tổng hợp hà nội
-------------------------------------------------------------------------------------------

Khoa hoá học
--------------------------------------------Prof.Dr. Phạm Luận

Cơ sở lý thuyết

Săc ký lỏng hiệu năng cao
High Performance liquid Chromatography

( HPLC )

--------------------------- Hà nội 2000 ----------------------------


1

CHƯƠNG I

những khái niệm mở đầu về HPLC
1.1. Khái niệm về kỹ thuật sắc ký
Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích ( xác định ) các chất trong một
hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hoá học,vật lý và hoá lý của các chất
trong những điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là:
y Tính chất hấp phụ của chất rắn,
y Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion,
y Sự rây phân tử theo kích thớc của chúng,
y Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử,
y Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau,...
Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động

khi tiến hành tách sắc ký. Đó là
1. Kỹ thuật phân tích sắc ký khí ( GC ) và
2. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng ( LC ).
Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại đợc chia thành hai nhóm, đó là:
+ Sắc ký lỏng áp suất thờng LC ( sắc ký cổ điển ), và
+ Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: ( HPLC ).
Và hiện nay ( sau năm 1999 ) đã có sắc ký lỏng siêu áp, loại này làm việc
với áp suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar ).
Trong sắc ký cột ( có dạng rắn-lỏng hay lỏng-lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng
áp suất thờng đã ra đời và đợc ứng dụng từ lâu ( đã trên 60 năm ). Nhng
hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng nh dung
môi để chạy sắc ký. Ngợc lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển
khoảng trên chục năm lại đây, nhng hiện nay đang đợc phát triển rất nhanh
và đã đợc ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên
cứu khoa học, sản xuất công nghệ, môi trờng,... Vì kỹ thuật tách sắc ký
HPLC này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian cũng nh tốn
ít mẫu. Nói chung trong khoảng 15 năm qua, kỹ thuật phân tích HPLC đã
chiếm đến gần 70% tổng số các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký.
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm:
y Sắc ký lớp mỏng áp suất cao ( HPTLC ).
y Sắc ký cột lỏng áp suất cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao ( HPLC ).
Trong nhóm HPLC, tuỳ theo bản chất của các quá trình sắc ký của pha tĩnh
( SP ) xẩy ra trong cột tách mà ngời ta chia thành các loại sau:


2
1. Sắc ký phân bố ( PC ) của chất tan giữa hai pha không tan ( trộn) vào nhau.
2. Sắc ký hấp phụ pha thờng ( NP-HPLC ),
3. Sắc ký hấp phụ pha ngợc hay pha đảo ( RP- HPLC ),
4. Sắc ký trao đổi ion ( IEX-HPLC ) và cặp ion ( IP-HPLC ),

5. Sắc ký rây phân tử ( FG-HPLC ).
Trong năm loại này, loại thứ 5 là chỉ để tách các chất có phân tử lợng lớn
hơn 1000 đv. oxy ( cao phân tử ). Một cách tổng quát chúng ta có thể minh
hoạ khái quát sự phân chia này trong sơ đồ hình 1.1.

Hình 1.1 : Sự phân loại của HPLC
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu suất cao.
HPTLC: Sắc ký lớp mỏng ( phẳng ) hiệu suất cao.
PC- Phân bố, NP-Pha thờng, RP-Pha ngợc, IEX-Trao đổi ion, FG-Rây phân tử.

Sự phân chia trên đây là dựa theo tính chất của quá trình sắc ký, tất nhiên
đó cũng chỉ là tơng đối. Vì trong nhiều trờng hợp, quá trình tách sắc ký xẩy
ra trong cột sắc kí không phải chỉ theo một tính chất ( một cơ chế ) duy nhất,
mà đồng thời có thể có hai hay nhiều cơ chế khác nhau cùng diễn biến trong
cột tách. Ví dụ trong sắc ký cặp ion dùng chất hấp phụ pha ngợc Hypersil
ODS để tách các nguyên tố đất hiếm, với pha động là methanol và nớc, trong
môi trờng đệm axêtat (pH=4,6), và chất tạo phức -HIBA, thì sự tách xẩy ra
theo cả cơ chế trao đổi ion và cơ chế hấp phụ của pha ngợc.
Mặt khác, khi xem xét về trạng thái của pha tĩnh, ngời ta lại chia thành:
y Sắc ký lỏng- lỏng ( LLC ). Pha tĩnh và pha động đều là chất lỏng.
y Sắc ký lỏng- rắn (LSC ). Pha tĩnh là chất rắn, còn pha động là chất lỏng.
ở đây, trong hệ LLC, thì pha tĩnh là chất lỏng, nó đợc giữ ở trong cột tách
nh một lớp màng nhờ một chất mang trơ. Chất mang trơ này thờng là các
hạt silicagen trơ, ví dụ nh Kiselgure của hãng Merck. Còn trong hệ LSC, thì
pha tĩnh là một chất rắn, hạt xốp, và có cỡ hạt từ 5 đến 10 àm ( đờng kính ).


3
Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, các chất lỏng hay hỗn hợp các
chất lỏng dùng để rửa giải các chất phân tích trong quá trình sắc ký đợc gọi

là pha động ( MP ). Pha động có thể chỉ là một dung môi nớc hay dung môi
hữu cơ, nh metanol, acêtônitril, butanol; hay cũng có thể là hỗn hợp của hai
dung môi, nh metanol và nớc hay actonitril và nớc. Hoặc cũng có thể là
dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức,...
Song song với kỹ thuật HPLC, kỹ thuật sắc ký khí cũng đợc phát triển và
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Kỹ thuật sắc ký này đã đợc giới thiệu kỹ
trong giáo trình sắc ký khí của Dr. Nguyễn Xuân Dũng và Dr. Phạm Hùng
Việt và một số tác giả khác.

1.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC,
chúng ta phải có các hệ thống trang thiết bị về kỹ thuật này. Hệ thống trang
thiết bị của kỹ thuật HPLC, về cơ bản ( đơn giản và đủ để làm việc đợc theo
kỹ thuật HPLC ) bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:
1. Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký,
rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất ( 0
- 400 bar ) để tạo ra đợc những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách
phù hợp cho quá trình sắc ký, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 - 5 mL/phút.
2. Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lợng mẫu
nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các van 6 chiều có
chứa vòng mẫu có thể tích xác định ( ví dụ 20, 50 hay 100àL ). Van 6 chiều
chỉ có một vòng mẫu, nhng van 10 chiều thì có 3 vòng mẫu.
3. Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc ký, nó là
một yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột
tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký ( bảng 1.1 ). Nói
chung, các cột tách phân tích thờng có kích thớc chiều dài từ 10 - 25 cm;
đờng kính trong từ 2 - 5 mm.
4. Trang bị phát hiện chất phân tích. Đây thờng là các loại Detector dựa
theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ :
- Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV hay UV-VIS,

- Detector phổ phát xạ nguyên tử (AES, ICP-AES),
- Detector phổ hấp thụ nguyên tử (AAS),
- Detector phổ huỳnh quang phân tử,
- Detector điện hoá ( đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lợng ),
- Detector chiết suất,
- Detector đo độ dẫn nhiệt,
- Detecor diode phát quang và diode mảng,
- Detector phổ khối lợng ( khối phổ: MS, ICP-MS ), v.v.


4
Tất nhiên phải tuỳ theo mỗi loại chất phân tích mà chọn loại detector nào
cho phù hợp để đạt đợc độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng nh đo
định lợng chúng tốt nhất. Trong các loại trên, thì detector hấp phụ quang
phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang đợc dùng phổ biến nhất.
Vì nó thích hợp cho nhiều loại chất, và lại không quá đắt.
5. Trang bị chỉ thị kết quả: Trang bị chỉ thị kết quả có nhiều loại, nhng
đơn giản và phổ biến nhất là các máy tự ghi ( recorder ) để ghi tín hiệu đo
dới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế ( Intergrator ), sau đó
máy tính kèm theo để xử lý kết quả và may in để in các kết quả tách.
Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy
HPLC. Hình 1.2 là sơ đồ khối về hệ thống này. Tất nhiên những hệ thống máy
HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm:
+ Bộ chơng trình gradient dung môi ( pha động ),
+ Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu,
+ Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký,
+ Máy tính và các chơng trình ( phần mềm ) điều khiển, kiểm soát toàn bộ
hệ thống HPLC và xử lý kết quả tách, lập báo cáo và in các kết quả sắc kí.
Một cách tổng quát chúng ta có thể mô phỏng cấu hình nguyên tắc của
chúng theo các hình 1.2a, 1.2b và 1.2c.

1.3. Phân loại mức độ tách của kỹ thuật HPLC
Trong kỹ thuật tách HPLC, ngời ta cũng chia thành ba mức độ của quá
trình tách sắc ký, tuỳ thuộc vào mục đích và yêu cầu của ngời làm HPLC.
Ba mức độ đó là:
Mức độ tách phân tích ( Analytical Level ).
Mức độ bán điều chế ( Semi - Preparative ).
Mức độ tách điều chế, sản xuất ( Preparative ).
Bảng 1.1 là những tham số và các qui định về kích thớc chiều dài, đờng
kính cột tách, lợng mẫu nạp vào cột tách,.. cho mỗi mức độ sắc ký trong kỹ
thuật tách HPLC. Tất nhiên đây cũng chỉ là những khái niệm phân chia có
tính chất tơng đối.

1.4. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Để tiến hành tách sắc ký, pha tĩnh phải đợc nhồi vào cột tách theo một kỹ
thuật nhất định phù hợp. Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản
chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có
sắc ký hấp phụ pha thờng hay pha ngợc ( NP-HPLC hay RP-HPLC ). Nếu
pha tĩnh là chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( IE-HPLC ). Nếu pha


5
tÜnh lµ chÊt láng cã tÝnh ph©n bè th× ta cã s¾c ký chiÕt hay s¾c ký ph©n bè (
LLC ). NÕu pha tÜnh lµ chÊt r©y ph©n tö, ta cã s¾c ký r©y ph©n tö.

H×nh 1.2: S¬ ®å khèi c¸c kiÓu hÖ thèng HPLC


6

Bảng 1.1: Phân loại mức độ sắc ký trong HPLC

Các tham số

Mức độ
Phân tích

Mức độ
Bán điều chế

Mức độ
Điều chế

Đờng kính cột ( mm )
Độ dài cột L ( cm )
Cỡ hạt pha tĩnh ( àm )
Tốc độ MP ( mL/phút)
Thể tích mẫu nạp VS ( àL)
Lợng mẫu nạp Qi ( mg.)
Số đĩa của cột tách, N
Độ nhạy detector
Thời gian lu tRi ( phút )

2- 5
5 - 30
3 -10
0,5 3
10 50
0,5 <
> 3500

Cao
40 <

5 - 10
30 - 50
10 - 30
3 - 10
50 - 500
1 - 500
>3500
Trung bình
120 <

10 50
50 150
25 60
10 100
>1000
>500
>3500
Trung bình
250 <

Cùng với pha tĩnh, để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách chúng ta phải
cần một dung môi rửa giải. Đó là pha động ( mobile phase: MP ). Nh vậy,
nếu ta nạp mẫu phân tích gồm các chất A, B, C vào cột tách, thì khi bơm pha
động qua cột tách các quá trình sắc ký của các chất A, B và C sẽ xẩy ra.
Nghĩa là có sự tách của các chất A, B, C khỏi nhau, sau khi đi qua cột tách.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các mối tơng tác:
1. Giữa chất phân tích và pha tĩnh, với lực F(1),

2. Giữa chất phân tích và pha động, với lực F(2),
3. Giữa pha tĩnh và pha động, với lực F(3).
ChấtPT
(A-B-C)

F1
Phatĩnh
(SP)

F2

F3

Phađộng
(MP)

Hình 1.3: Sự tơng tác trong cột sắc ký

Tổng của ba lực tơng tác (hình 1.3) trong ba tơng tác này sẽ là yếu tố
quyết định chất nào đợc rửa giải ra khỏi cột tách sắc ký trớc tiên, nếu lực
tơng tác lu giữ Ftot của nó là nhỏ nhất. Còn chất nào có lực tơng tác lu
giữ lớn nhất thì sẽ đợc rửa giải ra khỏi cột tách sau cùng. Ta có thể minh hoạ


7
quá trình tách này của mẫu có hai chất A và B, theo sơ đồ nh trong hình 1.4
sau đây:
Theo sơ đồ trên hình 1.3 thì lực tơng tác lu giữ của mỗi chất phân tích sẽ
là:
Chất A: FA = FA(1) + FA (2) + FA(3)

Chất B: FB = FA(1) + FB (2) + FB (3)
Chất C: FC = FA(1) + FC (2) + FC (3)

Thời gian lu, ti (phút) t

Hình 1.4. Sơ đồ minh hoạ quá trình tách
A và B là hai chất phân tích. MP là pha động để rửa giải chất phân tích

ở đây đối với mỗi chất, sự lu giữ đợc xác định bởi ba lực thành phần là:
F(1), F(2) và F(3). Trong đó F(1) và F(2) là quyết định, còn F(3) là yếu tố ảnh
hởng. ở đây lực F(1) là giữ chất phân tích ở lại trên cột tách, tức là ở trên
pha tĩnh. Khi đó lực thành phần F(2) lại kéo chất phân tích ra khỏi cột tách.
Nh vậy với mỗi chất khác nhau thì thành phần F(1) và F(2) là khác nhau.


8
Còn thành phần F(3) trong một hệ sắc ký mà chúng ta giữ thành phần pha
động và
các điều kiện khác là không đổi, thì F(3) của các chất là hầu nh không khác
nhau. Vì thế F(1) và F(2) là hai yếu tố quyết định sự lu giữ của chất tan
trong một hệ pha. Nh thế có nghĩa là pha tĩnh và pha động là hai yếu tố
quyết định hiệu suất của quá trình sắc ký trong kỹ thuật HPLC. Sơ đồ trong
hình 1.4 là một ví dụ đơn giản để minh hoạ sự tách của hai chất A và B.
Theo thời gian, kể từ lúc bắt đầu nạp hỗn hợp mẫu (AB) vào cột tách sắc ký
cho đến lúc hai chất A và B đợc rửa giải ra khỏi cột.

Thời gian lu, ti (phút) t

Hình 1.5. Ví dụ tách HPLC của 5 chất:
Butylbenzen (1), Hexylbenzen(2), Pentylbenzen (3),

Octylbenzen và Nonylbenzen.


9
(a)- 5 chất cha tách đợc khỏi nhau, chất 4 và 5 còn chập nhau một phần.
(b)- 5 chất tách đợc khỏi nhau.

Hay nh ví dụ trong sắc đồ hình 1.5, chúng ta thấy hỗn hợp mẫu có 5 chất
đều đã đợc tách hoàn toàn và ứng với mỗi chất chúng ta có một pic sắc ký
riêng biệt nhất định. Điều đó có nghĩa là trong quá trình sắc ký, nếu các điều
kiện tách sắc ký là tốt và phù hợp, thì mẫu có bao nhiêu chất cần phân tích,
chúng ta phải có bấy nhiêu pic sắc ký tơng ứng. Hình 1.6 là một ví dụ khác
về quá trình sắc ký của một hỗn hợp mẫu, trong đó có những chất cha tách
ra khỏi nhau đợc ( chất 3 và 4 trong cột tách có pha tĩnh cỡ hạt 10 àm ).

Thời gian lu, ti

Hình 1.6. Quá trình tách HPLC của hỗn hợp có 6 chất

( Chỉ khác nhau cỡ hạt pha tĩnh : 5, 7 và 10 àm )


10

chơng II

cơ sở lý thuyết của kỹ thuật hplc
2.1. Khái quát quá trình sắc ký
Nói chung quá trình tách trong kỹ thuật HPLC cũng là những quá trình tổ
hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học, lại vừa có cả tính chất lý

học. Nó là những cân bằng động xẩy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và
pha động. Nó là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan ( hỗn
hợp mẫu phân tích ) theo từng lớp qua chất nhồi cột ( pha tĩnh ) từ đầu cột
tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn đợc phân bố lại
giữa hai pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ
nhất định, hay gradient. Tất nhiên khái niệm vận chuyển chất mẫu theo từng
lớp trong pha tĩnh chỉ là tơng đối trong một phạm vi nhất định nào đó của
quy luật phân bố. Vì thực tế khó có thể phân biệt đợc dứt khoát từng vùng,
từng lớp độc lập nhau trong hai pha trong quá trình sắc ký. Song chắc chắn
rằng, trong những điều kiện sắc ký nhất định, thì chất tan luôn luôn phân bố
trong hai pha theo những cân bằng động học, từ lúc chất tan bắt đầu đợc nạp
vào cột tách ( ở đầu cột ) cho đến khi nó đợc rửa giải ra khỏi cột tách. Cho
nên, ở đây những qui luật cân bằng động trong hoá học vẫn giúp ta đánh giá
đợc phần nào của mỗi chất tan sẽ đi vào pha tĩnh và phần nào đi vào pha
động, cũng nh sự tơng tác và phân bố của chúng ra sao. Đồng thời cũng do
có tính chất cân bằng động, mà luôn luôn có sự vận chuyển của chất tan từ
pha này sang pha kia và ngợc lại, không ngừng trong quá trình sắc ký. Nghĩa
là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn luôn nhảy
từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác,
cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên
tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau trong quá trình
di chuyển đó. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha
động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không chuyển dịch, mà bị pha tĩnh giữ lại.
Nh vậy là có một thời gian nhất định, chất tan bị giữ lại trong cột sắc ký.
Thời gian chất tan bị pha tĩnh lu giữ là đợc quyết định bởi bản chất sắc
ký của pha tĩnh, cũng nh cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan khác
nhau. Đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất và thành phần của pha
động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc kỹ ( pha tĩnh ). Vì thế trong
quá trình sắc ký có chất tan bị lu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lu giữ.
Điều đó dẫn đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xẩy ra trong cột sắc

ký, khi chất tan đi từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Nếu ghi lại quá trình tách
sắc ký đó của hỗn hợp chất mẫu phân tích, chúng ta sẽ có một sắc đồ gồm
nhiều pic. Các pic có thể tách nhau hoàn toàn, hoặc cũng có thể còn chập vào


11
nhau một phần, hay còn hoàn toàn chập vào nhau ( hình 2.1.b ). Sắc đồ đó
phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột có tốt hay không tốt. Nếu quá trình
tách sắc ký là tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất, trong sắc đồ sẽ
có bấy nhiêu pic riêng biệt không chập nhau. Nh vậy trong quá trình sắc
ký, chất nào bị lu giữ mạnh nhất sẽ đợc rửa giải ra sau cùng, chất nào bị lu
giữ kém nhất sẽ đợc rửa giải ra trớc tiên. Trong sắc đồ ở hình 2.1B ta thấy,
chất A bị lu giữ kém nhất và chất D bị lu giữ mạnh nhất. Đồng thời ở đây
hai chất C và D cha đợc tách ra khỏi nhau hoàn toàn, hai pic của chúng còn
đè lên nhau một phần.

2.2. Các đại lợng đặc trng của HPLC
2.2.1. Các phơng trình lu giữ
2.2.1.1. Thời gian lu giữ
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi đợc nạp vào cột sắc ký,
nh chúng ta đã biết, chúng sẽ bị lu giữ ở trong cột tách ( trên pha tĩnh ) theo
một thời gian nhất định, tRi. Đó là thời gian lu của nó trong hệ cột đã cho.
Thời gian lu này đợc tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc
chất tan đợc rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại (hình 2.1.a). Nh
vậy nếu gọi tRi là thời gian lu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:

tRi = ( to + tRi )

(2.1)

Trong đó:
+ to là thời gian không lu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động ) và
+ tRi là thời gian lu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký ( ở pha tĩnh ).
Nếu to = 0 chúng ta sẽ có tRi = tRi. Trờng hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ
( thờng là khi tRi nhỏ hơn 4 phút ). Còn nói chung, chúng ta luôn luôn có:

tRi = ( tRi - to )

(2.2)

Với hai chất tan A và B kế tiếp nhau trong sắc đồ thì chúng ta có:

= ( tB / tA )

(2.3)

và đợc gọi là thời gian lu tơng đối của hai chất A và B, hay hệ số tách
của hai chất đó. Đại lợng này càng lớn thì sự tách của 2 chất A và B
càng rõ ràng. Còn khi đại lợng này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký của
hai chất
A và B, và lúc này hai chất A và B nằm trong một píc sắc ký. Còn nếu gần
bằng 1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng. Nghĩa là chúng
chập nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trng cho hai chất đó.


12
Giá trị thời gian lu tRi của một chất tan trong quá trình sắc ký là phụ
thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ nh :
y Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thớc, độ xốp, cấu trúc xốp,
y Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động,

y Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế,
y Trong một số trờng hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ
chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hởng đến các cân bằng động trong
quá trình sắc ký. Trong sắc ký các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét.
(A)

(B)

Hình 2.1. Sơ đồ hệ thống HPLC
(A): Nguyên lý chung. (B): Giản đồ sắc ký 4 chất A, B, C và D. và ở đây:
- G : Manômeter đo áp suất pha động; - to : Thời gian không lu giữ.
- tA, tB, tC, tD : Thời gian lu giữ của các chất A, B, C, D;
- WA , WB : Chiều rộng đáy của pic sắc ký của chất A và B.


13
Giá trị thời gian lu tRi có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký.
Vì nó cho ta biết các chất tan ( chất phân tích ) trong hỗn hợp mẫu đợc rửa
giải ra nh thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn.
Đồng thời đó cũng là đại lợng để chúng ta phát hiện định tính các chất.
Mặt khác, trong một hệ sắc ký chúng ta còn có:

tRi = L / ui
to = L / uo
tRi = to ( 1 + ki )

(2.4)
(2.5)
(2.6)

Trong đó ui và uo là tốc độ tuyến tính của pha động ( cm/gy ). Còn ki là hệ
số dung tích của chất tan i; L là chiều dài của cột sắc ký.
ở đây, phơng trình (2.6) cho phép ta xác định đợc hệ số dung tích ki
của một chất tan i qua sắc đồ, nghĩa là biết to và tRi thì tính đợc ki. Ngợc
lại, nếu biết ki thì chúng ta cũng dự đoán đợc thời gian lu tRi của chất tan
i. Vì hằng số dung tích ki của nhiều chất đã đợc nghiên cứu và công bố
trong các tài liệu tham khảo ( Handbook ).
2.2.1.2. Thể tích lu của chất
Thể tích lu của một chất là thể tích của pha động chẩy qua cột sắc ký
trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu đợc bơm vào cột cho đến lúc chất tan
đợc rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại ( đỉnh pic ), nghĩa là tơng
ứng với thời gian lu tRi. Nếu chất tan không bị lu giữ trong cột tách, thì thể
tích lu của nó sẽ bằng thể tích VMP của pha động chẩy qua cột. Nh vậy nếu
gọi F (mL/ph) là tốc độ của pha động đợc bơm qua cột sắc ký, thì chúng ta
có:
+ Chất không lu giữ:

VRo =

VMP = tRo.F

(2.7)

+ Chất có lu giữ:

VRi

= VMP = F.tRi

(2.8)

hay

VRi

= VRo ( 1 + ki )

(2.9)

Nh vậy, từ phơng trình (2.7) ta tính đợc VRo, rồi từ phơng trình (2.8) ta
lại tính đợc VRi theo F và thời gian lu tRi thu đợc trên sắc đồ sắc ký ( VMP
thể tích pha động trong cột tách ).
Mặt khác chúng ta cũng còn có thể tích cột V0 :

Vo

= ( VSP + VMP )

(2.10)


14

Trong đó V0 là thể tích trống toàn phần của cột sắc ký, VSP là thể tích thực của
pha tĩnh trong cột. Nhng vì VMP = F.tRo , nên chúng ta có:

VSP = ( Vo - F.tRo )

(2.11)

Nh vậy, nhờ công thức (2.11) này chúng ta có thể tính đợc thể tích thực VSP
của pha tĩnh ở trong cột sắc ký.

2.2.2. Hệ số phân bố và hệ số dung tích
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh xẩy ra liên tục trong cột tách sắc ký. Sự phân bố
này đợc đặc trng bởi một đại lợng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ
số này đợc định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha
động và nó đợc tính theo công thức :

Ci(SP)
Ki

=

------------

(2.12)

Ci(MP)
Trong đó Ci(SP) và Ci(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và trong pha
động. Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i nh thế nào trong mỗi
pha ( pha động và pha tĩnh ).
Nhng hệ số Ki này cha nói lên đợc sức chứa (dung tích) của cột sắc ký.
Vì thế ngời ta phải đa thêm vào hệ số dung tích ki. Hệ số dung tích (hay hệ
số dung lợng: Capacity coefficient ) sẽ chỉ cho ta biết tỷ số khối lợng của
chất tan i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu; Nghĩa là ta có :

ki

=

m(SP) / m(MP)

(2.13)

Nếu gọi tỷ số q = Vs / Vm là tỷ số pha của hệ sắc ký HPLC, thì chúng ta sẽ
có mối quan hệ sau:

ki
vì :

= Ki. q

(2.14)

m(SP) = CS.VS, và m(MP) = Cm.Vm.

Đó là mối quan hệ giữa hệ số dung tích ki và hệ số phân bố Ki. Đồng thời
điều này cũng nói lên rằng, hệ số phân bố Ki là hệ số góc của phơng trình
(2.14), nó nêu lên mối liên hệ của ki với tỷ số pha q.


15
Mặt khác, từ các đại lợng VSP, VMP đã biết ở trên, chúng ta lại có :

ki
q . Ki

và

=

( tRi
=

-

( tRi

tRo ) / tRo

(2.15)

-

(2.16)

tRo ) / tRo

Đến đây, nhờ sắc đồ sắc ký và tỷ số pha q ta lại có thể dự tính đợc hệ số
phân bố Ki của chất tan i trong mỗi pha của điều kiện sắc ký đã chọn.
Nếu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì tơng tự nh trong khái
niệm lu giữ chúng ta cũng có hệ số tách của 2 chất A và B :

=

kB / kA

= ( tB - to ) / ( tA - to )

(2.17)

Nh vậy từ tỷ số của hệ số dung tích ( ) của hai chất cũng cho ta biết khả
năng tách của hai chất kề nhau trong một hệ sắc ký đã chọn. ở đây khi
khác 1 càng nhiều thì sự tách của hai chất càng rõ ràng.

2.2.3. Tốc độ tuyến tính của pha động
Trong kỹ thuật tách HPLC, tốc độ thể tích F (mL/phút) của pha động luôn
có liên quan đến tiết diện của cột tách. Vì thế ngời ta ít dùng khái niệm này,
khi xem xét sự di chuyển của một đĩa ( lớp ) chất tan trong cột tách, mà
thờng dùng tốc độ tuyến tính u (cm/gy). Khái niệm tốc độ này cho ta biết
trong một đơn vị thời gian (1 gy hay 1 ph. ), thì pha động, hay 1 đĩa sắc ký
của chất tan, dịch chuyển đợc bao nhiêu cm trong cột. Tốc độ này không
phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp
trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. Tốc độ này đợc tính
theo công thức:
u = L / to
(2.18)
hay ta có:

1
u

=

F . -------------------( r2 . E T . )

(2.19)

Trong đó L là chiều dài ( cm ), và r là bán kính của cột sắc ký (mm). ET là hệ
số về độ xốp của pha tĩnh. Trong thực tế của các loại pha tĩnh ( chất nhồi cột )
hiện nay đợc các hãng sản xuất cung cấp, nó chỉ thuộc một trong hai nhóm
giá trị sau đây: ET bằng 0,41 hay bằng 0,82.
Nh vậy, từ hai công thức trên, chúng ta có thể tính đợc giá trị của tốc độ
tuyến tính u trong điều kiện sắc ký đã chọn, hay giá trị ET vì :


16

ET

=

F / ( u . r2 . )

(2.20a)

ET = ( F . to ) / ( L . r2 . ) = F . ( to / Vo)

(2.20b)

ở đây V0 = ( L. r2. ). Và các giá trị t0, F, V0 chúng ta đã có từ các điều kiện,
dữ liệu thực nghiệm và sắc đồ của quá trình sắc ký.
Nhng trong thực tế, giá trị ET của pha tĩnh các hãng sản xuất chúng
thờng đã cho biết trong các catalog. Vì thế công thức (2.20b) cho phép
chúng ta xác định thời gian không lu giữ của chất tan trong hệ sắc ký đã
chọn đó.
H

Hình 2.2. Sự cân đối của pic HPLC

( Giá trị Asys = b/a )

2.2.4. Độ thấm dung môi của pha tĩnh
Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay không, tính động học thuận
nghịch của nó, sau khi nạp, ta phải kiểm tra lại cột theo ba yếu tố chính:
Số đĩa N của cột ( hay chiều cao H một đĩa ).
Độ cân đối của pic sắc ký.
Độ thấm dung môi ( pha động ) của hệ pha tĩnh.
Theo lý thuyết thống kê và để có độ phân giải tốt, độ bất đối xứng của pic
sắc ký ở hai bên phải nhỏ hơn 1,1. Hệ số bất đối xứng Asys này là tỷ số của độ
rộng pic sắc ký ở nửa sau và nửa trớc ở vị trí tơng ứng với chiều cao bằng
1/10 của chiều cao cực đại (Hmax). (xem hình 2.2 ). Nếu gọi độ rộng của nửa
trớc pic sắc ký là a và nửa sau là b tại vị trí đó ( 1/10Hmax) thì ta có:

Asys

=

( b/a )

Và tỷ số (b/a) phải nằm trong vùng: ( 1 0,1).
Khi píc sắc ký cân đối thì hệ số Asys = 1, tốt nhất.

(2.21)


17
Khác với độ cân đối của pic, độ thấm dung môi ( pha động ) của một hệ

pha lại cho chúng ta biết độ ổn định, tính cân bằng và tính lặp lại của hệ pha
đó trong quá trình sắc ký. Đồng thời cũng một phần nào mô tả sự diễn biến
của các cân bằng phân bố trong hệ pha tốt hay không tốt. Tất nhiên đó chỉ là
một tham số, mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh hởng đến vấn đề này.
Theo lý thuyết động học của quá trình sắc ký, chúng ta có :

to . dp2 . P

= ---------------------L2 .

(2.22)

Trong đó : - là độ nhớt của pha động ( cP )
- dp là đờng kính của hạt pha tĩnh ( àm )
- P là áp suất đặt vào cột sắc ký ( Psi )
- L là chiều dài cột sắc ký ( cm ).
Với cột tách sắc ký đợc nạp tốt, thì giá trị của đại lợng thờng nằm
trong khoảng từ 600 - 1100 và chính giá trị này nói lên độ trở kháng của
một hệ pha hay độ thấm dung môi của một pha động trong những điều kiện
sắc ký đã chọn đó. Khi giá trị mà nhỏ hơn 500 thì cột sắc ký này không thể
dùng để tách đợc. Vì khi độ thấm của pha tĩnh là quá nhỏ thì sự lập lại sẽ rất
kém và cân bằng phân bố của chất trong cột tách xẩy ra không tốt.

2.2.5. Số đĩa và chiều cao đĩa của cột sắc ký
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trng cho một cột tách sắc ký, ngời ta dùng
khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lợng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa
trong cột sắc ký nh là một lớp chất có chiều cao ( bề dầy ) là H. Tất nhiên
đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố,
nh :
- Đờng kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh,

- Điều kiện chế tạo, độ xốp, kích thớc lỗ xốp của hạt pha tĩnh,
- Bẳn chất, cấu trúc phân tử của chất tan ( chất phân tích ),
- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký,
- Độ nhớt của pha động,
Vì thế với một hệ pha nhất định, và trong những điều kiện sắc ký đã chọn,
thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan. Chiều cao
H này đợc xác định theo công thức :

H

L
= ---------- . ( Wi / tRi )2
16

(2.23)


18
Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa. Nh vậy với một cột sắc ký có
chiều dài là L thì số đĩa lý thuyết N của cột đó là :

N
N

Hay là

= L/H
= 16. ( tRi / wi )2

(2.24)

(2.25)

ở đây Wi là chiều rộng đáy pic sắc ký và tRi là thời gian lu của chất i (xem
hình 2.1). Nhng trong thực tế của quá trình sắc ký, thì số đĩa hiệu dụng Nef
và chiều cao hiệu dụng Hef của một cột sắc ký mới là đại lợng chúng ta cần
biết. Vì đại lợng này mới cho ta đánh giá đúng đợc khả năng của một cột
tách và hiệu quả của nó là nh thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trờng
hợp cụ thể. ở đây chúng ta có :

L

(Wi )2

Hef

= -------- . ----------------16
( tRi - to )2

và

Nef

=

16 . ( tRi - to )2 / (Wi )2

Hay là

Hef

=

H . ( 1 + ki )2 / ( ki )2

(2.28)

Nef

=

N . ( ki )2 / ( 1 + ki )2

(2.29)

(2.26)
(2.27)

Hai công thức này cho ta thấy, chiều cao hiệu lực Hef của một đĩa luôn luôn
lớn hơn chiều cao lý thuyết. Và cũng chính vì vậy mà số đĩa hiệu dụng Nef
của một cột cũng luôn luôn nhỏ hơn số đĩa lý thuyết N. Đồng thời cũng cho ta
biết các đại lợng Hef và Nef luôn luôn có quan hệ với hệ số dung tích ki của
chất tan ( chất phân tích ) trong quá trình sắc ký. Điều đó có nghĩa là trong
một hệ pha đã chọn và trong những điều kiện sắc ký nhất định, thì đối với mỗi
chất tan i, các đại lợng Hef và Nef đều là những hằng số đặc trng cho những
quá trình tách sắc ký đó của một hỗn hợp chát mẫu.
Nói chung, nếu giá trị Nef là quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất,
hoặc sự tách không hoàn toàn. Nhng nếu Nef là quá lớn thì cũng không cần
thiết. Vì khi đó pic sắc ký của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải tốn
nhiều pha động. Theo thực tế của kỹ thuật HPLC, ngời ta thấy rằng, trong
hầu hết các hỗn hợp mẫu, giá trị của đại lợng Nef của một cột tách nằm trong

vùng từ 5000 - 8000 là vừa đủ, cho những chất không quá phức tạp.

2.2.6. Khả năng phân giải, R
Hai đại lợng H và N đã nói ở trên là những hằng số đặc trng cho một loại
cột tách, nhng chúng cha chỉ rõ cho ta biết, hai chất tan A và B đợc tách ra
khỏi nhau đến mức nào, khi nó đợc rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế để


19
đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, ngời ta còn phải cần thêm
đại lợng độ phân giải R và nó đợc xác định theo công thức:

2 . ( tRA - tRB )
RAB

= ------------------------------

(2.30)

( WA + W B )
ở đây các giá trị tRA, tRB là thời gian lu thực của hai chất A và B; còn WA và
WB là chiều rộng đáy của pic sắc ký của hai chất A và B.
Tất nhiên điều kiện tối thiểu vừa đủ để hai chất A và B có thể tách ra khỏi
nhau, theo qui luật phân bố Gaoxơ và theo qui tắc Rayley, thì cực tiểu pic sắc
ký của chất A nằm gần nhất là ở vị trí cực đại của chất B (hình 2.3) và đủ để
tách hoàn toàn rõ ràng là cực tiểu phía sau pic của B kề với cực tiểu pic phía
trớc của A ; tức là R > ( WA + WB ).
Nh vậy nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này
giữa hai pic sẽ có một đoạn đờng nền nằm ngang theo trục hoành của biểu
đồ sắc ký (hình 2.3c). Song nếu đoạn đờng nền này dài quá thì cũng không

cần thiết. Vì nh thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất
hơn. Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt.
Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là đợc.
(a)

(b)

(c)

Hình 2.3. Giản đồ về sự tách của hai pic sắc ký A và B
a) Tối thiểu để có sự tách, b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau,
c) Hai chất tách xa hẳn nhau.

Ngợc lại, khi R lớn hơn quá nhiều tổng ( WA + WB ) là không cần thiết. Vì
lúc này ta phải rửa giải tốn nhiều pha động cho chất thứ hai. Trong thực tế nếu
gặp trờng hợp này chúng ta phải ứng dụng quá trình rửa giải gradient thành
phần pha động ( tuyến tính hay từng Step ) để cho chất thứ hai ra nhanh hơn (
xem mục 2.9).


20

Mặt khác, thời gian lu tơng đối của hai chất = ( tA / tB ), nên chúng ta
có thể viết :
1
(-1)
____
R = ------- x ------------- Nef
(2.31)

4

(-1)

1
Hay

R

ki

____

= ------ x -------------- x -------------- N
4

( 1 + ki )

(2.32)

Các công thức này cho phép ta xác định đợc hệ số phân giải R của hệ pha đã
chọn, theo các tham số ki, N và trong mỗi trờng hợp cụ thể của sự tách.
Bảng ( 2.1 ) sau đây là một ví dụ cho chúng ta biết về mối quan hệ giữa các
đại lợng R, Nef và .
Bảng 2.1. Mối quan hệ của R, Nef và
Giá trị

Số đĩa Nef tối thiểu phải có ứng với R:

R = 1,00
7.000
3.500
2.700
1950
1050

1,05
1,10
1,15
1,25
1,50

R=1,50
16.000
11.500
7.300
5.500
3.000

Mặt khác, cũng từ hai công thức trên, chúng ta cũng có thể xác định đợc
chiều dài L cần thiết của một cột sắc ký, để có đợc độ phân giải R mong
muốn theo pha tĩnh đã biết đờng kính hạt dp. Nghĩa là:



Hay

N

=

N

= L/H

16.R . ----------- . ----------------(-1)
ki
hay


L =

( ki + 1 )

2

2

(2.33a)

L = N.H
( ki + 1 )

[ 16.R . ----------- . ----------------- ].H
( -1)
ki

(2.33b)

21

2.2.7. Mối quan hệ giữa H và u
Từ lý thuyết đĩa, chúng ta có thể tính đợc các đại lợng N, H của một hệ
cột sắc ký. Nhng cha biết đợc mối quan hệ của nó với các điều kiện sắc
ký, ví dụ nh khi nào và làm sao để xác định đợc tốc độ tối u của pha động
chẩy qua cột. Vấn đề này chỉ đợc giải quyết khi chúng ta ứng dụng lý thuyết
tốc độ cho hệ cột. ở đây phơng trình Wan Deemter chỉ cho ta mối quan hệ
giữa các đại lợng H và tốc độ rửa giải u. Đó chính là mối quan hệ giữa 2 đại
lợng H và u.
Nói chung chiều cao H của một đĩa là phụ thuộc rất rõ rệt vào tốc độ của
pha động chẩy qua cột sắc ký trong quá trình rửa giải các chất tan. Quan hệ
này, trong một mức độ nhất định, nó đợc mô tả bởi phơng trình Wan
Deemter sau đây :

H
hay:

=

A

+

B/u

+

H = ( H1 + H2 +

u.Cm
H3

+
+

u.Cs

(2.34)

H4 )

Nh vậy phơng trình thực nghiệm này gồm có 4 thành phần đóng góp vào
chiều cao H toàn phần của một đĩa, ở đây:
Thành phần H1 chỉ ra quan hệ chiều cao của một đĩa phụ thuộc vào đờng
kính hạt pha tĩnh trong cột tách và nó đợc xác định theo công thức:
H1 = 2..dp

(a)

Hệ số đợc gọi là hệ số nạp cột, theo các kết quả thực nghiệm, nếu cột đợc
nạp tốt thì hệ số luôn luôn bằng 1,50. Nh vậy ta thấy H1 là phụ thuộc
tuyến tính vào kích thớc hạt dp ( đờng kính ) của pha tĩnh.
Thành phần thứ hai H2. H2 = B/u. Trong quá trình sắc ký, nếu tốc độ pha
động là F 0,5 mL/ph, thì chúng ta có:
B = 2..Dm

(b)

Thành phần này chỉ ra cho ta ảnh hởng của hệ số khuếch tán Dm của chất
tan ở trong pha động theo hớng chiều dài của cột. Còn là một hằng số đặc
trng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian, và trong điều kiện cột nạp
tốt thì giá trị hầu nh bằng 1. Nh vậy thành phần H2 sẽ là :
H2 = ( 2..Dm ) / u

(c)


22
Thành phần H3. Ngoài hai yếu tố trên, trong quá trình sắc ký còn có quá
trình khuếch tán của chất tan ( sự di chuyển ) từ pha tĩnh ra pha động và
ngợc lại. Vì thế xuất hiện thành phần thứ ba H3 bổ sung thêm vào chiều cao
của đĩa. Đó chính là hệ số Cm. Trong những điều kiện thực nghiệm nhất định,
hệ số này là một hằng số, nó phụ thuộc chủ yếu vào kích thớc hạt pha tĩnh
và hệ số khuếch tán Dm theo phơng trình:
Cm = .(dp)2/ Dm

(d)

ở đây là một hệ số thực nghiệm, nó đợc quyết định bởi hệ số dung tích ki
của chất tan, và trong giá trị của nó nằm trong vùng từ 0,047 - 1,00, và trong
hầu hết các trờng hợp thờng bằng 0,70.
Thành phần H4. Bên cạnh ba thành phần chính đã nêu, thành phần thứ t,
H4 cũng đóng góp thêm một ít vào chiều cao của đĩa, nhng thành phần này
là rất nhỏ, và hệ số Cs chính là đặc trng của thành phần này. Nó mô tả sự
chuyển động khối của chất tan ở trong pha tĩnh. Nên trong hầu hết các trờng
hợp, khi mà F 1 mL/ph, thì thành phần H4 này hầu nh gần bằng 0 ( nhỏ
hơn 0,2% H tổng), nghĩa là quá nhỏ so với ba thành phần trên. Do đó trong

thực tế chúng ta có thể bỏ qua. Chỉ trong những trờng hợp tốc độ pha động F
nhỏ hơn 0,5 mL/ph, thì mới phải chú ý đến giá trị đóng góp của H4 vào chiều
cao chung của đĩa. Lúc này chúng ta có :
Cs = k.2/Ds

(e)

Trong đó : là tỷ khối của pha tĩnh; Ds là hệ số khuếch tán của chất tan
trong pha tĩnh; Còn k là một hằng số phụ thuộc vào điều kiện nạp cột, và
thờng nhỏ hơn 2.
Nh vậy, từ các nghiên cứu về các yếu tố thành phần đóng góp vào chiều
cao H chung của một đĩa, chúng ta có thể viết :

2..Dm

2

(dp)2

H = 2..dp + ------------ + ------- u + k. ------ u
u
Dm
Ds

(2.35)

Nhng nếu bỏ thành phần thứ t, thì chúng ta còn:

2..Dm
H

=

2..dp + ------------- +
u

(dp)2
--------- u
Dm

(2.36)


23
Phơng trình (2.36) này cho ta biết mối quan hệ giữa chiều cao H của một đĩa
và tốc độ tuyến tính của pha động u. Nếu biểu thị các đờng biểu diễn tổng
cộng trong quan hệ của H với u thì chúng ta có đợc các đờng nh trong
hình 2.4. Đó là đờng cong Van Deemter.
Từ đờng biểu diễn mối quan hệ H - u trong đồ thị này chúng ta thấy, với
tốc độ tuyến tính u biến thiên:
y Từ 0 đến uo, thì khi u tăng, sẽ đa đến làm giảm H đến giá trị cực tiểu H0.
y Còn khi u > uo, thì khi u tăng, sẽ đa đến kết quả làm tăng giá trị của H.
Nghĩa là sau uo thì H luôn luôn lớn hơn Ho.
Do đó, giá trị u0 này đợc gọi là tốc độ tối u của pha động trong điều kiện
sắc ký đã chọn, và tơng ứng với u0 ta có giá trị H0. Trong điều kiện này ta có
số đĩa N của cột sắc ký lớn nhất. Nghĩa là hiệu suất tách của cột tách là cao
nhất ứng với các điều kiện sắc ký đã chọn.
Đến đây, theo phơng trình (2.36), chúng ta thấy, chiều cao của đĩa trong
cột tách phụ thuộc rất phức tạp vào tốc độ tuyến tính u của pha động, vừa tỷ
lệ nghịch ( thành phần thứ hai ) lại vừa tỷ lệ thuận ( thành phần thứ ba ). Đối

với kích thớc hạt pha tĩnh, vừa bậc nhất ( thành phần thứ nhất ) và bậc hai (
thành phần thứ ba ). Đồng thời cũng liên quan chặt chẽ với hệ số khuếch tán
Dm của chất tan trong pha động.
Mặt khác, cũng theo phơng trình trên, số mũ cao nhất của kích thớc hạt
pha tĩnh dp bằng 2. Nhng theo thực nghiệm với các cỡ hạt SP có dp nhỏ hơn
10 àm, thì số mũ đó chỉ đến cao nhất bằng 1,82. Nói chung với cỡ hạt trong
vùng từ 3 - 7 àm thì nó sẽ là từ 1,64 - 1,85. Còn với cỡ hạt đờng kính lớn
hơn ( 12 - 15 àm) thì số mũ đó là xấp xỉ bằng 2,1. Do đó chúng ta có thể viết
phơng trình Van Deemter nh sau:

H = 3.dp + (2.Dm) /u

+ ( 0,047.u.)/ Dm

(2.37)

Nhng trong điều kiện của tốc độ tuyến tính u0 tối u, nghĩa là:
____________

2.(Dm )2

uo = ---------------.(dp)2

= ( 6,25. Dm)/dp

(2.37b)

chúng ta có có thể viết chiều cao H tổng gần đúng nh sau đối với các chất
nhồi có đờng kính cỡ hạt từ 5 - 7 micromét. Điều này giúp chúng ta có thể
tính nhanh đợc số đĩa của một cột tách.

H = ( 3dp + 0,34dp + 0,3dp ) =

3,7dp

(2.38)


24
Nh vậy, nếu đờng kính hạt chất nhồi ( pha tĩnh ) là nhỏ hơn 10 àm , thì
công thức (2.28) này giúp chúng ta tính nhanh đợc chiều cao H của một đĩa
và số đĩa lý thuyết của một cột sắc ký theo đờng kính hạt của pha tĩnh dp đã
biết. Tất nhiên đó là tính gần đúng, để giúp chúng ta dự đoán về khả năng
tách của một loại cột sắc ký đã chọn.
Đến nay, nhiều kết quả thực nghiệm cho thấy rằng, nếu đờng kính hạt
chất nhồi ( pha tĩnh ) nhỏ hơn 7 àm thì chiều cao đĩa lý thuyết H chỉ nằm
trong khoảng từ 2,8 đến 3,5 dp của hạt pha tĩnh. Chính vì thế mà hiện nay
ngời ta chỉ chế tạo các hạt pha tĩnh có đờng kính nhỏ, từ 3 đến 7 àm.

Hình 2.4. Đờng cong Van Deemter ( H - u )
H: Chiều cao ( bề dầy) của đĩa, u: tố độ tuyến tính của pha động

2.2.8. Độ phát hiện chất
Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào
nhiều yếu tố khác nhau của quá trình sắc ký, cụ thể nh :
+ Thể tích, hay lợng mẫu đợc nạp vào cột tách,
+ Tính chất và các thông số đặc trng của pha tĩnh,
+ Tính chất và thành phần của pha động, ( có khi cả giá trị pH ),
+ Tốc độ của pha động và kỹ thuật rửa giải,
+ Độ nhạy phát hiện của detector và các đặc trng của nó,

+ Hệ thống đờng ống dẫn ( từ van mẫu đến flowcell của detector ),