Tài liệu SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM "XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP" pptx

XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ BỨA BẰNG
SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP
DETERMINATION OF ORGANIC ACIDS FROM LEAVES, RIND FRUITS
OF GARCINIA OBLONGIFOLIA CHAMP. EX BENTH. BY HIGH-
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
ĐÀO HÙNG CƯỜNG
Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng
ĐẶNG QUANG VINH
HV Cao học khoá 2004-2007
TÓM TẮT
Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Lá
tươi và vỏ quả bứa khô được chiết với nước ở nhiệt độ 127
0
C thời gian 30-60 phút dưới áp
suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol)
trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 75
0
C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc kí
lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng
đetectơ 210 nm. Axit hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả bứa khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy
xitric hàm lượng lần lượt là 2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả bứa là lượng
nhỏ axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ từ bứa (Garcinia
oblongifolia Champ. ex Benth.).
ABSTRACT
Organic acids in fresh leaves and dried rinds fruits of Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth
were determined by high-performance liquid chromatography. Fresh leaves and dried rinds
fruits were extracted with water at 127 °C for 30-60 min under 0,15 MPa pressure. Also, dried
rinds were extracted with solvents (acetone and methanol) using a Soxhlet extractor at 75 °C
for 8 h each. The samples were injected to HPLC under gradient elution with 0.01 M
phosphoric acid and methanol with a flow rate of 0.7 mL/min using UV detection at 210 nm.
The major organic acid was found to be (-)-hydroxycitric acid present in leaves and rinds fruits

to the extent of 2.863 and 15.221%, respectively. Citric acids is present in leaves and rinds
fruits in minor quantities. This is the first report on the composition of organic acids from
Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.
1. Mở đầu
Trong một vài năm gần đây, các cấu tử có khối lượng nhỏ và phức tạp được chiết từ
nhiều loài bứa (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia antroViridis)
trong đó có axit (-)-hyđroxy xitric (HCA; 1,2-di hydroxy propan-1,2,3 tri cacboxylic axit; hình
1), lacton của (-) axit hydroxy citric (hình 1)) có tính sinh học lý thú đã gây chú ý đối với các
nhà hoá sinh các bác sỹ chuyên khoa sức khoẻ. Đó là khả năng điều chỉnh quá trình tổng hợp
axit béo, sự hình thành lipit, sự ngon miệng, và giảm cân. Đồng phân của (-)-HCA đã góp
phần lớn trong lĩnh vực dược học như tác nhân có vai trò quan trọng trong mục đích giảm cân,
bảo vệ tim mạch, hiệu chỉnh trạng thái bất bình thường của các lipid, và khả năng chịu đựng
trong luyện tập thể thao [3] [4] [5] [6]. Vỏ quả bứa có
tính săn da và hơi đắng, mát, hơi độc, có tác dụng tiêu
viêm, hạ nhiệt, làm săn da, hàn vết thương; trị: Loét dạ
dày, loét tá tràng; Viêm dạ dày ruột, kém tiêu hoá; Viêm
miệng, bệnh cặn răng; Ho ra máu. Dùng ngoài trị bỏng,
mụn nhọt, sâu quảng, eczema, dị ứng mẩn ngứa, rút các
vết đạn đâm vào thịt; Lá bứa có vị chua thường được
dùng thái nhỏ nấu canh chua; Hạt có áo hạt chua, ăn
được, cũng dùng nấu canh chua. Nhựa bứa dùng trị
bỏng [1]. Các nghiên cứu chiết tách nguồn HCA chỉ
thực hiện trên các loài bứa của Ấn Độ. Vì vậy, sự khám
COOHC
H
HO
COOH
HO
C
COOHCH

H
COOHC
H
COOH
HO
C
CH
H
C=O
O
H×nh 1: CÊu tróc cña (-) axit hydroxy citric
vµ lacton cña (-) axit hydroxy citric
lặp lại
01 lần
10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước
Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút
Lọc bằng vải muslin
Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than
hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30'
Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính
được rửa 02 lần với 15 mL nước và
lọc lại nước rửa
Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến
20mL, xử lý với 100mL etanol để
15 phút để kết tủa hết pectin.
Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi
và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02
lần với 20mL etanol và ly tâm để
thu hồi hết axit.
Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể

tích 50 mL và lưu giữ ở 4
0
C đến khi
sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR).
25 g mẫu+axeton hoặc etanol (150 mL)
Chiết Soxhlet ở 75
0
C trong 8 giờ
Lọc bằng giấy lọc và cô đặc
Etanol và axeton chiêt hòa tan trong
20mL nước + 4g than hoạt tính
Ngâm trong nước ấm 30 phút và lọc
bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa
02 lần với 10 mL nước.
Dịch chiết góp chung thành 50 mL
(chuẩn độ, chạy HPLC, IR)
lặp lại
01 lần
10 g mẫu + 150 mL nước
Nồi áp suất 0,15 MPa, 60 phút
Lọc bằng vải muslin
Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than
hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30'
Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính
được rửa 02 lần với 15 mL nước và
lọc lại nước rửa
Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến
50mL, xử lý với 100mL etanol để
15 phút để kết tủa hết pectin.
Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi

và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02
lần với 20mL etanol và ly tâm để
thu hồi hết axit.
Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể
tích 50 mL và lưu giữ ở 4
0
C đến khi
sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR).
phá axit hữu cơ trong cây bứa tại Việt Nam là hết sức cần thiết, cây bứa có tên khoa học là
Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth., thuộc họ Bứa (họ măng cụt) - Clusiaceae.
Bài báo này trình bày phương pháp chiết tách, xác định thành phần axit hữu cơ chính
có trong lá, vỏ quả bứa và các thông số vật lý khác.
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Lá, vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện
Hòa Vang, TP. Đà Nẵng và từ thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ quả bứa được chuẩn bị theo sơ đồ ở phần 2.2.1.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực hiện chiết
tách axit theo sơ đồ sau.
Quả bứa: loại bỏ quả hư, dập, quả chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả,
cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm và sấy khô ở nhiệt độ 80
0
C, xoay nhỏ làm nguyên liệu để
chiết tách axit theo 02 phương pháp ở sơ đồ sau.
Lá: Vỏ quả khô:
Phương pháp 1: Phương pháp 2:
2.2.2. Phương pháp chiết tách
Chưng ninh trong nồi áp suất: Lá, vỏ quả bứa tươi hoặc khô được cắt nhỏ rồi cho

vào cốc thuỷ tinh 500 ml, chưng ninh trong nồi áp suất ở áp suất 0,15 MPa, nhiệt độ 127
o
C
trong thời gian 30-60 phút và lặp lại 02 lần để chiết tách hết lượng axit hữu cơ có trong mẫu
với dung môi là nước.
Chiết soxhlet: Vỏ quả bứa khô xoay nhỏ cho vào bộ chiết soxhlet tiến hành chiết ở
nhiệt độ 75
o
C, trong vòng 8 giờ với dung môi là axeton hoặc methanol.
2.2.3. Phương pháp trọng lượng
Cân khoảng 10g lá, vỏ quả Bứa tươi cho vào cốc thuỷ tinh đã được sấy khô và biết
khối lượng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa lá, vỏ quả Bứa vào tủ sấy và sấy ở 80
o
C.
Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh
nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lượng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta
lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là không
đổi hay có sai số khoảng 0.005g thì dừng quá trình sấy.
Dựa vào các kết quả thu được, ta tính được khối lượng lá, vỏ quả Bứa trước và sau khi
sấy. Từ đó, ta tính được độ ẩm lá dựa vào công thức sau:

Trong đó: H: độ ẩm (%); m
0
: khối lượng lá hoặc vỏ quả tươi trước khi sấy (g); m
1
: khối
lượng lá hoặc vỏ quả sau khi sấy (g).
2.2.4. Phương pháp chuẩn độ [2]
Xác định hàm lượng axit tổng số trong lá, vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88.
Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.

Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X
1
) tính bằng công thức:
trong đó: n: số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd: thể tích mẫu
cô đặc; P: trọng lượng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904.
100.
10
m
mm
H
−
=
P
100
.
V
Vcd
.n.KX
1
=
2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ (IR)
Các phân tử luôn dao động không ngừng. Tần số dao động của các phân tử phụ thuộc
vào hằng số lực của liên kết và khối lượng của chúng, do đó các nhóm chức khác nhau sẽ có
tần số hấp thụ khác nhau nằm trong vùng từ 5000 – 200 cm
-1
. Mỗi nhóm nguyên tử (nhóm
chức) xác định có tần số xác định và không đổi trong bất kỳ hợp chất nào có chứa nhóm
nguyên tử đó. Vì vậy, khi phân tích trên quang phổ hồng ngoại ta có thể xác định được các
nhóm nguyên tử mà chất đem phân tích có được.
2.2.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [3] [4]

Chất chuẩn là (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng
Sigma-Aldrich, công thức C
12
H
10
Ca
3
O
16
.xH
2
O.
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào
cốc 50-mL chứa 5.0 mL nước, và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy
trong thời gian 10 phút sử dụng khấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa được rửa với nước
có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch dược trộn lẫn và làm thành 25 mL, khuấy trộn, và lọc
sử dụng giấy lọc. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320
ppm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xitric cho HPLC: Dung dịch chuẩn axit xitric được
chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nước cất 3 lần cất.
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu gồm máy
sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng Knauer, và lắp cột sắc
kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5µm. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient,
hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190-
740 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng
1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10-30% trong thời gian 0-
25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn
và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45 µm và tiêm vào HPLC.
Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực hiện bằng
cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn

chứa 10-320 ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần
thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên
biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy).
Tương tự, đường chuẩn của axit xitric được tiêm vào HPLC, được thực hiện như cách thảo
luận trên, và kết quả thu được các diện tích pic.
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào
nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới
(LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp
nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ
lệ 1:100 với nước cất 02 lần cất, ngoại trừ dịch chiết lá bứa pha loãng với tỉ lệ 1:25, quả chiết
bằng methanol tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20 µL, HCA, axit
xitric thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng
đường chuẩn. Nồng độ của HCA và axit xitric trong mẫu được trình bày bằng g/100 g mẫu.
Phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có thể sử dụng để xác định axit hữu cơ trong dịch
chiết, phương pháp này giúp ta xác định được tổng lượng axit có trong dịch chiết. Tuy nhiên,
trong phương pháp này không thể định lượng axit (-) hyđroxy xitric và axit xitric một cách
riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phương pháp sắc kí khí, trong phương pháp
sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Nhưng axit HCA sẽ bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Trong
phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit hữu cơ khác mà không
cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dung dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (-)-
HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá vỏ quả bứa
Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa được trình bày trong bảng 1 sau đây:
Bảng 1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả Bứa
Mẫu Stt
mẫu
Khối lượng lá

trước khi sấy (g)
Khối lượng lá sau
khi sấy (g)
Khối lượng nước
trong lá (g)
Độ ẩm
(%)
Lá bứa
1 9.726 2.789 6.937 71.32
2 9.96 2.898 7.062 70.9
3 10.172 3.022 4.17 70.49
Vỏ quả
bứa
1 10.6012 1.6767 8.9245 84.18
2 9.7521 1.547 8.2051 84.14
3 10.5966 1.6458 8.9508 84.47
Từ kết quả trên cho thấy độ ẩm trong lá Bứa tươi khoảng 70,70 ± 0,62 %, độ ẩm trung
bình trong lá là 70,70 %. Độ ẩm trong lá Bứa cao, chiếm khoảng 70% khối lượng lá. Độ ẩm
trong vỏ quả bứa khoảng 84,31 ± 0,16 %, độ ẩm trung bình trong vỏ quả là 84,31 %. Độ ẩm
trong vỏ quả bứa là rất cao, chiếm khoảng 84 % khối lượng vỏ quả.
3.2. Kết quả xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR)
Kết quả chụp phổ IR cho thấy xuất hiện pic có bước sóng từ 3300 – 3600 cm
-1
, đó là
phổ dao động của nhóm –OH có liên kết hiđro, và pic có bước sóng từ 1600 – 1800 cm
-1
, là
phổ của nhóm C=O trong nhóm – COOH (hình 2, 3).
0.00
0.05

0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
Absorbance
500
1000
1500
2000
2500
3000

3500
4000
Wavenumbers (cm-1)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12

0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
Absorbance
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Wavenumbers (cm-1)
Hình 2: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết trong nước Hình 3: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong nước
Từ những phổ hồng ngoại trên, có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của lá và
vỏ quả bứa có sự tồn tại của axit hữu cơ có nhóm –OH.
3.3. Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa
Bảng 2: So sánh axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC và phương pháp chuẩn độ
Axit hữu cơ xác định
bằng HPLC (g/100 g)
Mẫu Dung môi chiết HCA Axit xitric Chuẩn độ axit-bazơ (g/100g)
Lá bứa Nước 2,863 0 3,554
Vỏ quả bứa khô Nước 15,221 0,406 17,468
Vỏ quả bứa khô Axeton 12,999 0,239 13,711
Vỏ quả bứa khô Metanol 9,508 0,078 10,492
Số mẫu n=3, kết quả tính trung bình
Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp và phương pháp

chuẩn độ được thể hiện trong bảng 2. Tổng axit xác định bằng phương pháp chuẩn độ axit-
bazơ có kết quả lớn hơn tổng axit xác định bằng HPLC. Từ bảng trên cho thấy, chiết bằng
dung môi nước cho lượng axit là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ
yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, bởi vì giá trị thu được từ diện tích pic
của HCA lớn nhất. Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA, được
thể hiện trên sắc kí đồ hình 5, 6, 7, 8. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit xitric. Trên sắc
kí đồ, HCA cho pic đơn trong tất cả các mẫu chiết. Riêng đối với mẫu lá bứa chiết trong nước
không xuất hiện pic của axit xitric. Xác định pic HCA được dựa vào pic của axit HCA chuẩn
xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit xitric xác định nhờ pic axit chuẩn
xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút (hình 4). Thời gian lưu của HCA và axit xitric được tìm
thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065, 5,609 ± 0,010 phút.
Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn. Đường
chuẩn được xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320 ppm, phương trình đường chuẩn: C = 1,37A-
6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R
2
=0,999698.
Hình 4. Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 5. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong metanol
Hình 6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong nước Hình 7: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô chiết trong axeton
Hì
nh 8: Sắc kí đồ mẫu lá bứa chiết trong nước
4. Kết luận
Bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) đã xác định được hàm lượng axit hữu cơ
trong lá, vỏ quả bứa. Kết quả cho thấy axit (-) hyđroxy xitric là thành phần axit chủ yếu có
trong lá, vỏ quả bứa. Hàm lượng HCA tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa khô là khá cao, cụ thể
HCA trong lá, vỏ quả bứa khô lần lược là 2,863 và 15,221 %.
Từ kết quả này có thể tiếp tục nghiên cứu sâu để sản xuất thực phẩm chữa trị béo phì từ
cây bứa Việt nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]
Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

[2]
TCVN 4589-88: Đồ hộp-Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số và axit bay hơi.
[3]
Bhabani S. Jena, Guddadarangavvanahally. Jayaprakasha, Kunnumpurath K. Sakariah*.
(2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of
Agricultural and Food chemistry, Vol 50, No. 12, 2002.
[4]
Jayaprakasha GK, Sakariah KK. (2002 Apr 15), "Determination of organic acids in leaves and
rinds of Garcinia indica (Desr.) by LC", Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 28(2):379-84.
[5]
Jena BS, Jayaprakasha GK, Singh RP, Sakariah KK. (2002 Jan 2), "Chemistry and
biochemistry of (-)-hydroxycitric acid from Garcinia", Journal of Agricultural and
Food chemistry, 50(1):10-22.
[6]
Shara M, Ohia SE, Schmidt RE, Yasmin T, Zardetto-Smith A, Kincaid A, Bagchi M,
Chatterjee A, Bagchi D, Stohs SJ. (2004 May), "Physico-chemical properties of a
novel (-)-hydroxycitric acid extract and its effect on body weight, selected organ
weights, hepatic lipid peroxidation and DNA fragmentation, hematology and clinical
chemistry, and histopathological changes over a period of 90 days", Molecular and
Cellular Biochemistry, 260(1-2):171-86.