Nghiên cứu phương pháp chuẩn đoán nấm bệnh aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin bằng môi trường thạch nước dừa luận văn tốt nghiệp đại học

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
KHOA NÔNG LÂM NGƯ
--------------

Phan Thị Phương

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM
BỆNH Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
BẰNG MÔI TRƯỜNG THẠCH NƯỚC CỐT DỪA
(COCONUT AGAR MEDIUM)


ii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

VINH – 07.2011


iii
Lời cam đoan!
Quá trình thực tập tốt nghiệp là khoảng thời gian để người sinh viên có
điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức
mới mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn. Tiếp tục rèn luyện
đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa hoc kỹ thuật.
Để hoàn thành luân văn này tôi xin cam đoan:
1. Trong quá trình nghiên cứu bản thân luôn nhiệt tình với công việc.

2. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực.
3. Kết quả nghiên cứu của bản thân có được là nhờ sự giúp đỡ tận tình, chu
đáo của thầy giáo hướng dẫn PGS. TS Trần Ngọc Lân và cô giáo hướng dẫn KS
Hồ Thị Nhung và các thầy cô giáo trong phòng thí nghiệm.
4. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Nghi lộc, tháng 7 năm 2010
Tác giả luận văn
Phan Thị Phương

Lời cảm ơn


iv
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tôi luôn nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô giáo trong khoa Nông Lâm Ngư
Trường Đại học Vinh, các nhà khoa học, người dân nơi thu mẫu và bạn bè thân
hữu gần xa.
Hoàn thành luận văn này cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS Trần Ngọc Lân đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong suốt cả quá trình thực
hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn KS Hồ Thị Nhung đã nhiệt tình truyền đạt những
kỹ năng, kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học cho tôi. Đặc biệt cô luôn động
viên khuyến khích và mang đến cho tôi niền tin, lòng say mê nghiên cứu khoa
học.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công chức khoa Nông Lâm
Ngư, tổ bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm, thư viện đã tạo điều kiện giúp đỡ
cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận sự động viên, hỗ trợ rất lớn về
vật chất và tinh thần của gia đình, bạn bè. Tôi xin trân trọng biết ơn những sự

hướng dẫn, giúp đỡ, động viên đó.
Xin chân thành cảm ơn!
Nghi lộc, tháng 7 năm 2011
Tác giả luận văn
Phan Thị Phương


v
MỤC LỤC
Lời cam đoan............................................................................................................i
Lời cảm ơn...............................................................................................................ii
1.1.Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và độc tố Aflatoxin trên lương thực,
thực phẩm..........................................................................................................................4
1.2. Sơ lược về các loài Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin .................................................7
1.3. Độc tố Aflatoxin ..............................................................................................................10

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977)..................................13
1.3.2. Aflatoxin và tác động của nó đối với sức khỏe con người ..........................................13

Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành ............15
Hình 1.3. Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin
của các loài Aspergillus spp................................................................................18
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu.....................................................25
2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................25

........................................................................................................................... 31
........................................................................................................................... 31
........................................................................................................................... 31
Hình 2.2. Mầu sắc A. flavus trên môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có
độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có hoặc không có độc tố Aflatoxin) và trắng

(không có Aflatoxin)...........................................................................................31
Hình 2.3. Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng nấm
A. flavus dưới ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin,
màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin)............................................................32
Bảng 3.1. Thành phần và mức độ phổ biến của nấm bệnh hại hạt giống ngô..33
Bảng 3.2 Thành phần và mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống...................33
Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) một số huyện Nghệ
An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh...................................................................................37
Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và
phụ cận...............................................................................................................41


vi
Hình 3.1. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và
phụ cận...............................................................................................................41
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ
vùng Nghi Lộc và phụ cận..................................................................................42
Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận.44
Hình 3.3. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận. 45
Bảng 3.7.1. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh..........46
Bảng 3.7.2 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An............................46
Bảng 3.7.3. Tỷ lệ các chủng A. flavus sinh độc tố Aflatoxin tại Nghệ An,
Thanh Hóa và Hà Tĩnh......................................................................................47
Bảng 3.8. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ nông sản thu được từ chợ vùng Nghi Lộc
và phụ cận........................................................................................................... 49

vii
BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ cái viết tắt
A. candidus
A. flavus
A. fumigatus
A. glacus
A. nomius
A. ochraceus
A. oryzae
A. paraciticus
AFB1
CAM
ELISA
HPLC
HPTLC
PCR
PDA
TLC
UV

Nội dung
Aspergillus candidus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus glacus
Aspergillus nomius
Aspergillus ochraceus
Aspergillus oryzae
Aspergillus paraciticus

Aflatoxin B1
Coconut agar medium
Enzyme – linked immunoabsorbant assay
High – performance liquid
chromatography
High performance thin layer
chromatography
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Potato- Dextrose- Agar
Thin – layer chromatography
Đèn tia cực tím


viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của Aflatoxin (Jones, 1977)...................................13
Hình 1.3. Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin
của các loài Aspergillus spp................................................................................18
............................................................................................................................ 31
............................................................................................................................ 31
............................................................................................................................ 31
Hình 2.2. Mầu sắc A. flavus trên môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có
độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có hoặc không có độc tố Aflatoxin) và trắng
(không có Aflatoxin)...........................................................................................31
Hình 2.3. Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin được sinh ra bởi các chủng nấm
A. flavus dưới ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin,
màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin)............................................................32
Hình 3.1. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và
phụ cận...............................................................................................................41
Hình 3.3. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận. .45

ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 ở
Philippin)..................................................................................................................4
Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành .............15
Bảng 3.1. Thành phần và mức độ phổ biến của nấm bệnh hại hạt giống ngô...33
Bảng 3.2 Thành phần và mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống....................33
Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) một số huyện Nghệ An,
Thanh Hóa, Hà Tĩnh..........................................................................................37
Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ các chợ vùng Nghi Lộc và
phụ cận...............................................................................................................41
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ
vùng Nghi Lộc và phụ cận..................................................................................42
Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus trên đất trồng lạc vùng Nghi Lộc và phụ cận..44
Bảng 3.7.1. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Thanh Hóa, Hà Tĩnh..........46
Bảng 3.7.2 Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các
chủng A. flavus thu thập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An............................46
Bảng 3.7.3. Tỷ lệ các chủng A. flavus sinh độc tố Aflatoxin tại Nghệ An, Thanh
Hóa và Hà Tĩnh..................................................................................................47
Bảng 3.8. Khả năng sinh độc tố Aflatoxin trên môi trường CAM của các chủng
A. flavus thu thập được từ nông sản thu được từ chợ vùng Nghi Lộc và phụ cận
............................................................................................................................ 49


1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus

flavus sinh độc tố Aflatoxin
Lạc, đậu tương, ngô là những loại cây công nghiệp, lương thực phổ biến trên
thế giới và ở nước ta, nó được xem là những cây mũi nhọn về chiến lược kinh tế
trong việc sản xuất và khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới. Phần lớn nấm
mốc trên các loại hạt này thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium và trong số
chúng sản sinh ra độc tố. Theo nghiên cứu, người ta kết luận có 4 độc tố hiện diện trên
hạt lạc là: Aflatoxin, Citrinin và Ochratoxin A trong đó Aflatoxin được đặc biệt chú ý
vì tính độc của nó.
Aflatoxin là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất hình thành trong
tự nhiên. Chúng bao gồm một họ độc tố sinh ra từ nấm Aspergillus flavus và
Aspergillus paraticus. Điều kiện thời tiết ở Việt Nam được xem là môi trường lý
tưởng cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nói chung và nấm Aspergillus
spp. nói riêng. Nấm mốc có mặt khắp mọi nơi và thường phát sinh, phát triển trên
các sản phẩm lương thực, thực phẩm…và cả trên hoa quả. Bên cạnh việc nấm mốc
gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng và giá trị sử dụng còn có rất
nhiều loài nấm mốc tiết ra độc tố gây bệnh cho con người gây tổn thương gan, gây
ung thư, gây giảm sức đề kháng cho cơ thể. Chính vì tác hại của độc tố này gây
nên với con người nên nhiều nước phát triển trên thế giới như: Mỹ, Nhật Bản, các
nước EU, …khi nhập lương thực, thực phẩm như: ngô, lạc, cà phê, chè,…đã đưa ra
khung giới hạn về hàm lượng về Aflatoxin phải ở dưới mức cho phép. Thực tế thì
đã có nhiều lô hàng nông sản xuất khẩu của nước ta như: lạc, đậu tương... đã bị trả
lại do phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép. Vì vậy, việc nghiên
cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc tố
Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu
tác hại của nấm. Nhiều nghiên cứu liên quan đến việc giảm thiểu độc tố Aflatoxin
sinh ra bởi A. flavus từ những năm giữa thập niên 1970 của thế kỷ trước. Từ đó đến


2
nay có nhiều công trình nghiên cứu về Aflatoxin và một số myctoxin khác đã được

thực hiện. Mặt dù sự hiện diện của A. flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với
việc tồn tại Aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ
lớn về việc có thể nhiễm Aflatoxin. Do đó việc định tính và định lượng được dư
lượng Aflatoxin là cần thiết và quan trọng.
Môi trường thạch nước cốt dừa được sử dụng để xác định sự có mặt của
độc tố Aflatoxin sinh ra bởi Aspergillus spp. từ những ưu điểm như: (i) rất dễ
chuẩn bị môi trường; (ii) xác định được sự hiện diện của độc tố Aflatoxin nhanh
chóng và rõ ràng bằng huỳnh quang; và (iii) sự có mặt của Aflatoxin làm môi
trường bị biến màu vàng cam - là cơ sở để định tính nhanh chóng Aflatoxin mà
không cần sử dụng đèn tia cực tím.
Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy các loài
A. flavus sinh độc tố Aflatoxin, góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm trong sản
xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc
tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium)".
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
Xác định thành phần bệnh hại chủ yếu hại trên các loại nông sản lạc, ngô,
đậu tương. Nhận xét tỷ lệ mẫu nông sản và mẫu đất trồng ngô, lạc nhiễm A. flavus.
Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A. flavus sinh độc tố Aflatoxin
bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM) làm cơ sở đánh giá tình hình nhiễm
Aflatoxin trên nông sản và trên đất trồng lạc, ngô.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định thành phần nấm hại nông sản (lạc, ngô) trên mẫu nông sản thu
được tại một số xã, huyện vùng Nghệ An.
Xác định thành phần nấm hại trên mẫu đất thu được tại một số xã, huyện
vùng Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh.


3

Đánh giá tỷ lệ nhiễm A. flavus của mẫu nông sản thu được từ các chợ, kho
bảo quản nông hộ và của các mẫu đất thu được.
Chẩn đoán các chủng A. flavus phân lập được từ nông sản và từ đất sinh
độc tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM).


4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tính nguy hại của việc nhiễm nấm Aspergillus spp. và độc tố
Aflatoxin trên lương thực, thực phẩm
Theo thống báo của tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổn thất hàng năm
ước tính khoảng 12 – 15 % trên toàn thế giới, trong đó 25% nông sản của toàn
thế giới bị nhiễm các độc tố nấm mốc. Vì vậy, phòng chống độc tố nấm mốc là
vấn đề hết sức quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và được các nước trên thế
giới đặc biệt quan tâm [7].
Ở Philippin các sản phẩm công nghiệp dùng làm thức ăn như lạc, gạo, đậu
tương và cà phê cũng được xác định là nhiễm A. flavus và độc tố Aflatoxin ở các
mức độ khác nhau và được thể hiện ở bảng 1.1 [2].
Bảng 1.1. Sự có mặt của A. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc
(từ 1967-1983 ở Philippin)
Tỷ lệ nhiễm A. flavus

Hàm lượng Aflatoxin B1

(%)

(ppb)

Lạc còn tươi mới đào

5

14

Lạc ở trại, bảo quản

1

257

45

964

Lạc còn trong vỏ

25

0

Nhân lạc bóc vỏ lụa

90

114

Loại mẫu lạc

trong các chum, kho

Lạc đã bóc vỏ từ các
kho nông trại

Có nhiều chủng nấm mốc tiết ra độc tố này (nấm A. flavus, A. parasiticus,
A. nomius), nhưng A. flavus là loài nấm mốc cung cấp những lượng Aflatoxin lớn


5
nhất, nguy hiểm nhất. Ở khắp các vùng Nam Phi, nơi người ta ăn nhiều lạc có mốc
A. flavus, tỷ lệ bệnh nhân bị ung thư gan rất cao. A. flavus gặp nhiều ở các lương
thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp
nhất cho sự phát triển [17]. Tác giả Hiscocks đã nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí
nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc – 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin
B1 (độc tố chủ yếu của A. flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc.
Còn trên lạc khô: 42% số mẫu là rất độc; 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không
độc [5].
Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A. flavus được phân lập từ 13-21% trong các
mẫu gạo. Những nghiên cứu ở Thái Lan cũng cho thấy A. flavus có mặt trong nhiều
loại thực phẩm bán trên thị trường. Các chủng sinh Aflatoxin cũng có trong đất
trồng trọt. A. flavus được phân lập từ 15 trong 50 mẫu đất ở Malaysia và 29 trong
106 mẫu đất ở Thái lan, 16 chủng trong số 44 chủng phân lập sản sinh Aflatoxin
[2]. Các trường hợp nhiễm độc ở người do ăn phải Aflatoxin có trong thực phẩm,
đặc biệt là ngô nhiễm hàm lượng cao đáng được quan tâm hơn lạc. Mặc dù lạc
nhiễm Aflatoxin nhiều hơn ngô, nhưng người ta chỉ ăn lạc với lượng nhỏ, trừ một
số nước ăn lạc khá phổ biến như Môdambic, Xênêgan, Xuđăng [2, 5].
Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự (2004) cho thấy sự nhiễm
Aflatoxin trên ngô do nấm A. flavus gây nên là một vấn đề quan trọng ở các vùng
trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến
2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A. flavus trong đất và đã xác định rằng
mức nhiễm A. flavus trong đất trồng ngô bị ảnh hưởng bởi các vụ canh tác trước.

Mật độ A. flavus cao nhất là 794 CFU/g, trong đất trồng ngô vụ 2001 so với 251
CFU/g trong đất trồng bông gối vụ năm 2000 và 457 CFU/g đất trồng lúa mì gối vụ
năm 2002. Sự nhiễm A. flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0% đến 100%
(trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng Aflatoxin trong ngô dao động từ
0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Mức nhiễm Aflatoxin phân bố ngẫu nhiên
trong ngô ở ngoài đồng không tương quan tới sự nhiễm A. flavus: 43% đến 59% có
khả năng tạo các chủng A. flavus phân lập trong đất Aflatoxin. Với sự nhiễm cao


6
nhất ở quần thể đất của ngô gối vụ năm 2001. Kết quả cũng cho thấy 84% A. flavus
phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo Aflatoxin [13].
Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm Aflatoxin B 1 (mức trung bình 400µg/kg),
trong khi 40% nhiễm Aflatoxin B1 (mức trung bình 133µg/kg) đã được tìm thấy ở
Uganda và 97% ở đảo Cebu, Philippin trung bình là 213 µg/kg. Hàm lượng
Aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan tới sự bùng nổ của bệnh gan độc
tố cấp tính ở tây bắc Ấn Độ. Theo Goto và cộng sự 80 – 85% số mẫu ngô thu thập
từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái lan đã nhiễm Aflatoxin B 1
với lượng 6,30 – 1310 ppb và 0,6 – 767 ppb theo thứ tự. Trong năm 1973, nghiên
cứu về lạc bóc vỏ ở Mỹ cho thấy 15% của 361 mẫu có Aflatoxin giới hạn từ vết
đến 50 µg/kg. Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy Aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của
các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465
µg/kg. Các Aflatoxin đã tìm thấy ở 41% của 173 số mẫu lạc ở Sudan, 16 mẫu có
trên 250 µg/kg và 9% số mẫu có trên 1000 µg/kg. Ở Philippin, tất cả các mẫu lạc
được kiểm tra năm 1967 – 1969, có Aflatoxin với giá trị 155 µg/kg và giá trị trung
bình 500 µg/kg [5, 7].
Ở Inđônêsia các nghiên cứu về độc tố đã được tiến hành trên các cây trồng
như lúa, ngô, đậu tương, cây gia vị,cây thuốc. Các mẫu lạc thu từ trong kho của
dân, của các nhà phân phối và ở các chợ cho thấy tỷ lệ nhiễm A. flavus từ 60 - 80 %
với hàm lượng Aflatoxin từ 40 - 4100µg/kg. Các mẫu ngô mới thu hoạch lấy từ

các hộ nông dân, các nhà thu mua địa phương và các nhà phân phối tỉnh Lampung
có tìm thấy nấm A. flavus xâm nhập và hàm lượng độc tố Aflatoxin từ 5,3 - 291
ppb. Ngô và các thức ăn cho gà của các nhà sản xuất và các sản phẩm từ ngô của
các nhà máy cũng như siêu thị có độ ẩm từ 12,5 – 14,5% đều bị A. flavus xâm
nhiễm và có chưa độc tố Aflatoxin B1 từ 0 – 100 ppb. Trên đậu tương hai loại nấm
thường gặp là A. candidus, A. flavus có hàm lượng độc tố Aflatoxin trong các mẫu
giao động từ 8 – 34ppb [8].
Ở Việt Nam, Đậu Ngọc Hào và các cộng sự đã nghiên cứu mức độ nhiễm
nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa. Kết quả phân


7
tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã bị nhiễm A.
flavus với tần số cao, từ 50 - 80 %. Các loài khác như A. glacus, A. fumigatus và A.
candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A. ochraceus đã được phát hiện thấy ở
tỷ lệ thấp. Các loài thuộc chi Fusarium đã nhiễm với tần suất 15%. Kết quả nghiên
cứu mức nhiễm Aflatoxin những mẫu ngô trên đã cho thấy 33% số mẫu ngô hạt đã
bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 10 - 40 ppb, 83 % số mẫu bị nhiễm Aflatoxin B 2 từ 10 20 ppb, 72% mẫu ngô bột đã bị nhiễm Aflatoxin B1 từ 25 - 250 ppb ; 9,5% số mẫu
ngô bị nhiễm Aflatoxin B2 từ 10 - 20 ppb kg [2].
Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt
Nam cho thấy tần số nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm
lượng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng Aflatoxin trung
bình thấp nhất là 16,25 ppb đối với các tỉnh khác nhau kg [7].
1.2. Sơ lược về các loài Aspergillus spp. sinh độc tố Aflatoxin
Họ nấm Aspergillus spp có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoảng 20
loài gây hại cho con người. Trong đó A. flavus, A.parasiticus, A. nomius là ba
loài nấm trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển tiết ra độc tố
Aflatoxin cả trên môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy nhân tạo, ba loài
nấm này thuộc họ nấm cúc. Đây là các loài nấm khá phổ biến, có thể tìm thấy
trên khắp địa cầu, đặc biệt là các nước nhiệt đới [11, 35].

A. flavus khi phát triển trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bề
mặt khuẩn lạc có màu váng lục, do bào tử đính màu này được tạo ra rất nhiều. Hệ
bào tử đính thường có sợi cuống với vỏ cuống xù xì, có hai bộ cuống đính báo tử
và tạo bào tử đính có gai. Loại này có thể tạo Aflatoxin và có khả năng gây
bệnh. Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong
nước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển
trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây
trồng. Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại
này thường rất khó khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương
thực như: Lúa, ngô, sắn. Trên một số loại hạt làm thực phẩm như: Lạc, đậu,


8
vừng, vv…. Trên thực phẩm như: Các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng,
đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị bầm dập như: Thanh long, nhãn,
xoài, vải,…[2, 11, 14].
1.2.1. Điều kiện xâm nhiễm và sinh độc tố của các loài Aspergillus spp.
Khả năng sinh độc tố của các chủng A. flavus và A. parasiticus rất khác
nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các
yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường
Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc.
Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ các hạt khác nhau
thường không thấy hoặc rất ít khả năng sinh độc tố. Ngay cả trên cùng một cơ
chất, khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng A. flavus cũng khác nhau.
Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng
với A. flavus sinh độc tố Aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện
trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin. Sự hình thành
Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển khối lượng sợi
nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian sản sinh
cực đại để sản sinh Aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó

giảm đi. Lí do của sự giảm lượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá
trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc.
Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là
từ 25-28oC. Nếu nuôi cấy A. flavus ở 45oC thì khả năng sản sinh Aflatoxin sẽ bị
ức chế. Hàm lượng trong cơ thể đóng vài trò quan trọng trong quá trình hình
thành Aflatoxin. Ở lạc nhân có lượng nước từ 15-30%. Sự hình thành Aflatoxin
xuất hiện sau 2 ngày, trên gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%.
Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rất nhanh đặc biệt là sau thu
hoạch. Cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên
nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin [11].
1.2.2. Hình thái học nấm A. flavus và nấm A. paraciticus
Trong tự nhiên, có thể dễ dàng phân biệt được loài nấm này do chúng có


9
màu sắc dễ nhận. Màu vàng lục hay màu xanh lục của đám bào tử khi chín bám
trên các mầm của hạt hoặc phát triển trên các kẽ giữa hai phiến của hạt, khi tách
ra có thể nhìn thấy rất rõ. Ở các khe giữa hạt lạc hay lớp mầm của hạt ngô bị mốc
có thể quan sát thấy bào tử. Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, trên thạch
Sabouraud hay Czapek Doc hình thành khuẩn lạc sau 24 giờ, khu vực trung tâm
có màu vàng nhạt, rìa mép màu trắng mịn. Sau 48 giờ hình thành nhiều bào tử
miền trung tâm, xuất hiện các khối bào tử chín, màu vàng nhạt đã chuyển sang
màu vàng lục. Từ 72 – 96 giờ, khuẩn lạc phát triển mạnh và đạt cực đại ở ngày
thứ 6 – 7 khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc có kích thước tới 4 – 5 cm,
hình thành nhiều vòng tròn đồng tâm đều đặn, thường có 5 – 6 vòng tròn màu
xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc, rất dễ phân biệt với nhiều loại nấm mốc khác.
Quan sát đặc điểm vi thể dưới kính hiển vi ở bội số thấp (X16) cũng có thể phân
biệt được do cơ quan sinh sản của loại nấm này rất phong phú. Cơ quan sinh sản
có hình hoa cúc. Bọng tròn có kích thước từ 25 – 45 µm, giá conidi
(conidiophores) (cuống sinh bào tử) mọc thẳng từ sợi xù xì có kích thước từ 400

– 1000 µm; rộng 5 – 15 µm. Bào tử trần (conidi) hình tròn hoặc hình ovan, có
đường kính từ 2 – 4 µm. Thể bình có hai lớp, kích thước từ 10 – 15 µm và 3 – 5
µm, đôi khi chỉ có 1 lớp [2, 11].

Hình 1.1. Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link – Cơ quan sinh sản
gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi).


10
Nấm A. flavus, A. parasiticus thường nhầm lẫn với loài A. oryzae trong sử
dụng (chúng có hình thái, cấu tạo và mối quan hệ di truyền rất gần nhau), như có
mầu khuẩn lạc xanh nhạt, cuống sinh bào tử không mầu, lớn như nhau, đầu thể
bình lưỡng tính hoặc đơn tính, bào tử hình cầu nhỏ... Vì vậy, chúng ta cần phải
kết hợp cả việc quan sát mầu sắc khuẩn lạc trong quá trình phân lập, nuôi cấy và
hình ảnh cuống sinh bào tử khi soi kính hiển vi để tránh nhầm lẫn khi phát hiện
các loại nấm này (A. flavus có kích thước cuống sinh bào tử (0,4 – 1mm) trong
khi đó A. oryzae là (1 – 2 mm) [2, 11].
1.3. Độc tố Aflatoxin
Độc tố nấm còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng,
có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm
mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm . Sự sinh trưởng và phát
triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Morrau 1974). Những
điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng
nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua
lại của kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng (Scheoedes và
Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hoá. Quá
trình trao đổ chất gồm 2 giai đoạn: Trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp.
Quá trình trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành chất cần thiết
đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào còn trao đổi chất thứ cấp là quá trình
tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ, chưa thật cần thiết

cho sự tồn tại của chính tế bào đó. Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào là
căn bản giống nhau ở các thế hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ
cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài, mỗi chủng nấm mốc.
Thông thường quá trình này thường xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế
bào nấm mốc. Các độc tố nấm mốc được tổng hợp từ nhiều đường chuyển hoá
khác nhau, cụ thể như sau:
+Dẫn xuất của đường glucoza
+ Dẫn xuất của các axitamin


11
+ Dẫn xuất của polyxetoacid
+ Dẫn xuất của terpenteichthecen
+ Các dẫn xuất của mevelonat kết hợp với axitamin.
Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu.
Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loài nấm có
thể đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin
có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực
phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium,
Alternaria và Claviceps. Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2,
M1, M2), sterimatocystin, axit cyclopianzoic. Các độc tố của Fusarium:
deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố của Penicillium:
Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, và axit cyclopianzoic toxin,
diacetocyscirpenol, fumonisin và moniliformin. Các độc tố của Alternaria: axit
tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. Các độc tố của Claviceps: Các
alkaloit Ergot. Mặc dù độc tính của những loài nấm lớn nhất định đã được biết
tới từ lâu, nhưng khả năng gây độc cho con người từ các sản phẩm độc của các
nấm mốc chưa được thừa nhận, cho mãi đến năm 1850, khi sự liên quan giữa
việc ăn phải lúa mạch đen nhiễm Claviceps purpurea và các đặc tính lâm sàng
của bệnh Ergot đã được phát hiện. Vấn đề này được tiếp tục bằng các báo cáo về

các độc tố nấm mốc khác đã ảnh hưởng đến con người như xác định các hội
chứng liên quan đến việc ăn phải bánh mì nhiễm Furarium graminearum, sự
nhận biết bệnh do nấm mốc Stachybotris và những nghiên cứu liên quan đến
bệnh giảm bạch cầu độc tố thực phẩm (ATA), và sự ăn phải các hạt lương thực
để qua mùa đông nhiễm Fusarium poae và Fuarium sporotrichioides ở nước Nga
trong chiến tranh thế giới lần thứ hai. Những số liệu có giá trị về mycotoxin và
các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên
động vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản
phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo
mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp


12
mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa thịt. Trong số các mycotoxin thì
Aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về
mọi phương diện. Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen biết là A.
flavus và A. parasiticus.
1.3.1. Tính chất hoá lý của Aflatoxin
Các Aflatoxin gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản
phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm A. flavus và A. parasiticus, được đặt tên là
B1, B2, G1, G2. Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật.
Bốn chất được phân biệt trên cơ sỏ màu phát quang của chúng. B là chữ
viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green
(màu xanh lá cây). Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá được
gọi là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk).
Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng
độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp
hơn.
Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, Aflatoxin G1 có màu
huỳnh quang xanh lá cây. Aflatoxin

G1 có chứa hai vòng lacton,

Aflatoxin B1có chứa 1 vòng lacton. Sau đó, hai Aflatoxin B1, G2 cũng
được phát hiện. Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống Aflatoxin
B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử.
Năm 1966, Dutton và Heathcote đã phát hiện thấy trong môi trường nuôi
cấy có hai dẫn xuất hydroxi-2 của Aflatoxin B2 và Aflatoxin G2 là
Aflatoxin B2a và Aflatoxin G2a.
Allcroft và Carnaaghan đã nhận thấy trong sữa và thịt bò cũng có dẫn xuất
của Aflatoxin B1và B2, được đặt tên là Aflatoxin M1và M2. Cả hai chất
này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím. Ở gan, thận và nước tiểu của
cừu cũng tìm được hợp chất như vậy.
Aflatoxin

Công thức

Trọng lượng phân tử

Điểm nóng chảy


13
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2
Aflatoxin G1
Aflatoxin G2
Aflatoxin M1
Aflatoxin M2

C17H12O6
C17H14O6
C17H12O7
C17H34O7
C17H12O7
C17H14O7

321
314
328
330
328
330

268-269
286-289
244-246
229-231
299
293

Aflatoxin M
Aflatoxin M2
1.3.2. Aflatoxin và 1tác động của nó đối với sức khỏe con người
Hình Nông
1.2. Cấu
trúc hoá
Aflatoxin
Theo Tổ chức
lương

Thếhọc
giớicủa
FAO,
khoảng(Jones,
25% 1977).
cung cấp ngũ cốc
thế giới có chứa một lượng lớn mycotoxin. Tại nhiều nơi ở châu Á, tỷ lệ nhiễm
mycotoxin cao hơn do các nhân tố khí hậu và phương thức thu hoạch, bảo quản
hạn chế. Theo các tài liệu khoa học, có 6 loại Aflatoxin, trong đó độc nhất là
Aflatoxin B1 (AFB1). Sự nguy hiểm của AFB 1 ở chỗ nó có khả năng gây hại
chỉ với liều lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam (với lượng chỉ
đủ đính trên đầu 1 móng tay) cũng đã đủ làm hỏng gan. Độc chất này lại bền
vững với nhiệt, nếu đem đun sôi 100 độ C ở nồi bình thường hoặc nhiệt độ cao
hơn ở nồi áp suất hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc thì Aflatoxin


14
vẫn không bị phân hủy. Cái nguy hiểm nữa là với điều kiện nóng ẩm như nước ta
thì nấm mốc hiện diện gần như khắp nới, trên hạt bắp, hạt lạc, cám gạo, khô
dầu… Một điều tra của Trung tâm y tế dự phòng thành phố Hồ Chí Minh thấy
hàm lượng Aflatoxin trong lạc cao gấp 263 lần ngưỡng cho phép. Khảo sát của
Viện nghiên cứu Dầu thực vật cũng cho kết quả cứ 11 mẫu thử thì có 5 mẫu
nhiễm Aflatoxin với hàm lượng từ 20 – 112 mg/kg (gấp 2 đến 11 lần ngưỡng cho
phép). Mối nguy hiểm khác, khi các nguyên liệu thức ăn gia súc như bắp, khô
dầu đậu nành bị nhiễm mốc thì người sử dụng thường vò, sảy và thổi cho bay
mốc, cứ tưởng như thế thì sẽ sử dụng được nhưng trên thực tế thì chỉ bay các sợi
nấm còn độc tố Afatoxin do nấm tiết ra vẫn còn nguyên trong nguyên liệu đó
[20].
Hiện nay có khoảng 300 Aflatoxin với trên 100 loài nấm mốc tương ứng
đã được phát hiện, trong đó chiếm số đông là Penicillium sau đó đến Aspergillus [1].

15
Bảng 1.2. Các loài thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành
Loài nấm
A. flavus

Mycotoxin
Aflatoxin , acid koji, acid nitro-propionic, acid Aspergillic,
aspertoxin,...

A. parasiticus

Aflatoxin

A. niger

Aflatoxin

A. fumigatus

Aflatoxin , fumigacillin, gliotoxin

A. oryzae

Oryzacilli, acid koji

A. versicolor

Versicolorin A, B, C; aversin, sterogmatocystin

(Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004.)

Aflatoxin là một độc tố nấm mốc đáng sợ nhất. Có nhiều chủng nấm mốc
tiết ra độc tố này, nhưng A. flavus là loài nấm mốc cung cấp những lượng Aflatoxin
lớn nhất, nguy hiểm nhất. Sau này các nhà hóa sinh học đã xác định thêm không
phải chỉ có một mà nhiều Aflatoxin có công thức hóa học khá gần gũi nhau. có 4
loại Aflatoxin đã được xác định là B1, B2, G1, G2 (Phân biệt ký tự "B" và "G" theo
màu huỳnh quang xanh da trời và xanh lá cây khi chiếu tia cực tím lên bản tách các
vết sắc ký lớp mỏng Aflatoxin).
Ðộc tố Aflatoxin rất bền với nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt
độ rất cao, các bào tử của mốc bị tiêu diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá
hủy hoàn toàn. Người ta đã nghiên cứu thấy rang lạc ở 15000C trong 30 phút thì tỷ
suất Aflatoxin B1 giảm trung bình 80% và Aflatoxin B2 giảm 60%. Như vậy lạc
mốc dù được rang ở nhiệt độ cao, ăn vào vẫn nguy hiểm.
Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn gây tử vong cho
hàng loạt người và gia súc mà nguyên nhân chính là do độc tố của một số chủng
vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện
một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong
thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số


16
người ăn phải ngũ cốc bị mốc [21].
Đến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần
đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành
nghiên cứu và phát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to gan, sau xét
nghiệm và phân tích đã xác định tác nhân gây chết là độc tố Aflatoxin do nấm A.
flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên thức ăn [38, 40].
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc
tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Người ta đã

biết Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất tác động qua
đường miệng nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89
ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau. Năm 1961, ở Anh người ta đã
tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó
20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan. Robinson nghiên cứu
trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, ông đã tìm
thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan và trong sữa của những
bà mẹ có con bị xơ gan. Như vậy, theo ông giữa xơ gan và Aflatoxin có một mối
quan hệ khá chặt chẽ với nhau [5].
Ở Thái lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu
lương thực thực phẩm bị mốc thì 50 – 60% số mẫu đó có Aflatoxin. Đồng thời
nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm
tại các gia đình) cũng thấy có 30 – 50% số mẫu có độc tố Aflatoxin.
Ở Hà Lan, những công nhân làm việc ở nhà máy ép dầu lạc có thể tiếp
nhận từ 0,039 ppb tới 2,5 ppb Aflatoxin trong một tuần lễ làm việc Theo Baxter
và cs (1981) có sự nguy hiểm khi tiếp xúc với bụi lạc hay các sản phẩm nông
nghiệp khác có chứa Aflatoxin, tuy mức độ nguy hiểm chưa được xác nhận [2].
Độc tính với các Aflatoxin , người ta đã thấy có một loạt những triệu
chứng gắn liền với sự nhiễm độc cấp tính và những sự biến đổi liên quan đến các
sự nhiễm độc mãn tính. Loại sau này có bản chất di truyền và tương ứng với ba
kiểu: Gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến. Hậu quả của việc nhiễm