NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG CÂY HÔNG ( Paulownia fortunei) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ PHỤC VỤ TRỒNG RỪNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY

KHOA CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM
..…………..

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG
CÂY HÔNG ( Paulownia fortunei) BẰNG PHƯƠNG
PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ PHỤC
VỤ TRỒNG RỪNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ XUÂN ĐẮC
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BỘ MÔN - KHOA: CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM
NGƯỜI THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ TRÀ MY
LỚP: K2- CNSH2

HÀ NỘI- 2012


Lời cảm ơn
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê
Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học đã luôn tận tình giúp đỡ cà hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học, Viện
Công Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo của khoa Công Nghệ Nông Lâm - Thực Phẩm trường Đại Học Thành Tây đã truyền đạt cho tôi những tri
thức mới, lòng say mê nghiên cứu khoa học suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè những người đã ủng hộ động
viên tôi trong suốt quá trình tôi học tập cũng nhưng nghiên cứu khoa học lời

biết ơn chân thành và sâu sắc nhất.

Hà nội, … ngày… tháng… năm
Sinh viên
Nguyên thị trà my

2


Mục lục

3


Phần 1: Mở đầu
1.1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay trên toàn thế giới diện tích rừng đang bị suy giảm 1 cách nghiêm
trọng. Tính tời thời điểm năm 2011, rừng chỉ còn chiếm 31% tổng diện tích đất
trên thế giới. Nguyên nhân là do khai thác rừng bừa bãi, khai thác quá mức,
cháy rừng, sự tàn phá của thiên tai… , sự tái sinh của cây lâm nghiệp hiện tại
chưa cao. Nhưng nhân tố chính ảnh hưởng đến diện tích rừng là do đất rừng bị
chuyển đổi mục đích sử dụng phục vụ cho sự đi lên của công nghiệp hóa, hiên
đại hóa. Diện tích rừng suy giảm ảnh hưởng lớn đến môi trường sống, tính đa
dạng sinh học và hệ sinh thái.
Tính đến thời điểm hiện tại, sự suy giảm mật độ rừng che phủ trên thế giới
đã mang đến những hậu quả nặng nề.
Biến đổi khí hậu toàn cầu, lượng cacbon dioxite trong không khí cao là thử
thách lớn đối với hệ sinh thái. Thiếu hụt nguồn nước ngọt, không khí bị ô nhiễm
nặng, năng lượng và nhiên liệu khan hiếm, kéo theo các vấn đề về y tế ảnh
hưởng trực tiếp đến sự sinh tồn và phát triển của con người.

Diện tích rừng bị thu hẹp, biến đổi khi hậu toàn cầu làm tăng nhanh thiệt hại
đến từ các thảm họa thiên nhiên
- Đợt bão năm 2005, bang Louisiana ( Mỹ) bị thiệt hại đến 135 tỉ đô la, mấy
tháng tiếp theo, thu nhập của toàn bang giảm đến 15%.
- Mùa lũ 2011 tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của 8 tỉnh bị ảnh hưởng của
lũ lụt, triều cường ở đồng bằng sống Cửu Long. Tính đến hết ngày 9/10: thiệt
hại về vật chất gần 1 tỉ đồng, 60.000 ngôi nhà đổ sập , cuốn trôi ngập trong
nước. Theo thống kê có 24 người chết trong đố 21 người là trẻ em, 6 người bị
thương.
- Núi lửa Mayon( Philippines, 1814) phun trào chôn vùi một thị trấn, làm
khoảng 1.200 người thiệt mạng. Năm 1993, phun trào giết chết 79 người.
- Sự phun trào của núi lửa Tambora( Indonesia, 1815) vùi lấp các cư dân đảo
Sumbawa trong tro bụi, khí độc và đá, 88.000 người thiệt mạng.
- Núi lửa Merapi( Indonesia ,31/10/2010) phun trào nham thạch, gây những
biển khói lớn, hàng nghìn người dân tại khu vực này phải sơ tán trong cảnh
hoảng loạn. Tính tới hết ngày, theo thống kê sơ bộ, số người thiệt mạng do núi
lửa và động đất tại Indonesia trong tuần vừa qua đã lên tới 500 người.

4


- Thảm họa động đất, sóng thần xảy ra tại đông bắc Nhật Bản( 11/3/2011) vừa
qua thiệt hại ước tính lên đến 235 tỉ USD, số người thiệt mạng lên đến
8.450 người; 12.931 người khác mất tích.
- Đợt nắng nóng quét qua Châu Âu hồi( 2003) làm thiệt mạng khoảng 35.000
người, tăng nguy cơ cháy rừng, các bệnh tật do nhiệt độ cao gây ra, và đóng góp
vào việc làm tăng nhiệt độ trung bình của trái đất.
Biến đổi khí hậu còn làm mất cân bằng đa dạng sinh học, có nguy cơ kìm
hãm sự phát triển dẫn đến sự tiệt chủng của nhiều loài sinh vật.
Chuyển đổi mục đích sử dụng của đất rừng cho quá trình công nghiệp hóa,

hiện đại hóa là sự vận động tất yếu dù nó mang lại rất nhiều hậu quả nặng nề.
Tuy nhiên ta cũng không thể phủ nhận những điều tốt đẹp nó mang lại cho sự
biến chuyển về kinh tế và khoa học kỹ thuật.
Ngành công nghệ của thế kỷ 21, công nghệ sinh học là ngành công nghệ cao
trong đó ưu tiên hàng đầu là kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhờ khả năng
ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là nhân nhanh, tạo cây sạch
bệnh, virut…
Chúng ta cần có các quyết sách để ngăn chặn hạn chế tối đa các tác động có
tính lâu dài của môi trường đến môi trường sống và hệ sinh thái. Tăng cường
nghiên cứu,chọn lọc kết hợp với các thành tựu khoa học kỹ thuật để tìm ra
giống ưu việt đáp ứng được yêu cầu đề ra, khôi phục lại diện tích rừng đã mất.
Trong hàng nghìn giống cây, qua tìm hiểu nghiên cứu, nổi bật lên là cây Hông
(Paulownia fortunei) mang đầy đủ các tính năng cần có mà các giống cây khác
không thể so sánh, đã được trông thử nghiệm và có kết quả đáp ứng được mong
muốn.
Tuy nhiên để có thể nghiên cứu đầy đủ và chi tiết về ứng dụng của việc nhân
giống và lợi ích đem lại của Hông trong trồng rừng tôi đã lựa chọn đề tài: “
Nghiên cứu nhân nhanh giốn cây Hông( Paulownia fortunei) bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để phục vụ trồng”.

1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nhân nhanh giống cây Hông phục vụ trồng rừng
1.2.2. Yêu cầu
Xác định của sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy như BAP,
hàm lượng agar tới hệ số nhân chồi.

5

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
( NAA) tới sự hình thành rễ in vitro của chồi hông nuôi cấy.
Xây dựng được qui trình nhân cây Hông trong ống nghiệm và nuôi trồng
cây con trong điều kiện nhà lưới.

1.3. Tình hình nghiên cứu Hông( paulonia fortunei) trên thế giới và Việt
Nam
1.3.1. Tổng quan nghiên cứu trên thế giới
Radojevic L. ( 1979) từ mô hữu tính tạo mô sẹo và nuôi cấy mô sẹo sau đó
tạo phôi trực tiếp từ mô sẹo và cho phôi phát triển trên môi trường MS.
Saito A( 1976) isolation of protoplasts from mesophyll cells of pawlonia
fortunei Hemsl.
Burger D.W (1985) nuôi cấy chồi nách tạo ra cây trên môi trường MS/2.
1.3.2. Tổng quan nghiên cứu trong nước
Cây Hông được Việt Nam du nhập từ úc từ năm 2000, đã có 1 số công trình
nghiêm cứu nuôi trồng trong ống nghiệm và được trồng nhiều ở miền nam và
tây nguyên.
TS.Trần Kim Tính(Trường Đại học Cần Thơ): trồng Hông ( Paulownia
fortunei) bằng hột và cây cấy mô tại Hậu Giang, cung cấp nguyên liệu cho các
nhà máy sản xuất giấy .
Viện Sinh học nhiệt đới (Trung tâm Khoa học tự nhiên và công nghệ quốc
gia) đã nhập giống gốc, nhân bằng phương pháp nhân cụm chồi trên môi trường
MS ( 1962).
Công ty Giống lâm nghiệp TP. HCM nhân giống bằng phương pháp vi giâm
cành ( microcutting) trên môi trường có bổ sung BA nồng độ thấp.
Bùi Duy Ngọc, Nguyễn Đình Hợi, Nguyễn Thị Minh Xuân( 2007): Bước
đầu nghiên cứu nâng cao khối lượng thể tích gỗ Hông (Paulownia fortunei).
Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp số 1/2007, trang 291-296.
Thái Xuân Du: Ảnh hưởng của nồng độ chất dinh dưỡng và ventilation
condition of the culture vessel on the groth of Hông(Paulownia fortunei) nuôi

trồng trong ống nghiệm. (Effects of nutrient concentration and ventilation
condition of the culture vessel on the groth of Paulownia(Paulownia fortunei)
cultured in vitro.) tạp chí những tiến bộ trong khoa học ( 2002).

6


Đoàn Thị Ái Thuyền, Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du & Nguyễn Văn
Uyển: Nhân giống vô tính cây hông –Paulownia fortunei ( Seem Hemsl). Bằng
phương pháp nuôi cấy mô. Tạp chí Sinh học 23 (3), 46-50( 2001).
Vũ Ngọc Phượng , Đoàn Thị Ái Thuyền, Lưu Việt Dũng, Thái Xuân Du &
Nguyễn Văn Uyển( 2001): Quy trình ươm cây hông ( Paulownia fortunei) giai
đoạn sau ống nghiệm. Trong cuốn: Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Sinh
thái Bền vững. Viện Sinh học Nhiệt đới. NXB Nông nghiệp. 69-75.
Lưu Việt Dũng: Nhân giống vô tính cây Paulownia fortunei ( Seem Hemsl)
bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tạp chí sinh học, Tập 24 số 2( 2002).
Lưu Việt Dũng: Quy trình ươm cây Hông( Paulownia fortunei) nuôi cấy
mô. Tạp chí sinh học, Nhà xuất bản nông nghiêp( 2001).
Thái Xuân Du: Quy trình ươm cây Hông ( Paulownia fortunei) giai đoạn
sau ống nghiệm. Tạp chí Công nghệ sinh học và Nông nghiệp Sinh thái Bền
vững, NXB Nông nghiệp( 2001).
Lê Tấn Đức: Tạo cây hông (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu
thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens. Hội nghị Công nghệ Sinh học
toàn quốc( 2003).
Lê Tấn Đức: Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cây Hông( Paulownia
fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen. Hội nghị
Công Nghệ Sinh Học toàn quốc( 2003).

Phần 2: Tổng quan tài liệu
2.1.

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng : Hông( Paullownia fortunei)
Cây Hông ( Paulownia fortunei) là một trong chín loài cây gỗ thuộc chi
Pawllonia họ hoa mõm chó Ssrophula riaceae, thân thẳng, có lớp vỏ cây trơn
láng, vỏ màu xám và bám chặt vào thân, lõi rộng, có kêt cấu đẹp. Chúng có bộ
rễ đâm sâu và ăn ngang nên hấp thu nhanh mọi nguồn dinh dưỡng và nước để
phát triển.
Hông là loài cây gỗ lớn, có tốc độ sinh trưởng nhanh và không kén đất, chỉ
cần đất xốp, dễ thoát nước. Trong điều kiện bình thường, mỗi năm cây có thể
tăng trưởng 3 – 4 cm đường kính. Trong điều kiện tối ưu, cây có khả năng tăng
trưởng 8 – 9 cm đường kính/năm. Chỉ sau 18 tháng, đường kính của cây có thể
đạt 16 – 22cm, chiều cao 10 – 12m. Sau 9 năm, trung bình 1 cây có chiều cao
20m, có thể tích từ 1 – 1,5m3. Nếu trong điều kiện tối ưu nhất, một cây có thể
đạt thể tích từ 2 đến 3m3 gỗ.
Từ lâu, nhiều quốc gia trên thế giới có điều kiện tự nhiên phù hợp với cây
Hông đã chọn cây Hông làm cây lâm nghiệp và chú ý phát triển. Ở Việt Nam
7


cây Hông phân bố trong rừng tự nhiên ở một số tỉnh phía Bắc giáp với biên giới
Trung Quốc.
Hông sinh trưởng phát triển nhanh, có tiềm năng phát triển rộng diện tích
theo mục đích trồng rừng nguyên liệu và tạo cảnh quan môi trường. Chúng là
loại cây sống lâu năm và cũng được sử dụng trong mục đích trồng rừng phòng
hộ đầu nguồn, bảo vệ môi trường.
Hông ưa sáng tuyệt đối, nhiệt độ phát triển tối ưu là được trồng ở vùng đất
cao trên 100m( so với mực nước biển), đất cát, thoát nước tốt. Hông ưa sáng,
nhiết độ trung bình 270C . Ở Việt Nam Hông thích hợp ở vùng đất của Tây

Nguyên, Lâm Đồng và một số tỉnh miền tây nam bộ có nhiều tiềm năng trồng
loại cây này như An Giang, Hậu Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng…
Không những thế Hông được đánh giá cao vì là cây có đa giá trị:
- Giá trị kinh tế:
Hông tăng trưởng nhanh mỗi năm có thể tăng từ 3 -4cm đường kính và tăng
0,04 -0,05m3. Hông có thời gian khai thác nhanh, giá trị kinh tế cao, trồng 3
năm có thể khai thác gỗ làm các loại giấy cao cấp như giấy in tiền, làm than
hoạt tính, làm ván ép… Hông trồng 9 năm sẽ cho gỗ quý hơn gỗ pơmu.
Gỗ Hông cứng, nhẹ, không cong vênh, có tính đàn hồi, không nứt nẻ khi
nhiệt độ thay đổi, vân mịn đẹp, chịu ẩm tốt, chống mối mọt, lại chịu nhiệt cao,
khó cháy. Gỗ Hông có màu vàng nhạt chuyển dần sang màu hổ phách với sắc
độ thay đổi từ từ …. Gỗ Hông được dùng sản xuất đồ trang trí nội thất cao cấp,
đồ gia dụng, xây dựng, đóng vỏ du thuyền, nội thất máy bay…
Hông còn chứa hàm lượng cenllulose cao (46 – 49%) hemicellulose( 22 –
25%) và hàm lượng lignin(21 -23%) thích hợp cho công nghệ sản xuất cồn công
nghiệp, cung cấp năng lượng chất đốt và làm bột giấy in tiền.
Gỗ Paulownia đã sấy khô lại có đặc tính cách điện và nhiệt rất tốt nên thích
hợp cho việc trang trí nội thất và dùng làm vật chèn lót bên trong các kiện hàng
thay thế cho vật liệu xốp để ổn định nhiệt độ bên trong. Việc chế biến gỗ
Paulownia cũng rất thuận lợi vì nó dễ cưa xẻ, bào, đục đẽo, không sợ nguy
hiểm.
Hoa Hông Hoa của hông có màu sắc đẹp hương thơm dịu nhẹ, chứa nhiều
mật có thể phát triển nghề nuôi ong.
Hông có thể trồng xen với các loại cây ngắn ngày và một số cây công
nghiệp như cao su, cà phê, ca cao, khóm… cây được trồng dưới bóng cây Hông
có thể tăng năng suất của cây lên 20%.
Lá hông chứa hàm lượng protein và vitamin cao có thể làm thức ăn cho gia
súc, làm phân bón.

8

Hông có khả năng tái sinh chồi tự nhiên rất tốt, tái sinh sau mỗi chu kỳ khai
thác. Tái sinh nhiều lần, cho phép khai thác nhiều đợt trên cùng một gốc cây
nên giảm chi phí đầu tư cho những mùa sau.
- Giá trị cho trồng rừng:
Hông là cây gỗ lớn, sinh trưởng rất nhanh (sau 6-7 năm trồng, cây cao hơn
10m, đường kính 35-40cm).
Rễ của Hông là rễ cọc phát triển mạnh, ăn sâu xuống mặt đất, tán lá rộng ,
nhiều cành lá to và thưa thích hợp cho phủ xanh đất trống đồi trọc.
Hông cũng được coi là cây lâu năm nên còn được trồng làm rừng phòng hộ.
Hông có khả năng tái sinh nhanh và cao, mỗi gốc có khả năng tái sinh nhiều
lần.
Gỗ Hông chỉ cháy ở nhiệt độ trên 4000C nên người ta còn thường trồng
Hông làm đường băng xanh phòng chống cháy rừng.
Gỗ Hông cháy chậm vì gỗ của Hông có rất nhiều lỗ nhỏ li ti trông giống
như tổ ong. Vách tế bào chứa ít lignin và gỗ dễ dàng chuyển thành carbon khi
gặp nhiệt độ cao. Lớp carbon này trở nên dẫn nhiệt kém và làm cho gỗ cháy
chậm giảm nguy cơ bùng phát cháy rừng vào mùa khô.
- Giá trị cho môi trường:
Hông có nhiều cành, tán lá rộng, lá to, khả năng bao phủ lớn ,hạn chế khả
năng gây thiệt hại do mưa bão.
Lá Hông có nhiều lông, tiết ra chất dính, có thể hút bụi, làm sạch không khí,
chống chịu rất mạnh đối với các khí độc như SO 2, Clo, HF, sương axít nitric…
vì vậy có tác dụng giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Khi lá rụng xuống mau phân hủy, nếu thời tiết vào mùa mưa, trong 45 ngày
đã hòa nhập vào tầng đất màu trên mặt tạo xốp đất và tăng độ phì nhiêu cho đất.
Hông có có cả 2 loại rễ, rễ cọc ăn sâu xuống mặt đất. Rễ chùm ăn ngang
giúp cải tạo đất vì có khả năng tự tạo ra các chất dinh dưỡng nuôi cây và làm
cân bằng hệ dinh dưỡng của đất.

Hông hấp thụ 1 lượng lớn CO2, làm giảm đáng kể lượng khí thải, giảm nguy
cơ gây ra hiệu ứng nhà kính và ô nhiễm môi trường.
Cả lá và hoa của Hông đều có hàm lượng đạm cao, dễ phân giải giúp cải
thiện đất
Hoa Hông có màu tím trắng rất đẹp, hương thơm dịu nhẹ làm tăng cảnh
quan sinh thái. Hông có lá dày, rộng, ưa sáng nên khả năng thoát hơi nước lớn
9


làm giảm nhiệt độ toàn cầu, tạo điều kiện cho nhiều hệ sinh thái khác cùng phát
triển tránh được sự tuyệt diệt, góp phần bảo toàn tính đa dạng sinh học.
- Giá trị cho y tế:
Rễ Hông dùng để làm thuốc chữa phong thấp, đau nhức xương.
Vỏ rễ chữa gân cốt ứ đau.
Quả dùng trị viêm phế quản mãn tính.
Vỏ Hông chữa đòn ngã tổn thương.
Hoa lá Hông dùng chữa mụn nhọt, độc, bỏng, xưng tấy. Hoa còn dùng chữa
viêm tuyến nước bọt, viêm kết mạc mắt mãn tính.
2.2.

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của
Công Nghệ Sinh Học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ
khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế
bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp
tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chính trong ống nghiệm.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái tế
bào thực vật ( khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách

có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật( từ dạng tế bào bất kỳ
nào trong cơ thể thực vật cũng đều có khả năng phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh trong các điều kiện thích hợp).
2.2.1. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Có thể tạm thời phân chia quá trình này phát triển qua bốn giai đoạn
- Giai đoạn khởi xướng ( 1898- 1930)
Đầu tiên từ những thí nghiệm của Haberlandt( 1898) khi ông đề xướng ra
tính toàn thể của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập nhưng không thành
công .
Tiếp sau có rất nhiều phòng thí nghiệm như Winknler ( 1902) Thielmanm (
1924) … Nhưng phải đến những năm 30 của thế kỉ 20 người ta mới đạt tiến bộ
thực sự về lĩnh vực này : công trình của các nhà khoa học như Schmucker(
1929) , Scheitteres( 1931) Pfeiffer ( 1931 ,1933 ) Larue ( 1933) thông báo về
nuôi cấy thành công đoạn đầu rễ riêng rẽ . Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo
10


các đoạn rễ này phát triển thành những rễ hoàn chỉnh . Đây là tién bộ đánh dấu
một giai đoạn phát triển mới .
- Giai đoạn nghiên cứu sinh lý ( 1930-1950)
Giai đoạn này được đánh dấu là sự thành công của White( 1934) nuôi cấy
được một dòng rễ cà chua sinh trưởng và phát triển liên tục và sau đó là sự
thành công của nhiều công trình khác của các nhà khoa học khác trên thế giới
như Gau theret , Nobecourt … và vào cuối thời kì này đã có những quan điểm
về sự phân hóa cơ quan rễ ,lá trong nuôi cấy mô của cây cà rốt và cây thuốc lá
lai .
Thành công quan trọng của thời kì này là đã xây dựng và sử dụng có kết
quả một số loại môi trường bán nhân tạo , đồng thời phát hiện được vai trò của
một số loại vitamin đảm bảo sự thành công đối với việc nuôi cấy cơ quan ( rễ )
và mô ( tượng tầng ) ở thực vật .

- Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái ( 1950 -1960 )
Đại diện cho giai đoạn này là : Miller , Skoog , Steward , Reinert…Giai
đoạn này bắt đầu là công trình nghiên cứu của Camus( 1949) , ông đã ghép chồi
lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy ra trong khối mô
nuôi cấy. Tiếp theo là công trình của Miller và Skoog ( 1956) tạo chồi thành
công từ mô thuốc lá nuôi cấy .
Trong giai đoạn này Skoog đã phát hiện ra kinetine là một chất điều khiển
quá trình phân bào ( thuộc nhóm cytokinin) và phân hóa mầm chồi. Năm 19581959 Steward và Reinert đã sử dụng nước dừa có chứa các chất thuộc nhóm
cytokinin vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từ nuôi cấy tế bào cà
rốt .
Sau đó là sự thành công của Muir( 1953)khi nuôi cấy tế bào đơn . Cho đến
năm 1960 Bergmenn đã phát triển kĩ thuật tế bào đơn lên một bước mới tạo
được khối mô sẹo từ tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa
thạch như trtải tế bào vi sinh vật .
- Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật
Ở giai đoạn này nhiều nhà khoa học đã đưa ra công trình những công trình
nghiên cứu thành công của mình trên các đối tượng khác nhau.
1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antirrinum majus nghiên cứu tính
biến động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến .
1960 Cocking tách được tế bào trần protoplast.
11


1964 Guha và Maheswari tạo được cây cà độc dược có bộ nhiễm sắc thể
đơn bội từ nuôi cấy bao phấn.
1967 Nitsch , và 1968 Nakata ,Tanaka tạo ra cây đơn bôi từ bao phấn thuốc
lá.
1968 Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo được cây lúa đơn
bội.
1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ potoplasts thuốc lá

giống Xanthi.
1977 Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào
sản xuất đại trà ở Nauy.
Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công
nghệ sinh học hiện đại mà còn là công cụ quan trọng trong chọn, tạo, nhân
giống… đóng góp cơ sở lý luận mới cho công nghệ sinh học hiện đại.
2.2.2. Cở sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tính toàn
năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902. Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh.
Ngày nay theo quan niệm sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là
mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần
thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mối tế bào đều
có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
- Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phôi sinh ban đầu hình thành
các tế bào mô chuyên hóa đảm nhân các chức năng khác nhau.
Tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào phân hóa( có chức
năng riêng biệt)

sơ đồ các giai đoạn phân hóa của tế bào
12

Sự phản phân hóa tế bào: khi tế bào đã phân chia thành tế bào có chức năng
chuyên hóa chúng vẫn không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong
những điều kiện nhất định cần thiết nếu chúng gặp điều kiện thích hợp chúng lại
có thể trở về tế bào dạng phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình này gọi là
sự phản phân hóa tế bào vì nó ngược lại với sự phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh

tế bào dãn

tế bào phân hóa

Phản phân hóa tế bào
Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Vậy kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
trên cơ sở tính toàn năng của tế bào.
Để điều khiển sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy người ta thường bổ
xung vào môi trường nuôi cấy 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và
xitokinin.
Tỉ lệ của 2 nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái
khác nhau.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô của tế bào thực vật
Ảnh hưởng của mẫu cấy
- Vị trí của mẫu cấy trên cây
Những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp trên cây phát triển trong môi

trường in vitro tốt hơn, chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách.
Mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc khác nhau từ những phần
khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
- Kích thước mẫu cấy
13


Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ.
Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng như củ, thân hành
thường dễ tái sinh trong môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ.
- Kiểu di truyền
Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây
một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh.
Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng hầu
như dễ tái sinh in vitro.
- Tuổi, sinh lý của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao.
Các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn, khi cây già đi khả năng tái sinh
của chúng cũng giảm.
Đôi khi sau nhiều lần cấy chuyển mẫu cấy già dần dần được trẻ hóa do tăng
khả năng tái sinh và phân chia tế bào.
- Tuổi của mô, cơ quan
Những mô còn non và mềm dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng còn có
nhiều trường hợp ngoại lê.
Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy lấy từ
cuống lá già do cơ quan của chúng già nên khả năng tái sinh không cao và phân
chia tế bào giảm.
- Tình trạng sinh lý
Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh

hơn trong giai đoạn sinh sản.
Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn chồi
của những cây vượt qua giai đoạn này.
- Vết thương
Sự tồn tại trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh cây.
Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu dinh dưỡng và các chất
điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn.
- Phương pháp cấy
14


Các mẫu cấy có thể đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau có cực
hoặc không có cực.
Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không cực.
Ảnh hưởng của môi trường
- Khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với
cây trồng trong điều kiện tự nhiên.
Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg…
- Khoáng vi lượng
Trước khi nuôi cấy mô mới ra đời người ta không nghĩ đến việc bổ sung
khoáng vi lượng vào trong môi trường.
Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I,
Mo…
- Cacbon và nguồn năng lượng
Hai dạng đường thường gặp nhất là Glucose và Sacrose.
Các nguồn Cacbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như
Lactose, Galactose, Maltose và tinh bột nhưng Cacbonhydrate này có hiệu quả
kém hơn so với Glucose và Sacrose.
- vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và
phát triển của chúng.
Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là
Thiamine( B1), Acid Nicotinic, Pyridoxin ( B6) và Myo- Inositol.
- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Có năm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật:
Auxin, Cytokinin, Gibberillin, Acid Abscisic và Ethylen.
Tỉ lệ Auxin/ Cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật
nuôi cấy.A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi.
- Auxin
Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự
tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô.
15


Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự
tăng trưởng của các sơ khởi này.
- Cytokinin
Kích thích tế bào phân chia( với điều kiện có auxin).
Cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và
phân bào.
Ảnh hưởng của môi trường
- Các chất hữu cơ không xác định
Bổ xung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy thường
mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô.
Các chất bổ xung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm
men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua…
- Nguồn cung cấp Nitrogen
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng
sự bổ xung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng

trưởng của tế bào.
Các nguồn Nito hữu cơ thường sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein
hydrolysate, L- glutamine, L- asparine và adenine.
- Than hoạt tính
Việc bổ xung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.
Ảnh hưởng của than hoạt tính: kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là
do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt
thời gian nuôi cấy.
- Yếu tố làm đặc môi trường
Agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn
trong nuôi cấy mô thực vật.
Agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar
được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường.
2.2.3. Các bước chính trong nhân giống in vitro
Theo Georger ( 1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các
bước:
16


Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ( các cây cho mẫu nuôi cấy): Các cây
cần có 1 số đặc điểm sau
- Sạch bệnh đặc biệt là các bệnh virus trong giai đoạn sinh trưởng mạnh.
- Các cây mẹ trồng trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc
và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu để cấy.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
- Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
- chú ý nếu lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây
thì sẽ đạt hiệu quả cao.
Bước 3: Nhân nhanh

- Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phôi vô tính.
- Trong bước này cần chú ý đến môi trường và các điều kiện ngoại cảnh để có
hiệu quả cao nhất.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
- Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi
trường tạo rễ.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
mạnh cần đảm bảo các yêu cầu sau .
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định.
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước…
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như
có chế độ dinh dưỡng thích hợp.
2.2.4. Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tính ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là việc sử dụng
các mô cấy có kích thước nhỏ, sự tương tác trong mô đơn giản, phân hóa dễ
dàng hơn và tái sinh nhanh hơn so với các phương pháp truyền thống.

17


Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để sản xuất cây giống
trên quy mô công nghiêp, có hệ số nhân cao và tạo ra các cá thể có kiêu gen
đồng nhất.
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn
giống.
Nhân nhanh các loài cây cảnh, loài hoa khó trồng bằng hạt.
Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.

Bảo quản tập đoàn gen.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mở ra một hướng đi mới cho các nhà Di
Truyền Học, Sinh Hóa Học, Sinh Lý Học, Vi Sinh Vật Học…
2.2.5. Phương pháp nhân đa chồi
Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngon được tách và nuôi cấy trên môi
trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của
cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn
để chồi bên phát triển.
Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ xung
cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi được chuyển
sang môi trường ra rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh.
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:
- Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi
tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử
dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao.
Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo
chồi bất định mang các đột biến.
- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắ bỏ chồi
ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động. Khi cấy
chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi.
- Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng rộng rãi
ở nhiều loài thực vât, quá trình nhân chồi thường thực hiện theo các bước:

18


Cây tự nhiên

Khử trùng
mẫu

Nhân đa chồi

Cây trồng
ngoài tự nhiên

Cây trồng
trong bầu

Tạo cây in vitro
hoàn chỉnh

Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong in vitro
2.2.6.Vai trò của các chất sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro
Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vât. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh
trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng
phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất kích thích
sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô.
Đặc tính của Auxin
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành
phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,
huyền phù tế bào, điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử
dụng với Cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Auxin trong môi trường nuôi
cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng
Auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Auxin ngoại sinh và
Auxin nội sinh.
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng, kéo dài tế bào. Cùng với
Cytokinin các nhóm Auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của

nhóm này có hoạt tính: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng( sáng, đất),
tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác động của Auxin
liện quan tối độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào
thực vật, Auxin thường được sử dụng để kích thích phân chia tế bào, phân hóa
rễ. Những Auxin thường dùng là : IBA( Indoly Butyric Acid), IAA( Indoly
Acetic Acid), NAA( α- Naptalen Acetic Acid), 2,4D( Dichlorphenoxy Acetic
Acid).

19


Đặc tính của Cytokinin
Cytokinin là dẫn xuất của Adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân
chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và tế
bào thực vật. Các Cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là
BAP( 6- Benzyl Amino Purin), Kinetin( N- ( 2- Furfurylamin)- 1- H- 6- amin),
zeatin( 6- ( 4- Hydroxy- 3 Metyl- Trans- 2 Butanylamin) Purin)
Hàm lượng sử dụng các loại Cytokinin dao động từ 0,1- 0,2 mg/l. Ở nồng độ
cao hơn, Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định,
đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy
Ngoài hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật người ta còn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua
đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy… GA 3 là loại Gibberellin được sử dụng
nhiều nhất.
2.2.7. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những
phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt là đối với cây trồng khó
nhân nhanh bằng phương pháp truyền thốn. Dưới đây là một số thành tựu đã đạt
được.

Trong nước
Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới
quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu từ
các cây Thông ( Taxus sps.) là loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư hiệu quả
như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm thuốc ( Lê Thị
Xuân, 1996).
Cây Màng tang ( Litsea verticillata) là một loại cây thân gỗ có chứa một số
hợp chất có khả năng kháng HIV (+) – demethoxyapiercelsin và verticillatol (
Hoang VD, Zhang HJ). Tác giả Lê Xuân Đắc và cộng sự đã thành công trong
việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang ( Litsea verticillata) được tìm thấy ở
vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ( Lê
Xuân Đắc).
Tác giả Nguyễn Thanh Tùng đã nhân giống in vitro thành công cây Sưa (
Dalbergia tonkinensis Prain), cây thân gỗ quý hiếm và có giá trị kinh tế cao vào
năm 2008. Năm 2009 tác giả này cũng thành công với đề tài “Nghiên cứu bảo
20


tồn in vitro một số loài lan rừng Việt Nam quý hiếm”, nhân được nhiều giống
lan như: Thanh đạm một hoa, Thủy tiên hường, Ngọc vạn sáp, Mỹ dung dạ
lan...( />Cây Ba kích là một cây dược liệu quý, có tác dụng bổ thận âm, bổ thận
dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp( Ning-Zhen Huang). Dịch chiết cồn
từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến
cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon.( Wei L) Ngày nay nhu cầu sử dụng
loài cây này làm dươc liệu đang gia tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Năm
2010, các tác giả Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã nghiên cứu và nhân giống
thành công giống cây quý này bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực
vật ( Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đà Nẵng – Số 5(40).2010, 191-196).
Thế giới
Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số

giống tre quý như Dendrocalamus asper ( tre mạnh tông), Bambusa multiplex (
cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên (Nandi).
Các tác giả Balaraju và cộng sự ( 2008) đã nhân giống và tái sinh in vitro
thành công cây thuốc Vitex agnus-castus ( Verbenaceae) bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,1
mg/l IBA. Cây thuốc Vitex agnus-castus cũng đang bị đe dọa nghiêm trọng (
Balaraju).
Năm 2008, các tác giả Nishritha, Sanjay cũng đã nhân giống in vitro thành
công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn. Cùng
năm đó, Mukherjee và RoyChowdhury cũng đã nhân giống in vitro loài Aloe
Vera sp. ( Mukherjee), ( Nishritha B..).
Bên cạnh đó, tác giả Park và cộng sự ( 2009) cũng đã tái sinh thành công
loài Rehmannia glutinosan L.Journal quý hiếm, đang bị khai thác quá mức
(Park SU)
Ngoài ra cũng còn nhiều loài cây quý khác cũng đã được nhân giống và bảo
tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn( Lythraceae),
Sausurea lappa C.B.Clarke… ( Arora), ( Rout R).
2.2.8. Bảo tồn thực vật bằng phương pháp nuôi cấy mô
Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật bị đe dọa có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều
giống cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ ban đầu như
21


chất lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, thì sử dụng kỹ
thuật nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen là hết sức cần
thiết. Bảo quản trong điều kiện in vitro được coi là giải pháp công nghệ có triển
vọng đối với cây trồng nhằm nhân giống vô tính và cây có hạt dễ mất khả năng
nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp.
Bảo tồn in situ
Đây là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất bao hàm các quần thể tái sinh nhân

tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ cây mẹ mà không áp dụng
có định hướng.
Điều này có ý nghĩa to lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các loài
cây có phân bố rải rác, như vậy quần tụ bảo tồn được dùng làm nguồn cung cấp
vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo.
Bảo tồn ex situ
Được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi
vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống ( Vườn thực vật),
rừng trồng với mục đích bảo tồn ( quần tụ bảo tồn ex situ, ngân hàng hạt giống,
phấn hoa hay nuôi cấy mô) ( Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2006).
Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ:
- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu
- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài
- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được ( Havens K)
Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loại cây trồng chủ yếu, các loài cây đó
biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên không được bảo vệ an
toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá hoại rừng của súc vật hoặc
con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể ngoại lai khác.

22


Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1.

Vật liệu nghiên cứu:
Nguyên liệu thực vật: Cây Hông có nguồn gốc từ Autralia do Viện Công

nghệ sinh học cung cấp.
Dụng cụ nghiên cứu: Nồi khử trùng, box cấy vô trùng, bình tam giác, pipet,

máy chuẩn pH, panh, dao, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ
sấy, hệ thống giàn đèn, máy khuấy từ…..
Hóa chất: Các loại hóa chất sử dụng trong việc nhân cây, môi trường MS
được sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa lượng và vi lượng theo Mura
shige và Skoog. Đường Saccharose, Agar, các chất kích thích sinh trưởng như
BAP, NAA, Kinetine, IBA…
Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt đô 25- 27oC và chế độ chiếu sáng 12h/12h với
cường độ chiếu sáng 2000lux.
3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu: Trại Thực nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ
sinh học ( Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Thời gian nghiên cứu: 6/2011 đến 6/2012
3.3.

Nội dung nghiên cứu

Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau
và có công thức đối chứng.
Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

23


Sơ đồ nhân giống Hông( pawlonia fortunei) bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bao thực vật
Đốt thân ngoài tự nhiên

khử trùng vào mẫu

môi trường MS/2. 4 tuần

Chồi con in vitro
tách chồi in vitro
môi trường MS/2 có bổ xung BAP( 5- 7 mg/l)
Cụm chồi
tách chồi in vitro

môi trường MS/2 có bổ xung NAA( 0,1- 0,2mg/l)

Cây con hoàn chỉnh
giá thể. Đất/ cám dừa: 4/1
Trồng cây ra đất

3.3.1. Khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu bao gồm các bước sau:
- Cắt cành cây Hông thành đoạn 6- 8cm.
- Rửa mẫu bằng nước xà phòng pha loãng.
- Rửa sạch nước xà phòng pha loãng dưới vòi nước.
- Rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng.
- Rửa trong cồn 700C( trong 15 giây).
- Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần.
24


- Khử trùng trong dung dịch 1% NaClO, lắc trong 10 phút.
- Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng.
- Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng.

Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS. Sau khoảng
30 ngày chồi non phát sinh in vitro, các chồi non này được sử dụng làm nguyên
liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30mg/l
đường saccharose + 8g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng với
nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8.
3.3.3. Tạo cây Hông( pawlonia fortunei) hoàn chỉnh
Giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra trồng
ngoài tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức
sống khi ra môi trường bên ngoài.
Các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay
vào đó lá chất kích thích sinh trưởng tạo ra rễ IAA, NAA,...
3.3.4. Trồng cây trồng bầu
Đây là giai đoạn quan trọng, ở giai đoạn này cây non cần thích nghi dần với
điều kiện bên ngoài ống nghiệm.
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2- 3 tuần trong thời gian này cây non
phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước những yếu tố bất lợi.
3.3.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu
Để đánh giá và tìm ra được môi trường thích hợp nhất, các chỉ tiêu được sử
dụng như sau:
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100
Số chồi TB/mẫu =
Tỷ lệ chồi ra rễ =x 100
Số rễ TB/chồi =
Tỷ lệ cây sống (%) = x 100
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm
25