BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên
1.

Giới thiệu.............................................................................................................................................. 2

2.

Tổng quan tài liệu................................................................................................................................ 2
2.1.

2.1.1.

Nhân giống in vitro .............................................................................................................. 2

2.1.2.

Nuôi cấy mô sẹo.................................................................................................................. 13

2.2.

3.

4.

5.

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ............................................................................................................. 2

Đối tượng thực vật nghiên cứu .................................................................................................15

2.2.1.

Hoa cát tường ..................................................................................................................... 15

2.2.2.

Cây đậu xanh ...................................................................................................................... 18

Vật liệu và phương pháp ..................................................................................................................19
3.1.

Vật liệu .......................................................................................................................................19

3.2.

Phương pháp tiến hành.............................................................................................................19

3.2.1.

Pha môi trường nuôi cấy ................................................................................................... 19

3.2.2.
thân

Kỹ thuật nhân giống in vitro hoa cát tường bằng phường pháp cấy cụm chồi/cắt đốt
26

3.2.3.

Kỹ thuật gieo hạt đậu xanh in vitro ................................................................................... 28

3.2.4.

Kỹ thuật tạo mô sẹo từ cây mầm đậu xanh ....................................................................... 29

3.2.5.

Kỹ thuật giải phẫu và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi ....................................... 31

Kết quả ...............................................................................................................................................32
4.1.

Nhân giống in vitro hoa cát tường ...........................................................................................32

4.2.

Gieo hạt đậu xanh in vitro ........................................................................................................35

4.3.

Tạo mô sẹo từ cây mầm đậu xanh............................................................................................39

4.4.

Giải phẫu và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi ...........................................................40

Thảo luận ...........................................................................................................................................43
5.1.

Lý giải kết quả thí nghiệm ........................................................................................................43

5.2.

Tại sao lại tạo sẹo?.....................................................................................................................44

5.3.

Tại sao tạo cụm chồi? ................................................................................................................44

5.4.

Lưu ý ..........................................................................................................................................45

6.

Kết luận ..............................................................................................................................................47

7.

Tài liệu tham khảo.............................................................................................................................48

Cao Ngọc Tân - 61002880

1


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

1. Giới thiệu

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan
trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào
thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực,
đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm.
Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng
phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống
cây trồng. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát
triển nền nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh trong thị trường
quốc tế.

2. Tổng quan tài liệu
2.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2.1.1. Nhân giống in vitro
 Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là
một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Bao gồm:
 Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
 Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
 Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
 Nuôi cấy mô sẹo (callus)
 Nuôi cấy tế bào đơn
 Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách
vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần.
 Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí
nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để
phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm
Cao Ngọc Tân - 61002880

2

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

(in vivo). Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết
cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một
thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích
đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được.
Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể
tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam
hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất
giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất
lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây
lâm nghiệp.
 Cơ sở khoa học:
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống
vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và
phản phân hoá.
 Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã
chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương
với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều
kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.
Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Qua đó người ta có thể
biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi
được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần
thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá.

Cao Ngọc Tân - 61002880

3


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào:
- Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành
các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau.
Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các
chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng
chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân
hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt.
- Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá
thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều
kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân
chia tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn
tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân
chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…
trước đó. Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã
chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau:
→
←
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại
một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt
hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình
đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn

chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong
những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có
khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm
nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.

Cao Ngọc Tân - 61002880

4


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Các ứng dụng:
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh
tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro
là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương
tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ
hiệu quả hơn. Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác
không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả
trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có
hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
 Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác
chọn tạo giống.
 Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của
các loại cây trống khác nhau.
- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
- Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống

cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
- Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặc các cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,
cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà
phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai,
dứa sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.

Cao Ngọc Tân - 61002880

5


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Các bước trong nhân giống in vitro:
 Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện
môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả
truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trưởng của mẫu cấy in vitro.
 Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc
vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu

cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh
chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân,
mảnh lá.
- Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử
trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương
pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích
hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1%

Cao Ngọc Tân - 61002880

6


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút,
hoặc H2O2, dung dịch Br…
- Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog
(1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…),

Gibberelin (GA3)
 Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng
nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định
thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ
sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành
nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống
nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh
thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16
giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành
phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên
với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh
súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai
đoạn đầu cần che tối…
 Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn

Cao Ngọc Tân - 61002880

7


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ
môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy
chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm

auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể
phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin
sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô
tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng
hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây
hoàn chỉnh.
 Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,
số rễ, chiều cao cây…).
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để
thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt
bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi…
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat
nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn
ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp.

Cao Ngọc Tân - 61002880

8


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Ưu/nhược điểm:
 Ưu điểm:
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng
cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng

0.1-10mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo
thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của
cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ
không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài.
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây
giống sạch virus.
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái
sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều
tiết sinh trưởng… theo ý muốn.
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một

Cao Ngọc Tân - 61002880

9


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36 1012 /năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác
lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại
cảnh của thời vụ.
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được
trong thời gian dài ở điều kiện in vitro.
 Nhược điểm:
- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước
nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.
- Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả

năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống
in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm
không khí thường bão hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây
thường bi mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy
trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện in vivo cần phải
trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có
độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.
- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.
- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống
 Tính bất định về mặt di truyền.
 Sự nhiễm mẫu
 Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy.
 Hiện tượng thuỷ tinh hoá

Cao Ngọc Tân - 61002880

10


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Phương pháp tạo cụm chồi
 Nguyên liệu
- Chồi ngọn, chồi bên.
 Nguyên tắc
- Sử dụng cytokinin hạn chế ưu tính ngọn, cảm ứng tạo cụm chồi.
 Các bước tiến hành
- Tạo cụm chồi từ chồi ban đầu.
- Tách cụm chồi + cấy chuyền.

- Cảm ứng tạo rễ.
- Chuyển cây con ra vườn ươm.
- Đặc điểm của quá trình hình thành cụm chồi :
 Cần sự phối hợp auxin (nồng độ thấp) với cytokinin (nồng độ cao).
 Loại bỏ chồi ngọn trong đa số trường hợp.
 Tốc độ tăng sinh.
 Ý nghĩa thực tế
- Phương pháp đơn giản.
- Tốc độ nhân giống cao.
- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền.
- Cây con tăng trưởng tốt.
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
- Kiểu di truyền.
- Tuổi sinh lý.
- Trạng thái tăng trưởng.
- Môi trường nuôi cấy.
- Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ)
- Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy,
những mô cấy còn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành.

Cao Ngọc Tân - 61002880

11


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

- Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxin với nồng
độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ Auxin/Cytokinin

thường 1/10.
- Đôi khi nên để chồi ngọn phát triền trước khi tang nồng độ Cytokinin để
cảm ứng sự tạo chồi bên.
- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ
ngọn của chồi để các chồi bên phát triển.
- Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao
vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.
- Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên bằng
cách cấy vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng này cần lắc hay không
lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm.
- Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi.
Trong phương pháp tạo cụm chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá
cấy vào môi trường có chứa Cytokinin với nồng độ cáo. Vai trò của Cytokinin
lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các
chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung Cytokinin để
tiếp tục tạo ra các chồi khác. Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường
ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh.
Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng cho
nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường xuyên được thực hiện theo các
bước:
Cây tự nhiên  Khử trùng mẫu  Nhân cụm chồi  Tạo cây in vitro hoàn
chỉnh  Trồng cây trong bầu  Trồng cây ngoài tự nhiên.

Cao Ngọc Tân - 61002880

12


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

2.1.2. Nuôi cấy mô sẹo
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là
nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế
bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi
soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…Mô sẹo là một khối tế bào
không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện
đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà sinh trưởng thực vật…).
 Sự hình thành mô sẹo
 Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa
trước lần phân chia đầu tiên. Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin
tác động) do 3 quá trình:
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao
gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn
STD dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần
auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này
được ưu tiên áp dụng ở ĐTD, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô
khó phản phân hoá so với STD Màu sắc của mô sẹo không giống nhau
trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau
và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
 Một số vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo:
- Sự biến tính tế bào do độ già của mẫu.
- Sự thay đổi tế bào chất của nhân.
- Thời gian duy trì.
- Điều kiện nuôi cấy.
- Thành phần môi trường, nhất là chất sinh trưởng.

Cao Ngọc Tân - 61002880

13


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Sự hình thành chồi từ mô sẹo
 Được điều khiển bằng:
- Các chất sinh trưởng đi vào môi trường
- Điều kiện nuôi cấy
- Dịch chiết
- Tỷ lệ cytokinin/auxin
 Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những
yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô
sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ
hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây.
 Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong
mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy,
việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng
đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy.
Với một số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây
chịu ảnh hưởng rất lớn.
 Quá trình hình thành chồi xảy ra qua 2 giai đoạn:
- Tái phân hóa  xảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hóa thành mô
sẹo.
- Hình thành các mầm mống cơ quan  sử dụng các phương pháp phù
hợp  tổng hợp DNA và protein xảy ra rất mạnh, hàm lượng đường
cũng tang  các mô sẹo  hình thành cấu trúc hình thái  tạo chồi.
 Tính bất định về mặt di truyền của Nuôi cấy mô sẹo

 Biến dị tế bào soma ( biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất và biến
dị này không di truyền).
 Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại.
 Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền.

Cao Ngọc Tân - 61002880

14


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo:
 Vi nhân giống: tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh  khử trùng  đưa vào
nuôi cấy ở môi trường phù hợp  chồi  chồi nhân lên  tách chồi 
chuyển sang môi trường mới và quy trình cứ thế được lặp lại.
 Cho hệ số nhân giống thấp hơn, nhưng các chồi nhân giữ lại được
những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền.

2.2. Đối tượng thực vật nghiên cứu
2.2.1. Hoa cát tường

 Vị trí phân loại
- Ngành: Magnoliophyta
- Lớp: Magnoliopsida
- Lớp phụ: Asteridae
- Bộ: Gentianales
- Họ: Gentianaceae
- Giống: Eustoma

- Tên khoa học: Eustoma grandiflorum
- Tên khác: Lisianthus, Prairie Gentian, Texas bluebell, Tulip Gentian,
Bluebell, Lire de san pedro.
Cao Ngọc Tân - 61002880

15


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Đặc điểm sinh trưởng
- Hoa cát tường là loài hoa dại có nguồn gốc từ Bắc mỹ. Là loài cây có khả
năng chịu rét tương đối trên đồng cỏ và được biết đến với nhiều màu sắc
khác nhau, có loại cánh đơn và cánh kép.
- Màu nguyên thủy là màu xanh, dần dần đã có sự xuất hiện đa dạng về
màu sắc như hồng, trắng, trắng pha tím, trắng pha hồng, ...
- Đây là loài hoa khá thanh lịch không chỉ được bán như các loại hoa cắt
cành mà còn được biết đến dưới dạng hoa chậu nghệ thuật.
- Hoa Cát tường phát triển tốt ở điều kiện 70 – 80 Klux (ánh sáng tự
nhiên). Do vậy vào mùa xuân hay mùa hè có cường độ ánh sáng cao nên
thường phải che lưới cho hoa. Hoa cát tường thích hợp với vụ dài ngày,
có số giờ chiếu sáng trong ngày tối ưu là 16 giờ trong ngày thì sẽ cho
chất lượng bông cao nhất.
- Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 –
20 độ C vào ban ngày và 15 – 18 độ C vào ban đêm. Nhiệt độ vào ban
đêm thấp hơn 15 độ C sẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây. Vào
ban ngày khi nhiệt độ cao hơn 28 độ C sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn
quá trình sinh trưởng của hoa và cho hoa kém chất lượng. Tùy theo từng
chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và quang chu kỳ khác nhau,

do vậy trước khi trồng nên tìm hiểu chủng loại giống mà bố trí mùa vụ
thích hợp.
- Độ ẩm khoảng 70% được xem là lý tưởng nhưng sau khi nụ đầu tiên
được hình thành thì việc giảm độ ẩm xuống dưới 70% sẽ làm gia tăng
chất lượng của hoa.
- Tính cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 –23 tuần.

Cao Ngọc Tân - 61002880

16


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Các chủng loại hoa Cát tường
 Giống hoa kép
- Nhóm Avilia: nhóm này thích hợp ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ
mát. Do vậy nhóm giống này thường trồng vào vụ đông. Các màu
thường là trắng ngà, viền xanh, hồng cánh sen, đỏ tía.
- Nhóm Balboa: nhóm này thích hợp nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao
hơn. Phug hợp trồng vụ xuân đến hè. Phát triển tốt ở điều kiện quang chu
kỳ ngày dài. Các màu thường là xanh, viền xanh, xanh tía.
- Nhóm Catalina: thích hợp với điều kiện ngày dài và thời tiết ấm áp. Các
màu thường là xanh tía và màu vàng.
- Nhóm Candy: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu
kỳ ngày ngắn. Nhóm này cho hoa nở đồng loạt và có nhiều màu để chọn
lựa.
- Nhóm Echo: Nhóm này là nhóm phổ biến trong giống hoa cát
tường.Không thích hợp với cường độ ánh sáng quá cao hay thấp, thích

hợp cho vụ đông xuân. Các màu phổ biến trong giống này là xanh bóng,
xanh tía, hồng, hồng tía, trắng tuyền.
- Nhóm Mariachi: Nhóm này thích hợp trồng trong chậu. Đặc điểm giống
này là có số cánh hoa nhiều, cánh hoa mỏng hơn các giống khác nên nhìn
rất đẹp. Các màu phổ biến trong giống này là trắng, hồng, hồng nhạt,
xanh…
 Giống hoa đơn
- Nhóm Flamenco: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang
chu kỳ ngày dài. Thân hoa dài và mạnh. Các màu là xanh bóng, hồng,
vàng, trắng.
- Nhóm Heidi: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu
kỳ ngày ngắn. Có nhiều màu để chọn lựa.

Cao Ngọc Tân - 61002880

17


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

- Nhóm Laguna: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang
chu kỳ ngày dài. Thân hoa dài khoảng 48 cm, một cây trung bình có 3
thân và 25 nụ hoa. Có 02 màu là xanh đậm và xanh tía.
- Nhóm Malibu: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và trong mùa
xuân và mùa thu. Có nhiều màu là hoa cà, xanh đậm, trắng, hồng, trắng
viền xanh.
- Nhóm Yodel: Thân hoa dài khoảng 45 – 50cm. Có nhiều màu là xanh
đậm, xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng.
2.2.2. Cây đậu xanh

 Phân loại:
- Ngành Magnoliophyta.
- Lớp Magnoliopsida.
- Bộ Fabales.
- Họ Fabaceae.
- Chi Vigna.
 Đặc điểm sinh trưởng
- Đậu xanh là cây ăn hạt, thân thảo, phân bố rộng rãi ở các nước Đông và
Nam Á, khu vực Đông Dương.
- Cây đậu xanh bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.
Cao Ngọc Tân - 61002880

18


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

- Cây đậu xanh (đỗ xanh) có danh pháp khoa học Vignaradiata, có kích
thước hạt nhỏ (đường kính khoảng 2 - 2,5 mm).
- Thời gian sinh trưởng của đậu xanh thay đổi tùy theo giống, mùa vụ và
biện pháp canh tác (tưới, phân bón …).Thông thường nếu trồng trong
mùa nắng cây sẽ bắt đầu cho thu hoạch từ 56 - 63 ngày và chấm dứt thu
hoạch 64 - 72 ngày. Trồng vào mùa mưa sẽ hái quả khi đạt 65 - 70 ngày
và chấm dứt vào 68 - 80 ngày.
- Thời gian sinh trưởng của đậu xanh có thể được chia làm 5 thời kỳ:
 Thời kỳ mọc mầm
 Thời kỳ cây non
 Thời kỳ tăng trưởng chậm

 Thời kỳ trổ hoa
 Thời kỳ phát triển
Thành phần của đậu xanh: ẩm 14g, protein 23g, lipid 2.4g, gluxit 53.1g,
xel luloza 2.4g, tro 2.4g, Ca 64mg, P 377mg, Fe 4.8mg, B1 30µg, B2
0.72mg, PP 0.15mg, C 2.4mg, β carotene 4mg.

3. Vật liệu và phương pháp
3.1. Vật liệu
- Đậu xanh : công ty Xuân Hồng
- Hoa Cát Tường: PTN CNSH, bộ môn CNSH, đại học Bách Khoa
TPHCM.

3.2. Phương pháp tiến hành
3.2.1. Pha môi trường nuôi cấy
 Chuẩn bị dung dịch mẹ
Do môi trường nuôi cấy mô thực vật rất phức tạp với nhiều chất hiện diện với
hàm lượng rất nhỏ nên để thuận tiện cho việc pha môi trường nuôi cấy, người ta
Cao Ngọc Tân - 61002880

19


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước nhiều loại
dung dịch đậm đặc, khi cần sử dụng chỉ việc pha với nước cất theo tỉ lệ là có thể
sử dụng.
Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock), dung dịch mẹ được bảo quản
dài ngày trong tủ lạnh. Thông thường pha các dung dịch mẹ là: stock đa lượng,

stock trung lượng, stock vi lượng, Fe-EDTA, stock vitamin, chất điều hòa sinh
trưởng.
 Khoáng đa lượng
- Cân và dùng nước cất hoà tan lần lượt từng chất trong bécher cho tan
hoàn toàn.
- Pha đúng thự tự → dung dịch không tạo tủa.
- Pha đậm đặc 20 lần.
Thành phần

Nồng độ (mg/l)

NH4NO3

1650,00

KNO3

1900,00

CaCl2.2H2O

440,00

MgSO4.7H2O

370,00

KH2PO4

170,00

 Khoáng trung lượng
- Pha đậm đặc 100 lần

Cao Ngọc Tân - 61002880

Thành phần

Nồng độ (mg/l)

Na2EDTA

37,30

FeSO4.7H2O

27,80

20


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Khoáng vi lượng
- Pha đậm đặc 1000 lần
Thành phần

Nồng độ (mg/l)

MnSO4.4H2O

23,30

ZnSO4.7H2O

8,60

H3BO3

6,20

KI

0,83

Na2MoO4.2H2O

0,25

CuSO4.5H2O

0,025

CoCl2.6H2O

0,025

 Chất hữu cơ
- Pha đậm đặc 100 lần

Thành phần

Nồng độ (mg/l)

Myo-inositol

100

 Vitamin và amino acid
- Pha đậm đặc 1000 lần
Thành phần

Nồng độ (mg/l)

Pirydoxine (B6)

0.5

Biotin (H)

0.01

Nicotinic acid (P.P)

0.5

Thiamin – HCl (B1)

0.1

Pantotate – Ca

1

Glycin (amino acid)

2

Cao Ngọc Tân - 61002880

21


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Pha môi trường:
 Pha môi trường nhân giống hoa cát tường
- Yêu cầu:
Mỗi nhóm (3 người) chuẩn bị 15 chai, 20ml/chai. Cần pha 300ml môi
trường.
- Dụng cụ:
 Becher (100ml, 250ml, 500ml, 900ml)
 Ống đong
 Pipet (1ml, 2ml, 5ml, pipetman)
 Bóp cao su
 Đũa thủy tinh
 Bình tia
 Máy điều chỉnh pH
 Bếp đun

 Nồi hấp khử trùng

Cao Ngọc Tân - 61002880

22


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

- Thành phần môi trường:
Thành phần cơ bản môi trường MS (300ml)
Khoáng đa lượng

15ml

Khoáng trung lượng

3ml

Khoáng vi lượng

0.3ml

Chất hữu cơ

3ml

Vitamin và amino acid

0.3ml

Thành phần bổ sung
Saccharose

9g

Agar

1.95g

BA

0.6ml

pH môi trường

5,8 ± 0,01

Hấp tiệt trùng

1210C, 1atm, 15p

- Các bước tiến hành:
 Lấy khoảng 180 ml nước cất cho vào cốc 500ml.
 Cho lần lượt các dung dịch mẹ đa pha sẵn vào theo đúng thứ tự:
khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, inositol, trung lượng với
lượng như trong bảng → khuấy đều.
 Cân đủ saccharose, khuấy đều cho đường tan hết.
 Sau đó cho thêm 0.6ml dd BA.

 Định mức bằng ống đong 300ml dung dịch.
 Chỉnh pH khoảng 5.8 ± 0.01 bằng máy hiệu chỉnh pH. Cho thêm một
ít nước cất vào.
 Cân agar cho vào dung dịch, vừa đun sôi vừa khuấy đều đến tan hết.
 Rót dung dịch vào các chai đã được rửa kỹ bằng xà phòng, mỗi chai
khoảng 20ml.
Cao Ngọc Tân - 61002880

23


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Đánh dấu, ghi tên lên các chai. Làm nút bông, bao gói cho từng chai.
 Đem hấp khử trùng ở điều kiện 1 atm, 1210C, trong 15 phút.
 Quy trình làm nút bông, bao gói:
 Lấy một lượng bông gòn vừa đủ, dùng miếng gạc nhỏ gói lại thành
hình cầu, sao cho gắn vừa khít miệng chai mà không quá rộng (nút sẽ
bị lọt vào trong chai) hay quá chật ( cây khó trao đổi khí), khi dùng
tay giật nút bông ra thì ta nghe tiếng “póc” nhỏ là được.
 Dùng tờ giấy úp lên chai đã gắn nút bông, gấp nếp 2 đầu tờ giấy và ép
sát vào thành chai, sau đó dùng thun cột lại.
 Dùng tờ giấy gói petri lại.
 Hấp khử trùng toàn bộ các chai môi trường + petri đã bao gói.
 Pha môi trường gieo hạt đậu xanh và môi trường tạo mô sẹo từ cây mầm
đậu xanh
- Mỗi nhóm (3 người) pha 30 chai. Cần pha 600ml môi trường.
- Giống như pha môi trường nhân giống hoa cát tường, chỉ khác lượng
saccharose và agar và có bổ sung 2,4-D (môi trường tạo mô sẹo)

Thành phần cơ bản môi trường MS (600ml)
Khoáng đa lượng

30ml

Khoáng trung lượng

6ml

Khoáng vi lượng

0.6ml

Chất hữu cơ

6ml

Vitamin và amino acid

0.6ml

Điều kiện môi trường
pH môi trường

5,8 ± 0,01

Hấp tiệt trùng

1210C, 1atm, 15p

Cao Ngọc Tân - 61002880

24


BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên

 Môi trường gieo hạt đậu xanh
Thành phần bổ sung
Saccharose

6g

Agar

1.8g

 Môi trường tạo mô sẹo từ mầm cây đậu xanh
Thành phần bổ sung
Saccharose

9g

Agar

1.95g

2,4-D (dd 1mg/ml)

0.45ml

- Tiến hành:
 Pha chung cả 2 môi trường (600ml), sau khi thêm các thành phần đa
lượng, trung lượng, vi lượng, chất hữu cơ, vitamin và amino acid vào
rồi thì đem định mức đến 600ml, sau đó chia dung dịch ra thành phần
2 phần ở 2 becher, mỗi becher 300ml dd. Đánh dấu lên becher 1 dd
gieo hạt, 1 dd tạo sẹo.
 Đối với dd gieo hạt, ta thêm lượng saccharose như bảng, khuấy đều và
điều chỉnh pH đên 5,8 ± 0,01. Cho thêm một ít nước cất. Sau đó cân
lượng agar theo bảng và cho vào dd, đun kèm khuấy liên tục đến khi
agar tan hết là được.
 Đối với dd tạo sẹo, ta bổ sung 2,4-D và thêm saccharose, sau đó làm
giống như dd gieo hạt (với lượng agar là ).
 Hai môi trường này cũng được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C,
1atm, 15p.

Cao Ngọc Tân - 61002880

25