chuẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Nhóm thực hiện: Nhóm 2

MỤC LỤC
I. Đặt vấn đề
II. Tổng quan
1. Virus dịch tả heo
2. Cơ chế gây bệnh của virus dịch tả heo
3. Bệnh dịch tả heo
4. Chẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào
1


a. Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào
i. Dòng tế bào thận heo PK15
ii. Môi trường nuôi cấy tế bào
iii.Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15
iv.Nuôi cấy không cần ly tâm
v. Thuốc thử
b. Phân lập virus dịch tả heo
i. Nguyên tắc kiểm tra
ii. Phương pháp nuôi cấy đế phân lập virus
iii.Sự chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị cơ quan
Chuẩn bị bạch cầu

c. Phương thức kiểm tra
i. Sự sàn lọc
ii. Phân lập virus qua hai lần
iii.Nguyên liệu
d. Miễn dịch đánh dấu để phát hiện virus CFS trong nuôi cấy tế bào
i. Cố định tế bào
ii. Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase
iii.Đánh dấu với thuốc nhuộm FITC
iv.Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT
v. Nguyên liệu
III. Kết luận

I. Đặt vấn đề
Bệnh dịch tà heo (Classical swine fever) là bệnh truyền nhiễm lây lan
nhanh ở heo, được nhận diện lần đầu vào năm 1833 ở Ohio. Virus gây bệnh dịch
tả heo ( DTH) là virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bên ngoài, và được
xếp vào giống Pestivirus, trong họ Flaviviridae (Wengler, 1995).
2


Cho đến nay, DTH vẫn là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế
nghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi heo ở các quốc gia trên khắp thế giới cũng
như ở Việt Nam. Xét về mặt kinh tế, bệnh DTH gây thiệt hại lớn là do: (1) tỷ lệ
bệnh và tỷ lệ chết cao trong những đàn nhạy cảm và virus có độc lực cao, (2) heo
mắc bệnh không chết thì còi cọc chậm lớn, (3) tổn phí do tiêm phòng cao (nếu heo
không được tiêm phòng thì khả năng heo mắc bệnh rất cao), (4) quan trọng hơn cả
là sẽ không xuất khẩu được thịt heo nếu đàn heo trong nước có bệnh DTH.
Xét về mặt lâm sàng, hiện nay bệnh DTH biểu hiện dưới nhiều thể khác
nhau như cấp tính, bán cấp tính, mãn tính và không điển hình (atypical) hay không
biểu hiện rõ (inapparent), trong đó thể mãn tính lại là thể phổ biến ở Việt Nam

hiện nay (Nguyễn Tiến Dũng, 2002). Do đó, việc chẩn đoán bệnh DTH là cần thiết
để kịp thời điều trị.
Những kỹ thuật được áp dụng để phát hiện virus DTH trong các mẫu nghi
ngờ DTH là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR và
phân lập virus trên tế bào nuôi cấy. Trong đó, phân lập virus trên tế bào nuôi
cấyđược xem là phương pháp vàng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm. Phân
lập virus thường có độ nhạy cao hơn các phương pháp xét nghiệm kháng nguyên
virus.

II. Tổng quan
1. Virus dịch tả heo
Virus DTH là virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bên
ngoài, kích thước tương đối nhỏ với đường kính khoảng 40 – 50 nm. Virus DTH
được xếp vào giống Pestivirus, họ Flaviviridae (Wengler và ctv, 1995).
Virus DTH được chia thành các nhóm kháng nguyên sau:
3


Nhóm 1.1: gồm các chủng virus vaccine, phân lập virus ở
Anh, Mỹ năm 1940 – 1950; Nhật năm 1960; Tây Âu ở giữa năm 1920 và ở năm
1970; Brazil và Nam Triều Tiên năm 1980; Ukraine, Croatia, Mexico và Thái lan
năm 1990; Trung Quốc.
Nhóm 1.2: gồm các chủng virus vaccine, phân lập virus ở
Tây Âu năm 1940, Malaysia và Mỹ năm 1960; Cuba và ukraine năm 1990; Úc.
Nhóm1.3: gồm các virus phân lập ở malaysia năm 1980; Thái Lan năm 1980 và
1990; Honduras năm 1990.
Nhóm 2.1: các virus phân lập ở malaysia năm 1980; Tây
Âu năm 1980 và 1990; Đông Âu năm 1990.
Nhóm 2.2: gồm các virus phân lập ở Singapore năm 1980;
Tây Âu năm 1980 và 1990; Thái Lan năm 1990.

Nhóm 2.3: các virus phân lập ở Nhật năm 1970; Tây Âu
năm 1980 và 1990; Đông Âu năm 1990; Nga.
Nhóm 3.1: chỉ có dòng Congenital Tremor phân lập ở Anh
năm 1960.
Nhóm 3.2: gồm các virus phân lập ở Nam Triều Tiên năm
1980 và 1990.
Nhóm 3.3: gồm các virus phân lập ở Thái Lan năm 1990.
Nhóm 3.4: các virus phân lập ở Nhật năm 1970; Đài Loan
năm 1990.

4


2. Cơ chế gây bệnh của virus DTH
Trong điều kiện tự nhiên, virus xâm nhập vào vật chủ chủ yếu
thông qua con đường miệng mũi, đôi khi qua kết mạc, niêm mạc đường sinh dục
hoặc vùng da bị trầy xước. Bảy giờ sau khi xâm nhập, vị trí đầu tiên virus tái sản
là tế bào thượng bì trong hạch hạnh nhân. Sau sự tái sản ban đầu, mười sáu giờ sau
virus theo hệ thống mạch bạch huyết xâm nhập vào các hạch bạch huyết, ở đây nó
tiếp tục tái sản và đi vào hệ thống mạch máu ngoại vi gây nhiễm virus huyết lần
thứ nhất. Theo hệ thống tuần hoàn, một lượng lớn virus được nhân lên ở mô bào
đích thứ hai là lách, tuỷ xương, hạch bạch huyết nội tạng và đường tiêu hoá, các
bạch cầu lưu hành và các tế bào đơn nhân. Đồng thời với sự sinh sản, virus phá
huỷ những tế bào nội mạc mao mạch (máu, bạch huyết), những mảnh vỡ sẽ tụ lại
thành vật gây tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết và hoại tử ở ruột…
nhiễm virus huyết lần hai xảy ra vào ngày thứ 5 – 6 và đạt tối đa vào ngày thứ bảy
sau khi cảm nhiễm (Trần Thanh Phong, 1996). Như vậy, virus DTH có độc lực ở
khắp các tổ chức, biểu mô sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ 5 – 6 ngày.

5

3. Bệnh dịch tả heo
a. Dấu hiệu lâm sàng bệnh dịch tả heo
Tuỳ thuộc vào tuổi gia súc và độc lực của virus mà có nhiều thể
lâm sàng khác nhau:
- Thể bệnh DTH điển hình gồm có quá cấp tính, cấp tính, mãn tính (thể mãn
tính là thế có thời gian biểu hiện triệu chứng lâm sàng kéo dài trên một tháng) và
những triệu chứng thông thường hay gặp:

6


+ Heo bồn chồn, thường nằm một góc chuồng, khi nằm rên nhẹ hoặc
nghiến răng.
+ Sốt cao (41- 42oC), chán ăn, lông xù, run rẩy.
+ Thấy xuất huyết từng đám ở da, lấm chấm ở bụng.
+ Lúc đầu heo bị bón, sau chuyển sang tiêu chảy.
+ Viêm kết mạc mắt, mắt đỏ, có ghèn.
+ Giảm bạch cầu huyết.
- Thể bệnh không điển hình có hai dạng:
+ Thứ nhất: sẩy thai, thai chết, thai dị dạng, heo con sinh ra chết sớm…
+ Thứ hai: heo con mang trùng và phát bệnh vào khoảng 1 – 2 tháng tuổi.
b. Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả heo
- Xuất huyết ở hạch hạnh nhân, loét cuống lưỡi hay hạch hạnh nhân.
- Nhồi huyết ở rìa lách.
- Xuất huyết ngoài da, ở phủ tạng, thận, bàng quang.
- Các hạch ruột bị xuất huyết.

7

- Loét hình cúc áo ở van hồi manh tràng.

8


4. Chẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào
a. Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào
i. Dòng tế bào thận heo PK15
Dòng tế bào PK15 thì phù hợp cho tất cả các phương pháp
kiểm tra để chuẩn đoán CSF e.g. phân lập virus, tái tạo virus, kiểm tra trung hoà.
Dòng tế bào có thể được lấy từ các CRL. Nó được thành
lập bởi tạo dòng tế bào đơn. Các tế bào được cung cấp tự do từ Mycoplasma, virus
BVD, những pestivirus khác và kháng thể BVD.
ii. Môi trường nuôi cấy tế bào
• EMEM với FCS 5%
• EMEM với FCS 10%
• Môi trường EDulb với FCS 5%
• Kháng

sinh

vi

khuẩn

và

kháng

nấm

(Penicillin/Streptomycin, Fungizone,…).
• Huyết thanh thai bê
iii. Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15
9


Sự nhân của các tế bào PK15 được giữ trong những bình
nuôi cấy 75cm2 (250 ml) với 20ml môi trường nuôi cấy tế bào. Hai tuần là lý
tưởng, nhưng một tuần là đủ.
 Lấy đi môi trường và rửa với PBS/Versene.
 Ủ 10phút ở 37oC với PBS/V
 Thêm 0.1ml Trypsin hoà tan 1%
 Ủ 10 – 20phút ở 37oC cho đến khi các tế bào được lấy đi từ đĩa
 Thêm môi trường với FCS để ngăn chặn phản ứng trypsin
 Ly tâm dịch huyền phù tế bào và loại bỏ nổi trên mặt
 Tái lơ lửng viên kết trong 10ml môi trường hoặc thể tích thích hợp khác.
iv. Nuôi cấy không cần ly tâm
Để tránh tế bào bị tổn hại do ly tâm và bỏ qua những
bước tiêu tốn thời gian, phương pháp này thì cũng hữu dụng.
 Lấy đi môi trường từ một bình nuôi cấy 250ml
 Rửa đơn lớp với 5ml ATV hoà tan khoảng 30giây
 Lấy đi ATV và thay thế với 2ml ATV mới
 Ủ ở 37oC trong 15phút cho đến khi các tế bào được tách ra
 Thêm 8ml môi trường nuôi cấy chứa 5% FCS để có được một thể tích tổng
cộng là 10ml.
v. Thuốc thử
PBSV:

 NaCl:

8,0 g/l

 KCl :

0,2 g/l

 Na2HPO4 x 12 H2O:

2,37 g/l

 KH2PO4:

0,2 g/l

 Versene:

0,2 g/l

10


ATV:
 NaCl:

8,0 g/l

 KCl:

0,4 g/l

 Dextrose:

1,0 g/l

 Na HCO3:

0,58 g/l

 Versene:

0,2 g/l

 Trypsin:

0,5 g/l

 Antibiotics if considered necessary

b. Phân lập virus dịch tả heo
i. Nguyên tắc kiểm tra
Mẫu cơ quan hoặc bạch cầu được nuôi trên những tế
bào virus CFS nhạy cảm để cho phép gắn và nhân lên của virus. Từ sự tăng trưởng
của virus không gây ra một cytopathic có hiệu lực, sự hiện diện của nó phải được
chứng minh bằng một phương pháp immunostaining. Các tế bào thì được cố định
và kháng nguyên virus thì được phát hiện với peroxidase hoặc fluorecein.
ii. Phương pháp nuôi cấy tế bào để phân lập virus
Nuôi cấy tế bào của những tế bào PK15 thì sau 24giờ
và nên tiêm confluent 50 – 80% vào các mẫu xét nghiệm.

iii. Sự chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị cơ quan
Thích hợp cho các mẫu cơ quan như lách, thận, mô bạch
huyết hoặc hồi tràng. Mẫu nên được giữ lạnh và xử lý càng sớm càng tốt.
 Mẫu cơ quan 1cm3 được nghiền trong một cối xay với 9ml môi trường

nuôi cấy tế bào có chứa kháng sinh hoà. Những mẫu có kích thước nhỏ
11


hơn có thể được nghiền với môi trường ít hơn để không loãng virus. Cát
khử trùng có thể được thêm vào để tạo điều kiện cho sự đồng nhất.
Ngoài ra, máy đồng nhất có thể được sử dụng.
Ưu điểm là mô được đồng nhất trong một hệ thống kín, nhưng nhiệt độ cao sẽ
đốt nóng mẫu có thể ảnh hưởng đến virus.
 Sự chuẩn bị ở nhiệt độ phòng trong 1giờ
 Ly tâm 15phút, 2500vòng
 Nổi tầng mặt thì được sử dụng để tiêm trong nuôi cấy tế bào. Sự pha
loãng 1 : 10 và 1 : 100 có thể được xử lý song song, trong trường hợp
hiệu ứng độc tế bào. Sự khử trùng có thể được thực hiện nếu được coi
cần thiết.
Chuẩn bị bạch cầu ( leukocyte)
 Mẫu máu được kháng đông bởi EDTA
 Hoà tan 0.5ml Dextran vào 10ml máu có EDTA và để
ở nhiệt độ phòng 1giờ.
 Nổi tầng mặt có chứa bạch cầu thì được thu thập và ly
tâm tại 500vòng
 Viên kết được tái lơ lửng trong 5ml PBSM, ly tâm
 Viên kết được tái lơ lửng trong 2ml PBSM để tiếp tục
sử dụng hoặc lưu trữ

 Trong trường hợp dịch huyền phù bạch cầu được tiêm
đồng thời với những tế bào nhạy cảm nên được đông
lạnh trong thời gian ngắn để tan bạch cầu và tránh hiệu
lực độc tế bào.

12


 Mẫu máu được kháng đông bởi Heparin
 Hoà tan 20ml NH4Cl (0.84%) với 10ml mẫu máu có
Heparin ( 2 : 1) và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 –
30phút. Kích thước mẫu nhỏ thì thể tích NH 4Cl được
điều chỉnh cho phù hợp ( 2 : 1)
 Dịch hoà tan được ly tâm ở 1000vòng
 Viên kết được tái lơ lửng trong 5ml PBSM, ly tâm
 Viên kết được tái lơ lửng trong 2ml PBSM để tiếp tục
sử dụng hoặc lưu trữ
 Trong trường hợp dịch huyền phù bạch cầu được tiêm
đồng thời với những tế bào nhạy cảm nên được đông
lạnh trong thời gian ngắn để tan bạch cầu và tránh hiệu
lực độc tế bào.
 Mẫu huyết tương
 10ml máu đã được kháng đông bởi EDTA hoặc
Heparin phải được đóng băng và làm tan để tiêu diệt
các bạch cầu. Sau khi làm tan huyết tương được tiêm
trực tiếp vào nuôi cấy tế bào.
c. Phương thức kiểm tra
i. Sự sàn lọc (Screening)
 Tiêm 200 – 300ul mẫu (cơ quan hoặc bạch cầu) trên
môi trường nuôi cấy tế bào có chứa confluent 50 –

80% trong đĩa hoặc ống Leighton, đủ để trải lớp đơn.
Nên nuôi cấy hai bản của mỗi mẫu.
 Ủ ở 37oC trong 1 – 2h
13


 Rửa một lần với PBSM và trải với môi trường mới
 Ủ lên đến 72h ở 37oC trong tủ CO2.
 Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới và
hiệu lực độc tế bào không xảy ra
 Đối chứng dương và âm phải được xử lý theo cùng
một cách
 Tế bào được cố định và được nhuộm màu

ii. Phân lập virus qua hai lần
 Tiêm 200 – 300ul mẫu (cơ quan hoặc bạch cầu) trên
ống môi trường nuôi cấy tế bào. Luôn luôn nuôi cấy
hai bản của mỗi mẫu
 Ủ ở 37oC trong 1 – 2h
 Tế bào được rửa hai lần với PBSM và tiếp tục nuôi ít
nhất 72h ở 37oC. EMEM với FCS 10% là môi trường
lý tưởng cho phát triển virus.
 Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới và
hiệu lực độc tế bào không xảy ra
 Ống nuôi cấy tế bào được đông lạnh ở -80oC ít nhất 1h
 Ống nuôi cấy được rả đông và được ly tâm 2500vòng
 Lấy 200 – 300ul dịch nổi và ủ khoảng 1 – 2h
 Thêm môi trường nuôi cấy vào giếng cho đầy và ủ 72h
 Đối chứng dương và âm phải được xử lý theo cùng
một cách

14


 Tế bào được cố định và được nhuộm màu
iii. Nguyên liệu
Dextran solution 5%:


Dextransulphat-Na, MW 500.000:

5g



EDTA-Solution 1.5%:

100 ml

PBSM :


NaCl:

8,0 g



KCl:

0,2 g



Na2HPO4:

2,37 g



Dextrose:

1,0 g



Phenolred:

0,016 g



Aqua bidest:

ad 1000 ml

Dung dịch kháng sinh
 Penicilline/Streptomycin:
 Na-Benzylpenicilline 107 I.U.
 Streptomycinsulphate:

10 g

 PBS:

100 ml

 Glutamine based antibiotic cocktail:

15


 Streptomycinsulfate 11,25 g dissolved in 390
ml Aqua dest.
 Na-Benzylpenicilline 9 x 106 I.U. dissolved in
90 ml Aqua dest.
 L-Glutamine 26,28 g dissolved in 420 ml Aqua
dest.
 Mix and filter the three solutions.
 Fungizone 9 x 105 I.U. dissolved in 100 ml
Aqua dest.
 Add to the above filtrate and store at –20°C in
10 ml aliquotes until use.
 Application: 10 ml in 1 liter medium
d. Miễn dịch đánh dấu đế phát hiện virus CFS trong nuôi cấy
tế bào
Nói chung CSF không gây ra hiệu ứng cytopathic. Do đó,
những tế bào gây đôc CSF phải được ghi dấu miễn dịch để phát hiện các kháng
nguyên virus trong tế bào chất của tế bào.
i. Cố định tế bào
Việc cố định sẽ phụ thuộc vào việc môi trường nuôi

cấy phát triển trên bề mặt thuỷ tinh hay nhựa.
Đối với môi trường phát triển trên bề mặt thuỷ tinh,
cố định trong aceton 100% khoảng 5phút
Trong trường hợp bề mặt nhựa thì sử dụng
những phương pháp định hình khác nhau:

16


 Chuyển môi trường nuôi cấy hoàn toàn và ủ ở
70 – 80oC khoảng 2 – 3h hoặc
 Thêm vào mỗi giếng 100ul dung dịch
aceton/methanol ( 1:1) và để 10phút ở nhiệt độ
phòng hoặc
 Ổn định trong aceton 20% khoảng 10phút. Sấy
khô dưới một đèn bàn ở 25 – 30oC khoảng 4h.

ii. Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase
Đánh dấu trực tiếp
 Rửa đĩa một lần trong PBS – Tween
 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng PBS –
Tween. Đĩa 24 giếng thì thêm 200ul/giếng, đĩa 96
giếng thì thêm 50ul/ giếng.
 Ủ 1h ở 37oC trong một phòng ẩm
 Rửa đĩa 3lần với PBS –Tween và một lần với Aqua
dest
 Thêm vào mỗi giếng 200 hay 50ul dung dịch
chromogen-substrate và nhuộm khoảng 15 – 30phút ở
nhiệt độ phòng
 Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate và rửa với 1/3

PBS/H2O

17


 Làm đầy giếng với Aqua dest, và đọc kết quả bằng
low-power microscopy.Tế bào chất của các tế bào
nhiễm bệnh có màu đỏ sẫm.
Đánh dấu gián tiếp
 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng huyết thanh
đặc hiệu hoặc dịch nổi tế bào lai đơn dòng thích hợp
có chứa pestivirus và ủ khoảng 1h ở 37 oC. Đĩa 24
giếng thì thêm 200ul/ giếng, đĩa 96 giếng thì thêm
50ul/ giếng.
 Rửa 3 lần với PBS – Tween và 1 lần với Aqua dest
 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng PBS –
Tween có chứa peroxidase công nghiệp và ủ khoảng
1h ở 37oC
 Rửa 3 lần với PBS – Tween và 1 lần với Aqua dest
 Ủ với kháng thể thứ hai, nếu yêu cầu bởi nhà sản xuất
 Thêm vào mỗi giếng 200 hay 50ul dung dịch
chromogen-substrate và nhuộm khoảng 15 – 30phút ở
nhiệt độ phòng
 Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate và rửa với 1/3
PBS/H2O
 Làm đầy giếng với Aqua dest và đọc kết quả bằng
low-power microscopy.Tế bào chất của các tế bào
nhiễm bệnh có màu đỏ sẫm

18

19


Immune labelling using peroxidase

iii. Đánh dấu với thuốc nhuộm FITC
20


 Rửa lamme, đĩa hoặc lame một lần với washing
buffer.
 Nếu cần thiết, có thể pha loãng kháng thể kết
hợp FITC trong washing buffer và lọc qua một
bộ lọc để loại bỏ tinh thể FITC
 Phủ những tế bào cố định với FITC kết hợp
trong washing buffer và ủ khoảng 30 – 60phút ở
37oC trong một phòng ẩm. Những tế bào cần
được che phủ hoàn toàn với sự kết hợp. Một vài
sự kết hợp không tương thích với tủ CO2
 Rửa trong washing buffer 3 lần khoảng 5phút
 Rửa một lần trong destilled water
 Đặt một giọt mounting buffer lên trên tế bào.
Nếu cần thiết sử dụng lamme để phủ tế bào
 Kiểm tra huỳnh quang tế bào chất bằng UV
microscopy.

21

iv. Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT


Cắt ra một mảnh mô để sử dụng, 1 x 1 x 0.5cm
và gắn nó với hợp chất cryo-embedding hoặc
distilled water vào một khối gắn kết cryostat.



Ổn định mẫu lên trên khối cryostat. Nhiệt độ ổn
định là -15 – 20oC. Shock-freezing trong nHeptan được làm mát với Nitơ lỏng



Cắt phần mẫu thành những mảnh có độ dày tối
đa 5um và gắn chúng lên trên lam kính hiển vi
đã được làm sạch với cồn. Chuẩn bị một số lam
với những phần của cùng một mô



Làm khô phần gắn kết ở nhiệt độ phòng khoảng
20phút
22




Ổn định phần gắn kết trong aceton khoảng

10phút ở -20oC



Ngâm trong washing buffer một thời gian ngắn,
loại bỏ chất lỏng thừa bằng khăn giấy và đặt
chúng trong một khung trong một buồng tối ẩm



Loại bỏ sự kiểm soát cố định hoàn toàn từ ổn
định sâu ( -70oC)



Phân phối FITC kết hợp (FITC-conjugate) ở độ
pha loãng thích hợp trong washing buffer lên
trên toàn bộ mẫu, ủ trong bóng tối khoảng
30phút ở 37oC



Kiểm tra, dung dịch kết hợp không bay hơi và
sấy khô các mô



Rửa mẫu 3 lần với washing buffer ở nhiệt độ
phòng trong 10phút



Ngâm mẫu một thời gian ngắn trong distilled
water.



Nếu cần thiết, counterstain in evansblue khoảng
30 giây



Cẩn thận loại bỏ chất lỏng thừa bằng khăn giấy
và đặt lamme với mounting buffer lên trên mẫu



Kiểm

tra

huỳnh quang mẫu bằng UV

microscopy.

23


Demonstration of viral antigen in cryostat sections
(Direct Fluorescent Antibody Test - FAT)

24


v. Nguyên liệu
25