ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC KHÁNG SINH

MỤC LỤC
I. Khái quát chung về xạ khuẩn................................................................3
1. Khái niệm xạ khuẩn.......................................................................3
2. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3
3. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn..................................................3
4. Cấu tạo của xạ khuẩn.....................................................................4
5. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại.............................4
6. Một số ứng dụng của xạ khuẩn.....................................................6
II. Ứng dụng của xạ khuẩn trong thuốc kháng sinh...................................7
1. Lịch sử hình thành chất kháng sinh...............................................7
2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn...................................8
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh...........8
4. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn
Streptomyces orientalis.......................................................................10
III. Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn...........................................14

Page 1


LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là
điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật.
Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam.
Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong
đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô
nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát
triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng
này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh.
Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ
khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao,

trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.

Page 2


ỨNG DỤNG CỦA XẠ KHUẨN TRONG THUỐC
KHÁNG SINH
I. Khái quát chung về xạ khuẩn
1. Khái niệm xạ khuẩn.
Xạ khuẩn (danh pháp khoa học: Actinobacteria; tiếng Anh: Actinomycetes) là
một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước
kia được xếp vào Tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi
khuẩn (Schizomycetes)

2. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,bùn, thậm
chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố
của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm
thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng
có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn
có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số
lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.

3. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.
 Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và

không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử).
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào
điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay
đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ
ẩm…
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung
tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam,
vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối
xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm
trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có
thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi
trường.
 Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại
cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt
Page 3


thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ
yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya)
lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm
vụ dinh dưỡng.

4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ
thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,

nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài
cùng, lớp giữa rắn chắc, lớp trong dày.
Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều
enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua
màng tế bào
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4
nhóm chính:
 Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
 Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
 Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic.
 Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ
yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan
trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi
khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn
nhập

5. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại
 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan
trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu
hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường
dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. Tiến hành
quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ
khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử.
Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho

những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống sinh bào tử
xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ
Page 4


liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết xạ khuẩn rất
không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân
tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những
loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy để phân loại được chính
xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử.
 Đặc điểm hóa phân loại
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm
trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và
định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào
các đặc điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit
và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của
mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG.
- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia,
Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân loại cơ bản
cho các chi đó.
- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch
thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở
nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit
tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi
- Photpholipit có 5 typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc
trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi
muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không
thể nào không xác định thành tế bào.
 Đặc điểm sính lý – sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh
lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các
chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống
enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các
yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát
triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng
tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ
khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa
cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Do
tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử
dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi.
 Phân loại số
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh
hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số.
Page 5


Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa
các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý,
sinh hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ
số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng.
- Công thức của Sokal và Michener (SSM )
- Công thức của Jacard (SJ)
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ

cây") của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp
vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces
thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định.
 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici
đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện
chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn
khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm.
Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được
phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí
sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những
hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng ...
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân
đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với
đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy
thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện
các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau
tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy
trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP
đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV
này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram
dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30 0C,
pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn
(xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi
khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay để
xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng

hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau

6. Một số ứng dụng của xạ khuẩn
Đặc tính của xạ khuẩn là khả năng tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm
thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và cây trồng. Xạ khuẩn còn có khả năng
sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ. Xạ khuẩn
Page 6


còn có khả năng tiết ra các enzym (proteas, amylaz...) và trong tương lai có thể
dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm và vi khuẩn vì nấm có thể
sinh ra aflatonxin độc cho người và gia súc.

II. Ứng dụng của xạ khuẩn trong thuốc kháng sinh
1. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh.
Theo định nghĩa của Outchinnikov. Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên
nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng
tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ
thấp.
Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander
Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10
năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học
Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành
"một loại thuốc thần kỳ". Năm 1945, A.Fleming, E. Chain và H.W.Florey đã được
nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một
kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh.
Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu
CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do
Rene' Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm

1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952... Cùng với việc phát hiện ra các
CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện.
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng
chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu
hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên
thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng,
nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại
nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá
trị ứng dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn
hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra
kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng sinh
loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các
CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết
từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS
này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và
Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung
thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml.
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.
C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
Page 7


methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của
nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được
những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những
chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp

như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn
dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có
HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý
trong thời gian ngắn.
Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ thuật
tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết
quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển
vọng trong sản xuất các CKS.

2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn
gốc từ xạ khuẩn
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và
từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một
nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng
khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để
phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả
cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường
tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi
trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển
hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu
kỳ sinh trưởng.
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
• CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym.
• CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.
• CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ

cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ
thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp
CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và
cofactor.

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Page 8


 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS
của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 30 0C, nhưng nhiệt
độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C
 pH môi trường
Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH
tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và
tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là
trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS.
 Độ thông khí
Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác,
nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình
nuôi cấy). Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi
trường lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan oxy. Nồng độ oxy
thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men.
 Tuổi giống
Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ
thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống cấy truyền vào

môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi. Lượng
giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10%
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt
chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng. Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ
C/N và các chất khoáng...
 Nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành
CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy
nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác
nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza,
fructoza...có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza...Ngoài ra
một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức
ăn cacbon trong lên men sinh CKS.
 Nguồn nito
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ
và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như
bột đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên
lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS[27]. Nguồn
nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh
tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
 Nguồn photphat vô cơ
Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS.
Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10
mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo
Page 9


dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến
giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS.

 Các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi
trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng
đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm
thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
 Hình thức lên men
Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố
quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và
CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng. Quá trình sản xuất CKS thường
được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy
đảo và sục khí.

4. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn
Streptomyces orientalis.
Vancomycin là chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi và có tác dụng tích
cực trong chữa bệnh. Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam) đang nghiên cứu điều kiện thích hợp sản xuất
vancomycin từ biến chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis nhận được từ xử lý
N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) lên tế bào trần của chủng gốc.
Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực
trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều
trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng
methicillin (chất kháng sinh nhóm β-lactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa
vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng sinh
quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các
kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông
dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm,
phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh
cao. Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất
chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất

kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện
mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra.
Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất
vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phù hợp với điều kiện kinh tế và môi
trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xây dựng
một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ
công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
a. Chủng giống vi sinh vật.
Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm
định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus
209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2 (Bộ sưu tập giống của Phòng Công
nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học); các hóa chất dung để phân tích, định
Page 10


lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1,
A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48.

A. Hình dạng khuẩn lạc, B. Cuống sinh bào tử, C. Bào tử.
Hình 1: Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912
b. Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng
S.orientalis 4912.
Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh
kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng
khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao
nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh
dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh.

Hình 2: Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912
Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường saccharose với hàm lượng

thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số các nguồn nitơ thử
nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2%
là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích
hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.orientalis
4912 là 280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men
thích hợp 6 - 8 % so với môi trường lên men.
Nghiên cứu động thái quá trình lên men chủng S. orientalis 9412 cho thấy,
sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men.
Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các
chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác.
c. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S.orientalis 4912.
Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp
gây chủng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào
trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%,
Page 11


kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8-30,3% đối với xử lý bào tử và
66,33% đối với xử lý tế bào trần.

Hình 3: Khả năng sống sót
của tế bào trần và bào tử Hình 4: Hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc
chủng S. orientalis 4912 chủng S. orientalis 4912 xác định bằng phương
sau khi xử lý UV và pháp cục thạch (A) và đục lỗ (B)
MNNG
Sau đó, các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây
chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời
gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng có hoạt tính
kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng

S. orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) có hoạt tính kháng sinh
cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản
xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml).
d. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng
đột biến.
Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến
hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực
nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 như sau
Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO 3 2
g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l.
Ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%,
nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng
của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng
hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61
được thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH,
nhiệt độ và tỉ lệ giống đã xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt
tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 2030% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983
mcg/ml và 9,8 mg/ml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung
cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết
yếu của sản xuất vancomycin.
Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 được nuôi trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với
Page 12


thành phân môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong
bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8
mg/ml. Cũng tại thời điểm này chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng
độ đạt cực đại là 2983 mcg/ml.

Hình 5: Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp
vancomycin bởi biến chủng S. orientalis 4912-81-61 Hình 6: Thiết bị lên
men Bioflo 5000
trên thiết bị Bioflo 5000
e. Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men.

Hình 7: Quy trình chiết xuất vancomycin

Page 13


Quy trình chiết xuất vancomycin
Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S. orientalis 4912-8161 bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung môi Butanol - axit acetic - H 2O (4 : 3 : 7)
cho giá trị Rf của các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion
Trap trên máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử là 1449,27 và bằng sắc ký lỏng cao
áp trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu là ở 4,4 phút giống như
vancomycin chuẩn (Merck). Sắc ký đồ HPLC cho thấy không có các pic tạp chứng
tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4%.

Hình
8:
Kiểm
tra
vancomycin bằng sắc ký
lớp
mỏng Hình 9: Phỏ UV của
Hình 10: Phỏ HPLC của
1. Vancomycin từ môi vancomycin
chuẩn
vancomycin chuẩn (trên)

trường nuôi cấy, 2. (trên) và vancomycin
và vancomycin chủng S.
Vancomycin đã tách chiết chủng S. orientalis
orientalis 4912 (dưới)
và làm tinh khiết; và 3. 4912 (dưới)
Vancomycin
chuẩn
(Merck)
Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các
bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn
kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng
được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao
hơn chủng gốc 344%. Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương
đương với vancomycin chuẩn (Merck).
III.

Một số nghiên cứu liên quan đến xạ khuẩn
1. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật
Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu tình hình
Page 14


sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở mức thấp nhưng
đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại.
Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng
chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ
mắc bệnh của cây. Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một
vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác
nhân gây bệnh có trong đất.
Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện

trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế
nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân
bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh
khi trong đất có mầm gây bệnh. Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS,
còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym phân giải. Ngoài ra, nhiều XK
còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ
VSV có lợi trong vùng rễ.
Năm 2002 tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả
năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso- nicotinate, chất kháng sinh này có khả
năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F. solina…..
Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ
khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum gây
bệnh thối rễ ở thực vật . Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực
vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa
chất bảo vệ thực vật nhất định.
Ngoài ra, các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất các chế
phẩm sinh học của người nông dân. Do đó, cần có sự phối hợp thống nhất trong
việc nghiên cứu , sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông ,
xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng
chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo
vệ môi trường và sức khỏe con người.
Hơn 50 loại thuốc kháng sinh khác nhau đã được phân lập từ loài
Streptomyces, bao gồm: streptomycin, chloramphenicol, neomycin và tetracycline.

2.
Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ
khuẩn L30 trên đất trồng lạc
Tiến hành nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất, cho chúng phát triển
hai tuần sau nhiễm tiếp chủng gây bệnh héo xanh Pseudomonas solanacearum

222 vào trước khi trồng lạc. Sau một tháng trồng lạc tiến hành quan sát các chậu
đất. Khi lạc được 2 - 3 phiến lá tiến hành tiêm vi khuẩn gây bệnh héo xanh vào các
lách lá cây lạc. Sau một tháng đọc kết quả

Page 15


Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ khuẩn L30 trên đất trồng
lạc
Số cây lạc sống sót
Nhiễm
P. Tiêm
P.
Mẫu
solanacearum
solanacearum
vào Đối chứng
vào đất
cây lạc
Không nhiễm xạ khuẩn
5
0
25
Nhiễm xạ khuẩn
25
25
25
Kết quả ghi ở bảng trên cho thấy khi nhiễm P. solanacearum vào đất trồng
lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân cây trong điều kiện trước đó đã nhiễm chủng xạ
khuẩn thì không có cây nào bị nhiễm bệnh (tỷ lệ sống sót 100%), trong khi đó ở

đất không nhiễm xạ khuẩn thì có 80 - 100% cây bị bệnh.
Từ đó ta có thể kết luận
 Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với nhiều loại vi sinh vật
kiểm định đặc biệt la hoạt tính mạnh kháng Pseudomonas solanacearum
 Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý hóa, chủng L30 có
đặc điểm khác với các loài đã mô tả.
 Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ
khuẩn L30 trên môi trường ISP-4 với pH=7, nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men
là 120-144 giờ, nguồn cacbon trên tinh bột và nguồn nito là (NH4)2SO4
 Chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 sinh ra không ảnh hưởng đến
khả năng nảy mầm của hạt lạc.
 Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất không gây ảnh
hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc mà còn có tác dụng ức chế bệnh héo xanh.

3. Xạ khuẩn trong chế phẩm vi sinh
Việc nghiên cứu ứng dụng các đặc điểm hữu ích của vi sinh vật ngày nay đã
trở nên rất phổ biến; trong đó có lĩnh vực xử lý phế phẩm, chất thải trong quá trình
sản xuất nông nghiệp.
Để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các chế
phẩm như BIMA (Trichoderma), ACTIVE CLEANER (xạ khuẩn Streptomyces
sp., nấm Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) được sử dụng để ủ phân gia súc,
chất thải hũu cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ).
Việc sử dụng chế phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân
xanh, rác từ 2-3 lần so với cách ủ thông thường.

Page 16


KẾT LUẬN
Từ các mẫu đất khác nhau, đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ

khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm
gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Trong số các chủng
có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%,
hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3%.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới
80% là do xạ khuẩn sinh ra. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ
khuẩn
hiếm
như
Micromonospora
Actinomadura,
Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm
đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp
chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza,
Page 17


xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho
người, động vật

Page 18


TÀI LIỆU THAM KHẢO
/> />option=com_content&view=article&id=1106%3Anghien-cu-quy-trinh-cong-ngh-sn-xutkhang-sinh-vancomycin-t-x-khun-streptomyces-orientalis&catid=37%3Atin-khcn-trongnc-&Itemid=34&lang=vi
/>
Page 19