Phân lập các dòng vi sinh vật có khả năng sản xuất phytohormon ở trong đất của vùng đất phèn Tân Phước, Tiền Giang

Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU........................................................................ 4
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU........................................................7
2.1 Đặc tính của đất phèn.......................................................................... 7
2.2 Kích thích tố tăng trưởng thực vật.....................................................7
2.3 Cơ chế tổng hợp IAA......................................................................... 8
2.4 Vi sinh vật tổng hợp IAA.................................................................10
2.4.1 Vi khuẩn nốt rễ ........................................................................12
2.4.2 Azotobacter................................................................................ 12
2.4.3 Azospirillum............................................................................... 12
2.4.4 Vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. Savastanoi.......................13
2.4.5 Vi khuẩn Guconacetobacter.......................................................13
2.4.6 Vi khuẩn Burkholderia..............................................................13
Vi khuẩn Burkholderia thu ộc nh óm vi khuẩn gram âm, c ó hình dạng
xoắn, chúng có thể di chuyển nhờ các chiêm mao ở phần đầu(Jesus and
al, 2004). Chúng sinh trưởng trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí,
nhưng trong môi trường kị khí sẽ phát triển tốt hơn(Paulina and al,
2001). Vi khuẩn Burkholderia sống ở vùng rễ của rất nhiều loài cây như:
ngô, mía, cà phê, họ hoà thảo…có khả năng tổng hợp các chất tăng trưởng
cho cây trồng........................................................................................ 13
2.5 Sơ lược về cây trồng........................................................................ 13
2.5.1 Sơ lược về cây khóm (Annanas comous).....................................13
2.5.1.1 Vị trí phân loại cây khóm........................................................13
2.5.1.2 Tình hình trồng khóm ở huyện Tân Phước, Tiền Giang........14
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM...........16
3.1 Phương tiện thí nghiệm...................................................................16
3.1.1 Hóa chất..................................................................................... 16

3.1.2 Các loại môi trường nuôi vi khuẩn..............................................16
LGI, NFb, RMR, ............................................................................... 16
3.1.3 Hóa chất dùng để nhộm Gram...................................................17
3.1.4 Thiết bị.................................................................................... 17
3.1.5 Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn...........................................17

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

3.1.6 Một số thiết bị, dụng cụ khác dùng để phân lập và nhận diện vi
khuẩn................................................................................................. 17
3.1.7 Một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, lam, la men, que
thuỷ tinh, kẹp, dao cắt mẫu, cối nghiền mẫu, bình tam giác, cốc đựng
dung dịch, chai lọ thuỷ tinh, ...
..................................................18
3.2 Vật liệu thí nghiệm.........................................................................18
3.3 Phương pháp nghiên cứu.................................................................18
3.3.1 Phân lập và khảo sát vi sinh vật tổng hợp IAA..............................18
3.3.1.1 Phân lập và khảo sát vi sinh vật tổng hợp IAA sống tự do và
vùng rễ............................................................................................. 18
3.3.1.2 Thu thập vi sinh vật sống nội sinh.....................................19
3.3.2 Khảo sát khả năng tổng hợp auxin của các dòng vi sinh vật .......19
3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Gram : ................................................19
3.3.3 Định danh bằng PCR các loài thu được ........................................20
3.3.3.1 Ly trích DNA ..................................................................... 20
3.3.3.2 Dung dịch dùng cho phản ứng PCR . ...................................20

3.3.3.3 Các bước thực hiện PCR ....................................................20
3.4 Phân tích các thành phần trong đất trước khi bố trí thí nghiệm ngoài nhà
lưới : ..................................................................................................... 21
3.4.1 Phân tích các thành phần dinh dưỡng N; P; K : .............................21
3.4.1.1 Kiểm tra protein trong đất bằng phương pháp lowry : .........21
3.4.2 Phân tích các enzim thủy phân trong đất . ......................................22
3.4.2.1 Enzim dehydrogenase ( Casida et al., 1964 ) ......................22
3.4.2.2 Enzim phosphomonoesterase (Axid và Alkaline phosphate)
(Tabatabai & Bremner, 1969; Eivazi & Tabatabai, 1977 ) .............23
3.4.2.3 Enzim Urease : ...................................................................23
3.5 Phân tích thành phần đất sau khi tiến hành thí nghiệm..........................24
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của dòng vi sinh vật thu được trên cây trồng trong
điều kiện invitro và nhà lưới : ...................................................................24
3.6.1 Cách bố trí thí nghiệm trong phòng lab : .....................................24
3.6.2 Cách bố trí thí nghiệm trong nhà lưới : ........................................25
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ DỰ KIẾN .........................................................26
CHƯƠNG 5. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ................................................27

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

DANH SÁCH HÌNH VÀ BẢNG
Hình 1: Sự hình thành liên tục auxin trong đỉnh sinh trưởng của thân và rễ cây. . 7
Hình 2: Lộ trình tổng hợp IAA từ chất dẫn xuất L- Tryptophan................9
Hình 3: Cây dứa(khóm) Ananas comous [ L.] Merr......................................14
Bảng 1. Các hợp chất trong đất tác động đến sự tăng trưởng của thực vật....8

Bảng 2: Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất.................11

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Đồng bằng sông cửu long với hơn 4 triệu ha đất canh tác, đây là vùng trọng điểm
nông nghiệp của cả nước, sản xuất ra khối lượng lớn lương thực thực phẩm, là nơi
có nhiều sản phẩm nông nghiệp cung cấp cho cả nước và xuất khẩu đem về ngoại tệ
cho đất nước. Do vị trí địa lí của vùng Đồng bằng sông cửu long được phân ra nhiều
loại đất khác nhau (Đất phèn, đất phù xa, đất ngập mặn,…), mỗi loại đất sẽ thích
hợp cho loại cây trồng và nguồn phân bón cũng phải phù hợp thì mới đạt hiệu quả
tốt nhất. Đất phèn là loại đất đặc biệt của vùng đầm lầy ven biển nhiệt đới. Đất
phèn còn gọi là đất chua mặn, chua sulfat. Loại đất sau khi cày bừa, nước ruộng
chua chát như phèn do pH<4.Trên thới giới đất phèn có nhiều ở Trung Quốc, Hà
Lan, Campodia, Thái Lan, Indonexia, Ấn Độ, Đông và tây Châu phi, ở Nam Mỹ,
tổng diện tích 20 triệu ha, ở nước ta đất phèn có nhiều ở đồng bằng nam bộ (khoảng
2 triệu ha) và ở đồng bằng bắc bộ (vài chục vạn ha). Đất phèn ở vùng Đồng bằng
sông cửu long có diện tích rộng lớn tập trung nhiều ở các tỉnh như Đồng tháp, an
Giang, Cần Thơ Sóc Trăng, Minh Hải, tạo nên nét đặc thù riêng về hệ sinh thái riêng
của vùng này, đối với thực vật có những loại cây thích hợp với vùng đất phèn như:
Khoai mỡ, điều, dứa, bàng, tràm…(Chiểu, 2000) Dứa (khóm) (Ananas comosus L.)
là một trong những cây ăn trái quan trọng trên thế giới đứng thứ ba sau chuối và cây
có múi, với tổng sản lượng trên thế giới khoảng 15.886.647 Mt (FAO, 2005), dứa
tiêu thụ chủ yếu qua chế biến và ăn tươi. Các nước trồng nhiều dứa trên thế giới như
Thailand, Philippines, Costa-Rica, Malaysia(Hằng, 2008), ở nước ta hiện nay cây

khóm được trồng rất phổ biến, và cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao, khóm được
trồng ở nhiều vùng ở nhiều tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long như Long An, Hậu
Giang, Kiên Giang, Tiềng Giang,…(Bá, 2003). Quả dứa được coi là một trong
những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, loại quả “vua”, rất được ưa chuộng ở các nước
phương Tây. Quả khóm có mùi thơm mạnh, chứa nhiều đường, lượng calo khá cao,
giàu chất khoáng, nhất là Kali, có đủ các loại vitamin cần thiết như A, B1, B2, PP, C
đặc biệt trong cây và quả dứa có chất Bromelin là một loại men thủy phân protêin
(giống như chất Papain ở đủ đủ), có thể chữa được các bệnh rối loạn tiêu hóa, ức chế
phù nề và tụ huyết, làm vết thương mau thành sẹo. Trong công nghiệp, chất
Bromelin dùng làm mềm thịt để chế biến thực phẩm, nước chấm. Khóm là loại cây
cần rất nhiều chất dinh dưỡng trong đất, theo Martin Prevel (1979) thí nghiệm ở
Ghine với mật độ 38.500 cây/ha, thu hoạch 55 tấn khóm quả phải huy động dinh
dưỡng trong đất như sau: N: 205kg/ha, K20: 339kg/ha, P205: 58kg/ha,
CaO:121kg/ha, MgO: 42kg/ha, cùng với các nguyên tố vi lượng khác (Bá, 2003).
Chính vì vậy các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các vi sinh vật trong đất phèn
hay các vi sinh vật sống nội sinh có khả năng giúp tăng cường sinh trưởng ở cây
khóm và các cây ở vùng đất phèn, đồng thời hạn chế độc tính của đất khi sử dụng
quá mức phân hóa học. Có nhiều loài sinh vật , nhất là vi khuẩn vùng rễ được biết có

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

khả năng làm tăng trưởng sự phát triển cây trồng . Nhóm này của vi sinh vật được
gọi là PGPR “Plant Growth Promoting Rhizobacteria” và có những dòng thể hiện ưu
điểm mạnh như: Pseudomonas, Azouirillum, Burkhoderia, Bacillus, Enterobacter,
Rhizobium, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter và

Flavobacterium (Trúc, 2007). Các dòng vi khuẩn có lợi trong đất và vi khuẩn sống
nội sinh trong cây giúp cây tăng trưởng tốt bằng cách tổng hợp kích thích tố tăng
trưởng auxin (IAA)(Barbieri và ctv, 1991), ngoài ra chúng còn giúp cố định đạm và
hòa tan lân khó tan, giảm tính mẫn cảm với nguồn bệnh và sự thay đổi của thời tiết
làm tổn hại đến cây trồng (Xu và ctv, 1998). Tuy nhiên, vấn đề nghiên cứu về vi
khuẩn tự do, vi khuẩn vùng rễ hay các vi khuẩn nội sinh ở vùng đất phèn có một số
khó khăn, vì các vi khuẩn thường thích nghi ở độ pH trên 4, như vi khuẩn nitrat hoá
thuộc giống nitrobacter thích hợp ở pH trên 6, đặc biệt là Azobacter cố định N trong
đất thích hợp pH từ 6 trở lên (Bá, 2003). Với mục đích là nghiên cứu tìm kiếm phân
lập sử dụng vi sinh vật trong đất có tiềm năng sinh học như cố định đạm, hòa tan lân
đặc biệt là vi sinh vật tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật (phytohormon)
thích hợp ở vùng đất phèn, góp phần giúp tăng năng suất cây trồng ở vùng đất này
và cân bằng hệ sinh thái. Trong phạm vi đề tài này là tìm kiếm, phân lập và định
danh các vi sinh vật có khả năng sản xuất phytohormon cung cấp cho cây trồng ở
vùng đất phèn Tân Phước, Tiền Giang .Với mục đích là tìm ra vi sinh vật cung cấp
phytohormon tốt nhất ở vùng đất phèn có thể kết hợp để làm phân vi sinh chuyên
cho vùng đất phèn nhằm thay thế phân hóa học hiện nay.

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Mục tiêu đề tài
1. Phân lập các dòng vi sinh vật có khả năng sản xuất phytohormon ở
trong đất của vùng đất phèn Tân Phước, Tiền Giang.
2. Tuyển chọn được các dòng vi sinh vật cá độ hữu hiệu cao (khả năng
tổng hợp phytohormon cao).

3. Định danh dòng thu được bằng phương pháp sinh hoá và sinh học
phân tử.
4. Thử nghiệm những vi sinh vật có độ hữu hiệu cao trên cây trồng
trong điều kiện nhà lưới.

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc tính của đất phèn
Đất phèn (S. Thiomic Fluvisole (FLt)) là một loại đất đặt biệt của vùng đầm lầy ven
biển nhiệt đới. Đất phèn còn được gọi là đất chua mặn, chua sulfat với pH <4, đất
phèn chứa nhiều muối tan, thành phần chủ yếu là muối tan sulfat sắt và sulfat nhôm
(Khoa, 1996). Đất phèn có hai đặc tính là đất phèn tiềm tàng hay đất phèn hoạt
động, đất phèm tiềm tàng có độ pH thấp(<3.5) , hữu cơ cao, Al, Fe di động cao, Ca 3+
, Mg2+ thấp, Ag3+, SO42- cao (Chiểu, 2000)
Sự hình thành đất phèn, Arino (1930) đã chứng minh rằng:Khoáng pirit (FeS 2) có
trong mẫu thổ, là nguồn gốc phát sinh đất phèn (khoáng này có nhiều ở đất mặn và
ven biển) trong điều kiện thoáng khí pirit bị oxit hóa thành H2SO4 và FeSO4.
FeS2 + 7/2 O2 + H2O → H2SO4 + FeSO4
Con người bón nhiều phân vô cơ tạo ra các nhóm chua sinh lý (Ure, K 2SO4,
(NH4)2SO4, KCl, Super phophat còn dư acid) làm chua đất làm nghèo các ion baze
xuất hiện nhiều chất độc Ag3+, Fe3+, Mn2+ di động có hại cho cây, làm giảm hoạt tính
sinh học đất.
2.2 Kích thích tố tăng trưởng thực vật
Kích thích tố tăng trưởng gồm rất nhiều các hợp chất được tổng hợp từ tế

bào của thực vật, giữ vai trò điều hòa quá trình sinh trưởng và phát triển của thực
vật.Có bốn nhóm kích thích tố quan trọng: Cytokinine (CYT), gibberelline(GA),
auxin(IAA) và abscisic acid(ABA), trong đó ba nhóm kích hoạt tiens trình sinh
trưởng và phát triển là CYT, GA, IAA. Acid indole-3-acetic(IAA) hay còn gọi là
auxin là kích thích tố đầu tiên được xác định và giữ vai trò trung tâm trong sự tăng
trưởng thực vật và nó được dùng như một chất điều hòa quá trình sinh học từ sự
phân chia tế bào, kéo dài,phân hóa mô phân sinh, phát triển trái và
hột(Thimann,1969).

Hình 1: Sự hình thành liên tục auxin trong đỉnh sinh trưởng của thân và rễ cây.
(Nguồn: www.nsf.gov)

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Auxin được tìm thấy đầu tiên ở thực vật bậc cao và nó được tổng hợp từ dẫn xuất là
L-tryptophan theo sơ đồ sau:
L-tryptophan → acid indole-3-pyruvic → indole-3-acetaldehyde → IAA
Ngày nay khoa học công nghệ khám phá ra là các kích thích tố tăng trưởng trên có
thể được tổng hợp từ vi sinh vật và đây nguồn được sản xuất lớn các hợp chất sinh
học chính là từ vi sinh vật. Trong những năm của thập kỷ 50 của thế kỷ 20,
Krasil’nikov và ctv (1958) đã tổng kết những kết quả thí nghiệm ở nước Liên Xô
cho thấy những chiết xuất từ mùn (humus), than bùn (peat), compost…tìm được vi
khuẩn đã cải thiện sự tăng trưởng của thực vật và cải thiện năng suất đáng kể, sau đó
ông và cộng tác viên dùng từ “Auximone” để chỉ hợp chaayts có trong mùn, than
bùn, compost. Sau này các nhà khoa học đã tìm ra được rất nhiều hợp chất quan

tọng khác kích thích sự tăng trưởng thực vật có ttrong mùn.(bảng)
Bảng 1. Các hợp chất trong đất tác động đến sự tăng trưởng của thực vật
Hợp chất

Tài liệu đã nghiên cứu

Co-enzim
Allison và Hoover (1936)
Fluorine
Robinson và Edington (1946)
Thiamine
Roulet và Schopfer (1950)
Riboflavin
Schmitdt và Starkey (1951), Carpenter (1943)
Biotin
Roulet và Schopfer (1950)
Vitamin B6 , B12
Robbins và ctv (1952)
Inositol
Roulet (1948)
Acid Nicotinic
Roulet (1948)
Acid p-Aminobenzoic
Roulet (1948)
Acid pentothenic
Roulet (1948)
Acid Folic
Roulet (1948)
Auxin
Roberts và ctv (1939), Parker-Rhodes (1940)

Gibberellins
Kurosawa (1926), Rossi và ctv (1984)
Cytokinins
Van Andel và Fuchs (1972)
Ethylen
Smith và Russell (1969)
Acid Abscisic
Ohkuma và ctv (1952)
Nguồn: Arshad và Frankenberger (1993)

2.3 Cơ chế tổng hợp IAA
Vi sinh vật cố định đạm sống tự do, vi sinh vật sống ở vùng rễ và những vi sinh vật
khác có cơ chế tổng hợp IAA với tiền chất(precusor) là L-trytophan theo cơ chế
trình bài sau:

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Hình 2: Lộ trình tổng hợp IAA từ chất dẫn xuất L- Tryptophan
Nguồn: users.lycaeum.org/~desoxy/Products.htm

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

2.4 Vi sinh vật tổng hợp IAA
Auxins là một chất kích thích sinh trưởng có thể được tổng hợp bởi thực vật,
IAA có vai trò trong quá trình phát triển tế bào như tăng trưởng tế bào, phân chia,
hình thành rễ(Ann Vande Broek, 1998), tuy nhiên sự tăng trưởng của thực vật lại
chịu sự tác động không nhỏ từ nguồn auxins bên ngoài và một trong những nguồn
đó là auxins được tổng hợp bởi các vi sinh vật có ích trong đất. Trong đó các vi sinh
vật được phân lập từ vùng rễ và trên bề mặt rễ của nhiều loại cây trồng là có khả
năng tổng hợp IAA cao (Arshad và Frankenberger, 1998). Theo Loper và Schroth
(1986) thì có đến 80% các chủng vi sinh vật được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại
cây trồng là có khả năng tổng hợp auxins. Các chủng vi sinh vật thuộc các giống
như Azospirilium, Pseudomonas, Rhizobium, Xanthomonas, Bradyrhizobium
japonicum, Gluconobacter diazotrophicus đã được xác định là có khả năng tổng hợp
IAA giúp kích thích sự sinh trưởng của cây trồng (Patten và Glick, 1996). Gần đây
là Ahmad (2005) đã phân lập được 10 chủng Azotobacter và 11 chủng
Pseudomonas từ đất vùng rễ cây lúa mì, mù tạt, cây cải, đều cho thấy chúng có khả
năng tổng hợp IAA rất cao trong môi trường có bổ sung Tryptophan và không có bổ
sung Tryptophan.
Nhiều dòng vi sinh vật sống trong đất có khả năng tổng hợp nên các chất tăng
trưởng của thực vật và giúp cho cây trồng phát triển. Trong đó có nhiều vi sinh vật
sống trong vùng rễ (rhzophere) có khả năng tổng hợp chất kích thích sự tăng trưởng
của thực vật gọi là nhóm (PGPR)(Trúc, 2007). Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng
trưởng thực vật cải thiện sự tăng trưởng thực vật và gia tăng năng suất với cơ chế
trực tiếp(cố định đạm, hòa tan lân khó tan, sản xuất ra auxin hay cytokinin) và cơ
chế gián tiếp (hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây hại)(Brown, 1974; Klopper và
ctv, 1986, 1989; Davision, 1988; Lambert và Joos, 1989). Với rất nhiều nhóm vi
sinh vật sơ hạch như Pseudomonas syringae (Glickmann và ctv, 1998),
Azosprillium brasilense (Hartman và ctv, 1983), Azobacter vineelandii (GarciaTavares và ctv, 1987), Agrobacterium tumefasciens (Liu và ctv, 1982), Rhizobium
trifolii và Rhizobium leguminosarum (Badenoch-Jones và ctv, 1982), Rhizobium

phaseoli (Ernstsen và ctv, 1987), Bradyrhizobium japonicum (Kaneshiro và ctv,
1983), Erwinia herbola (Koga và ctv, 1991), thanh tảo Anabaena cylindrica và
Nostoc rivulare (Florenzano và ctv, 1978), Enterobacter cloacae (Koga, 1995), các
vi sinh vật trên là đại diện cho những vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

tăng trưởng cho cây trồng, bảng 1 dưới đây là một số vi sinh vật có khả năng tổng
hợp kích thích tố tăng trưởng.
Bảng 2: Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất
Vi sinh vật
Agrobacterium tumefasciens
Alcaligenes ssp.
Arthrobacter ssp.
Bacillus cereus
Bacillus circuslans
Bacillus subtilus
Pseudomonas spp.
Pseudomonas syringae pv.
glycinea
Streptomyces ssp.

Sản phẩm
IAA
IAA

IAA
IAA
Tương tự auxin

Tác giả
Muller và ctv (1989)
Brown (1972)
Wiknson và ctv (1994)
Wiknson và ctv (1994)
Stzelczyl và ProkojskaBurdziez(1984)
IAA
Muller và ctv (1989)
IAM,
IAA, Martens
và
Franerberger
IPyA
(1991)
IAA, Iald, ILA
Fett và ctv (1987)
Tương tự auxin

Stzelczyl và ProkojskaBurdziez(1984)
Xanthomonas pv. glycine
IAS, ILA, IAM Fett và ctv (1987)
Xanthomonas maltophilia
IAA
Wiknson và ctv (1994)
Rhizobium meliloti
IAA

Garcia-Rodriguez
và
ctv(1981)
Rhizobium phaseoli
IAA, IM
Ernsten và ctv(1987)
Rhizobium trifolii
IAA, IpyA, ILA Badenoch-Jones và ctv(1982)
Rhizobium japonicum
IAA
Kaneshero và ctv (1983)
Bradyzhizobium spp.
NAA
Sekine và ctv (1988)
Azobacter spp.
IAA
Mahmoud và ctv (1984)
Azobacter chroococcum
IAA
Muller và ctv (1989)
Azobacter vinelandii
IAA
Gonzalez-Lopez và ctv(1983)
Anabaena cylindrica
IBA
Florenzo và ctv(1978)
Nostoc rivulare
IAA, IPyA
Florenzo và ctv(1978)
H. hiemale

IAA, ICA, IAld Gay và Deband (1987)
H. masophaeum
IAA
Stzelczyl và ctv (1992)
Glomus spp.
IAA
Polojska và Strzelczyl (1988)
Trichoderma spp.
Tương tự auxin Kampert và Strzelczyl
Wardomyces humicola
IAA
Reddy và ctv(1988)
(Nguồn:Trích từ các bảng trong phytohormone trong đất của W.T.Frankenberger và
Jr.Muhannad Arshas, 1995.)
Các nhà khoa học đã tiến hành phân lập, xác định và nghiên cứu để đưa các vi sinh
vật này vào phân sinh học để góp phần làm taweng năng suất cây trồng và thân thiện

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

với môi trường sống và đã đạt được những kết quả khả quan trên đậu nành (Molla
và ctv, 2001), lúa gạo (Rasul và ctv, 1998), trên bắp lai (Chabot và ctv, 1996). Như
vậy khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở vi sinh vật là rất lớn, cá thể chia
thành ba nhóm vi sinh vật sơ hạch là: vi khuẩn nốt rễ (Rhizobia), vi khuẩn cố định
đạm sống tự do và vi khuẩn vùng rễ.
2.4.1 Vi khuẩn nốt rễ

Các nhà khoa học đã phát hiện ra vi sinh vật nốt rễ tổng hợp được IAA từ
tiền chất tryptophan nhưng nhóm này có thể tổng hợp IAA không có tryptophan ,
tuy nhiên nếu bổ sung tryptopgan thì chúng tổng hợp IAA nhiều gấp 7 lần (Kittell
và ctv, 1989).Nhiều vi khuẩn nốt rễ thích hợp với loại truptophan khác nhau, như vi
khuẩn nốt rễ từ nốt rễ cây đậu phọng thích DL-tryptophan (Roy và Basu, 1988), còn
vi khuẩn nốt từ cây Crotalria retusa thích D-tryptophan hơn loại L-tryptophan hay
DL-tryptophan (Bhattacharyya và Basu, 1991).
2.4.2 Azotobacter
Sử dụng vi khuẩn Azotobacter chroococcum làm phân chủng cho hột giống để cung
cấp Nitơ cho cây trồng được phổ biến rộng rãi ở Liên Xô trong những năm 1950
(Cooper, 1950),nhưng sau này người ta đã chứng minh nó có thể tổng hợp kích
thích tố tăng trưởng thực vật (Muller và ctv, 1989) và nhiều loài khác trong giống
này có khả năng tổng hợp được kích thích tố tăng trưởng. Azotobacter
chroococcum có thể tổng hợp IAA trong điều kiện không có tryptophan (Elwan và
El-Naggar, 1972), nhưng nếu chúng ta cung cấp thêm tryptophan thì lượng IAA
được tổng hợp sẽ nhiều hơn (Apte và Sharde, 1981).
2.4.3 Azospirillum
Vi khuẩn này được phân lập từ đất vùng rễ nhiều loài cây trồng và loài cỏ ở vùng
nhiệt đới và ôn đới (Haahtela và ctv, 1981), trong những năm 1984- 1985 các nhà
khoa học đã phát hiện nhiều giống Azospirium trong vùng rễ của cỏ Kallar
(Leptochloa fusca)(Reinhoold và ctv) và những vi khuẩn này được sử dụng làm
phân chủng cho cỏ làm thức ăn gia súc nhờ khả năng cố định đạm cao (Bashan và
ctv, 1989), nhưng gần đay các nhà khoa học đã phát hiện ra thêm Azospirillum có
khả năng tổng hợp IAA cung cấp cho cây trồng giúp tăng nbawng suất cây trồng
(Barbieri và Galli, 1993). Azospirillum brasilense có khả năng tổng hợp IAA nhờ
gen ipdC(Ann Vande Broek,1998), Azospirillum có thể tổng hợp tryptophan mà
không có mặt của tryptophan (Fallik và ctv, 1989) tuy nhiên nếu bổ sung
tryptophan thì chúng sẽ tổng hợp lượng tryptophan nhiều hơn (Horemans và ctv,
1986).

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

2.4.4 Vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. Savastanoi
Pseudomonas là vi khuẩn gram âm, vi khuẩn này tạo ra các bướu hay nốt trên nhiều
loài vây gỗ (Smidt và Kosuge, 1978), nhưng sau này nhiều nhà khoa học đã chứng
minh loài này có khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan nhờ hai gen iaaM và iaaH
trong plasmid (White và Ziegler, 1991), gần đây, Gardan và ctv (1992) tìm thấy 131
dòng từ loài này được phân lập từ đất vùng rễ của nhiều loài cây trồng có khả năng
tổng hợp IAA.
2.4.5 Vi khuẩn Guconacetobacter
Vi khuẩn Guconacetobacter và Guconobacter thuộc họ Acetobacteraceae, đây là
những vi khuẩn sinh trưởng tốt ở môi trường hiếu khí, ở nhiệt độ 30 0 và pH khoảng
5.5-6. Có nhiều loài khác nhau trong đó loài Guconacetobacter diazotrophicus đã
được xác định là hiện diện rất nhiều trong mía và các loài cây hòa thảo, chúng có
khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng auxin cho cây
(Mthukumarasamy và ctv, 2002; Madhaiyan, 2004).
2.4.6 Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia thu ộc nh óm vi khuẩn gram âm, c ó hình dạng xoắn,
chúng có thể di chuyển nhờ các chiêm mao ở phần đầu(Jesus and al, 2004).
Chúng sinh trưởng trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí, nhưng trong môi
trường kị khí sẽ phát triển tốt hơn(Paulina and al, 2001). Vi khuẩn
Burkholderia sống ở vùng rễ của rất nhiều loài cây như: ngô, mía, cà phê, họ
hoà thảo…có khả năng tổng hợp các chất tăng trưởng cho cây trồng.
2.5

Sơ lược về cây trồng

2.5.1 Sơ lược về cây khóm (Annanas comous)
2.5.1.1 Vị trí phân loại cây khóm
Giới: Plant
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Liliopsida
Bộ: Bromeliaceae
Chi: Ananas Mill
Tên khoa học: Ananas comous [ L.] Merr

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Hình 3: Cây dứa(khóm) Ananas comous [ L.] Merr
(Nguồn: />Đặc điểm: Cây khóm hiện nay được trồng bằng chồi ( nhân giống vô tính) hay
bằng hột (Nhân giống hữu tính).
Thân khóm ngắn, có trục giữa để mang lá, cây trưởng thành cao từ 1- 1.5m.
Lá mọc theo hình xoắn ốc, lá thường dài, dày, không có cuống, mặt lá và lưng có
một lớp phấn trắng, thừng có gai nhọn và cứng ở mép lá. Khi khóm trưởng thành
mầm hoa được hình thành ở đỉnh sinh trưởng của cây khóm và phát triển thành hoa,
quả, khóm có quả kép do nhiều quả nhỏ hợp lại.
Đặc điểm sinh lý: Khóm là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới, nhiệt độ thích hợp của
cây khóm 20-320C, khóm thích hợp với đất chua, độ pH từ 4.5- 5.5, có thể chịu
được pH bằng 4, việc trồng khóm ở miền Nam cần xem xét độ pH của đất phèn, vì
một số nơi có độ ph thấp 2.5 trung bình từ 3-4, giống Queen là giồng khá chịu phèn

nhưng pH thích hợp phải trên 4(Bá, 2003).
Về giống khóm có nhiều loại như Cayen có gai, Cayen không gai, Victoria,
Queen…Nhưng đối với đặc điểm về đất và khí hậu ở miền Nam, nông dân thường
trồng hai loại là Smooth Cayen và Queen (Bá, 2003)
2.5.1.2 Tình hình trồng khóm ở huyện Tân Phước, Tiền Giang
Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Achentina, Paragoay).
Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết các nước nhiệt đới và một số
nước á nhiệt đới có mùa sông tương đối ẩm như đảo Hawai, Đài Loan. Dứa có thể
trồng tới vĩ tuyến 380 bắc, trong đó các nước Châu Á chiếm trên 60% sản lượng dứa
cả thế giới. Các nước trồng nhiều là Philippines, Thái Lan, Malaysia, Hawai, Brazil,
Mêhicô, Cuba, Uc, Nam phi.( />
Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Ở Việt Nam, khóm được trồng từ thế kỷ 16, phổ biến là giống Queen, là cây dễ thích
nghi, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau ở nhiều tỉnh như Tiền Giang, Long
An, Kiên Giang, Bạc Liêu, Cà Mau Quảng Nam, Thanh Hóa... sản lượng cả nước
đạt 337.500 tấn khóm tươi, chiếm khoảng 2% tổng sản lượng trên toàn thế giới,
đứng vị trí thứ 11 về sản lượng khóm thế giới (FAO, 2004).
Ở Tiền Giang, khóm được trồng tập trung ở huyện Tân Phước, chủ yếu ở các xã:
Mỹ Phước, Hưng Thạnh, Thạnh Mỹ, Tân Hòa Thành, Thạnh Tân, Tân Hòa Tây, Tân
Lập 1, Tân Lập 2. Huyện Tân Phước là nơi có diện tích trồng dứa tập trung, đến
cuối năm 2006 diện tích trên 12.000 ha (Ủy ban nhân dân huyện Tân Phước, 2006).
Cây dứa Queen với ưu điểm chịu phèn vì thế là loại cây trồng không thể thiếu trong
hầu hết ở các gia đình vùng Tân Phước. Bên cạnh đó, cây dứa Queen còn có các ưu
điểm về phẩm chất trái như trái khi chín có màu vàng đẹp, ngon ngọt thích hợp với

xu hướng của thị trường hiện nay.(Hằng,2008)

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ
PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện thí nghiệm
3.1.1 Hóa chất
-

Mannitol PA
Proteose peptose số 3 Difco
Pseudomonas isolation agar Difco
Yeast Etract
Acid Malic
Glycerol
Bacto tryptone
Sodium Lactate
Biotin
PABA (p-aminobenzoic acid)
Tryptophane
IAA nguyên chất
Acid sulfuric đậm đặt
Cycloheximide
Acid casamino

Agar
FeCl3
K2HPO4 , KH2PO4 , CaCl2, MgSO4, NaCl, Ca CO3
Khóang vi lượng

3.1.2 Các loại môi trường nuôi vi khuẩn
-

LGI, NFb, RMR,
M ôi trường LGI, mỗi lít môi trường gồm các thành phần sau:
+
Sucrose
10g
+
FeCl3
5g
+
NaMo04
2.8g
+
Stock LGI(0.2gk2HPO4, 0.6gKH2HPO4
0.2gMgSO4.2H2O v à 0.02g CaCl2)
10g
+
Br omothymol blue 0.5% trong KOH 0.2N
5g
+
Chỉnh pH 5.5-6
20g
+

Agar cho môi trường bán đặc 1.8g, môi trường đặc
20g

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13
-

Trường Đại học Cần thơ

Môi trường NFb

3.1.3 Hóa chất dùng để nhộm Gram
- Nước cất vô trùng
- Crystal violet
- Iod
- Fuchsin
- Cồn + acetone
3.1.4 Thiết bị
Sử dụng phương tiện nghiên cứu có tại Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền
Nam.
3.1.5 Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật)
- Kính hiển vi Olympus BH- 2 (Nhật)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000 (Đức)

- Tủ sấy EHRET (Đức)
- Máy khuấy từ (Hoa kỳ)
- Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Đĩa petri; ống nghiệm; bình Erlenmeyer 100ml, 500ml
3.1.6 Một số thiết bị, dụng cụ khác dùng để phân lập và nhận diện vi khuẩn
- Tủ lạnh -200C Electrolux Confor Plus (Thụy Điển)

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

- Tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam)
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
3.1.7

Một số dụng cụ khác như: kính lúp, que cấy, lam, la men, que thuỷ tinh,
kẹp, dao cắt mẫu, cối nghiền mẫu, bình tam giác, cốc đựng dung dịch,
chai lọ thuỷ tinh, ...

3.2 Vật liệu thí nghiệm
Các mẫu đất, rễ dứa(khóm) được thu thập ở vùng canh tác ở Tân Phước, Tiền
Giang, có sự đại diện của 3 nhóm là vi khuẩn tự do, vi khuẩn vùng rễ , vi khuẩn
nội sinh có khả năng tổng hợp được hormone tăng trưởng cho thực vật.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và khảo sát vi sinh vật tổng hợp IAA

3.3.1.1 Phân lập và khảo sát vi sinh vật tổng hợp IAA sống tự do và vùng rễ
Phân lập vi sinh vật trong mẫu đất thu thập
Mô tả thí nghiệm:
Thực hiện phân lập các dòng vi sinh vật từ đất vùng rễ cây khóm
Từ đất vùng rễ được tách riêng và cho vào từng cốc nhỏ có đánh số thứ tự và
để khô tự nhiên trong mát, sau đó nghiền mịn và sàng qua rây 2mm. Cân 1g đất cho
vào 100ml nước cất tiệt trùng để trên máy lắc và lắc 1-2 giờ cho các hạt đất rời ra, vi
sinh vật được phân tán đều trong nước sau đó tiến hành pha loãng nhiều lần bằng
nước cất tiệt trùng (hệ số pha loãng đến 10 -6). Lấy 0.1ml dịch pha loãng ở các lần
pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 và cấy trên môi trường phân lập đặc hiệu vi sinh vật đó là
môi trường isolation agar của hãng Difco có bổ sung Glycerol và chất kháng nấm
(Cycloheximide 50mg/lít). Cấy bằng phương pháp trải đũa thủy tinh. Sau đó để khô
và đặt các đĩa đã cấy vào tủ ủ và ủ ở 300C trong 24 giờ.
Từ đĩa cấy ban đầu tiến hành tách các khuẩn lạc và chọn lọc các khuẩn lạc rời
có hình dạng khác nhau sau đó cấy sang đĩa Petri khác chứa môi trường như trên
bằng phương pháp cấy ria, để phân lập từng dòng vi khuẩn. Tiến hành phân lập cho

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

đến khi các khuẩn lạc tạo ra có dạng đồng nhất, khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ có
một dạng vi khuẩn thì chọn lấy các khuẩn lạc rời rạc để trữ trong ống nghiệm chứa
môi trường trên. Các vi khuẩn thu được và trữ trong từng ống nghiệm tạm được xem
như một dòng. Các ống nghiệm dùng để trữ các dòng vi sinh vật được trữ trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 50C để bảo quản.
3.3.1.2 Thu thập vi sinh vật sống nội sinh

Phân lập vi sinh vật trong mẫu đất thu thập
Mô tả thí nghiệm:
Thu mẫu ở tại địa điểm trồng khóm ở vùng đất Tân Phước, sau đó chuyển về phòng
thí nghiệm công nghệ sinh học của Viện cây ăn quả Tiền Giang, mẫu được rửa sạch
dưới vòi nước mạnh, sau đó dùng dao bén cắt phần rễ, thân, lá để riêng. Sau đó rễ,
thân, lá được khử trùng với cồn 90% , hypochlporid trong 3 phút và rửa lại với nước
vô trùng để loại sạch vi sinh vật và các hóa chất. Sau khi mẫu sạch dùng kéo đã vô
trùng cắt nhỏ khoảng 1cm cho mẫu vào cối với nước vô trùng nghiền mẫu lấy dịch
trích cho vào cốc 50ml, lấy 1ml dịch nghiền rễ, thân, lá lần cho vào ống nghiệm 5ml
môi trường LG (Cavalcante và Dobereiner, 1998), sau đó lấy các nút đậy lại và đem
các ống này vào tủ ủ ở nhiệt độ 28 ±1 0C giữ khoảng 4- 6 ngày, mỗi nghiệm thức
được lập lại 3 lần. quan sát nếu thấy có một lớp màng mỏng có màu trên bề mặt sẽ
có sự hiện diện của vi khuẩn, lần lược chuyển sang môi trường LGI, NKb, RMR đặc
để tách ròng các khuẩn lạc và tiếp tục ủ ở nhiệt độ 28 ±1 0C khoảng 6-7 ngày . Quan
sát các khuẩn lạc để tách ròng các dòng vi sinh vật thông qua hình dạng khuẩn lạc
và màu sắc khuẩn lạc.
3.3.2 Khảo sát khả năng tổng hợp auxin của các dòng vi sinh vật
3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Gram :
- Sau khi chọn lọc các dòng vi khuẩn tổng hợp IAA, ta tiến hành nhuộm Gram các
vi khuẩn ( Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2000 )
- Trình tự nhận Gram được thực hiện như sau :
+ Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật .

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

+ Dùng que cấy đã khử trùng lên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít sinh vật rồi trải mỏng
vi sinh vật lên kính mang vật .
+ Hơ mẫu trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang
vật .
+ Nhỏ từ 1 đến giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố
định, trải đều crystal violet bằng que cấy vã để 2 phút .
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng , chậm nhẹ cho khô nước .
+ Nhỏ từ 1 đến giọt dung dịch rod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô .
+ Rửa lại bằng cồn 700 thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho
đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa .
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
+ Nhỏ từ 1 đến 2 giọt fushin rồt trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút .
+ Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi giọt nước cuối cùng không còn màu của
fushin .
+ Dùng giấy thấm chấm nhẹ cho kính mang vật khô nước .
+ Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận Gram
của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram
dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram
3.3.3 Định danh bằng PCR các loài thu được
3.3.3.1 Ly trích DNA
- Dùng tube chứa 1ml hỗn hợp vi khuẩn để qua đêm, đem ly tâm với vận tốc 13000
vòng/phút trong 10 phút rồi pha trộn trong 1ml nước cất vô trùng .
- Đun sôi trong 10 phút , đem ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút .
3.3.3.2 Dung dịch dùng cho phản ứng PCR .
- Nước cất vô trùng .
- 10 × PCR buffer
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP )
- DNA
- taq polymerase

- primer 1 , primer 2 , primer 3
3.3.3.3 Các bước thực hiện PCR .
- Thiết kế đoạn mới để nhận diện các chủng vi khuẩn ở trên, chúng tôi dùng các
primer :
- Trộn phản ứng PCR ( 25 µl /phản ứng )
+ DNA
1,0 µl
+ 10 × PCR buffer 2,5 µl
+ primer 1
1,0 µl
+ primer 2
1,0 µl

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

+ primer 3
1,0 µl
+ dNTP
1,0 µl
+ Taq
0,5 µl
+ Nước cất vô trùng
1,7 µl
- Thiết lập phương trình PCR .
Giai

Tên giai đoạn
Chu kỳ
Nhiệt độ ( 0 C ) Thời gian
đoạn
1
Biến tính
95
5 phút
2
Biến tính
30
95
45 giây
Bắt cặp
30
58 – 60
45 giây
Kéo dài
30
72
1 phút
3
Kéo dài
72
10 phút
Nguồn kỹ thuật PCR – Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ
sinh học
( Nguyễn Thị Lang, 2002 )
0
- Lưu sản phẩm ở 4 C ( nếu chưa sử dụng ) .

- Các sản phẩm sau khi được khuyết đại bằng PCR tiếp tục đem điện di trên agarose
gel 0,3 – 3% ( Có thêm ethidium promide ) .
- Sau khi chạy điện di xong, chúng tôi quan sát bằng DNA. ( Biorad UV , 2000 ) để
nhận diện các vi khuẩn thu được .
3.4 Phân tích các thành phần trong đất trước khi bố trí thí nghiệm ngoài nhà
lưới :
3.4.1

Phân tích các thành phần dinh dưỡng N; P; K :

3.4.1.1 Kiểm tra protein trong đất bằng phương pháp lowry :
- Phương pháp lowry là phương pháp mở rộng từ phản ứng Biuret, phương pháp dựa
trên những nguyên tắc cơ bản sau:
+ Tạo thành phức hợp của đồng và protein trong dung dịch kiềm.
+ Phức hợp của đồng & protein khử phosphomolybdic-phosphotunystate và tạo
dung dịch có màu xanh đậm.
- Lưu ý khi thực hiện phương pháp này là bước thêm thuốc thử Folin – Ciocalteu.
Có chứa axid phosphomolypdic và axid phosphovolframic các chất này một mặt làm
tăng độ nhạy của phản ứng Biuret, một mặt phản ứng với các gốc tyrosine và
tryptophan trong phân tử protein thuốc thử này chỉ bền khoảng pH axid. Tuy nhiên,
quá trình khử như đề cập ở trên chỉ xảy ra ở pH = 10. Khi thuốc thử Flin – Ciocalteu
được thêm vào dung dịch kiềm của phức hợp đồng – protein, dung dịch cần phải
được trộn ngay lập tức để phản ứng xảy ra trước khi thuốc thử Flin – Ciocalteu bị
phân hủy.
- Phenol có khả năng khử molyldenum trong phức hợp của protein có chứa nhân
phenol và các ion đồng làm tăng cường độ nhạy của phản ứng. Khi được xử lí với
thuốc thử Flin – Ciocalteu, protein tạo màu xanh với cường độ màu tùy thuộc vào

Lê Hà Phương

Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

hàm lượng tyrosine của protein, vì vậy các protein khác sẽ có giá trị cường độ màu
khác.
- Phương pháp này có thể sử dụng để xác định từ 20 – 200mg protein/ml.
3.4.1.1.1 Thuốc thử
- Các dung dịch bovine serum albumin ( BSA ) ở các nồng độ khác nhau 0,2; 0,4;
0,6; 0,8; 1,0 mg/ml.
- Thuốc thử Flin – Ciocalteu. Nếu mua sẵn thì pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1:1
để có nồng độ 1N.
- Thuốc thử A: 1,56g CuSO 4 5H 2 O /100ml nước cất.
- Thuốc thử B: 2,37g Sodium Tartrate/100ml nước cất.
- Thuốc thử C: 2,0g NaOH + 10gNa2CO3 / 500ml nước cất.
- Thuốc thử D: kết hợp & trộn 100ml thuốc thử C với 1ml.
Thuốc thử A với 1ml thuốc thử B theo thứ tự.
- Dung dịch protein có nồng độ chưa biết ( giữa 100 – 200 µl /ml ).
3.4.1.1.2 Thí nghiệm :
- Thêm vào các ống chứa 4ml dung dịch BSA 0,5mg/ml: 80ml dung dịch Natri
dodecyl sulfate ( SDS ) 10% ( w/v ), 40 ml suerose 20% ( w/v ) 80 µl dung dịch Tris
1M ( pH = 8 ) và 16 µl EDTA 0,5M ( pH = 8 ) so sánh kết quả thu được từ các dung
dịch này với đường cong chuẩn xây dựng từ dung dịch chỉ chứa BSA. Từ đó rút ra
kết luận về ảnh hưởng của các chất khác khi chúng nhiễm vào dung dịch protein cần
xây dựng hàm lượng.
- Lấy 1ml thuốc thử D cho vào các ống nghiệm đã được đánh dấu.
- Thêm 100 µl mỗi dung dịch BSA vào 1 ống thuốc thử D và thêm các thể tích khác
của dung dịch chứa protein có nồng độ chưa biết vào các ống nghiệm khác chứa
thuốc thử D, rồi trộn ( Vortex ) ngay lập tức . Lưu ý cần phải có 1 ống chứa mẫu

trắng không chứa BSA, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đọc kết quả OD ở bước sóng 660nm trên máy đo mật độ quang, sử dụng thuốc thử
D làm mẫu trắng.
3.4.2 Phân tích các enzim thủy phân trong đất .
3.4.2.1 Enzim dehydrogenase ( Casida et al., 1964 )
- Thuốc thử :
+ CaCO3
+ 2, 3, 5 TTC (Triphenyl teltrazolium ehloride), 3% TTC hòa tan trong 80ml
nước & thêm nước điều chỉnh đủ 100ml .
+ Methanol, phân tích thuốc thử .
+ TPF (Triphenyl formazan) chuẩn hòa tan:Gồm 100ml TPF, 80 methanol &
thêm methanol điều chỉnh cho đủ 100ml trộn với nhau.
- Lấy 20g đất khô ( < 2mm ) và 0,2g CaCO 3 trộn lẫn với nhau và cho 6g đất đã trộn
vào 3 tube thí nghiệm. Mỗi tube, 1ml có 3% dung dịch của TTC và 2,5 ml nước cất.

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

- Những mẫu đó được ủ ở 37 0C trong 24 giờ. Sau đó thêm vào 10ml methanol. Dung
dịch được thấm qua 1 bông hút nước được bịt kín trên cốc thủy tinh.
- Thêm methanol cho đủ 100ml. Do OD ở bước sóng 485nm .
- Đọc kết quả qua đường cong chuẩn.
3.4.2.2 Enzim phosphomonoesterase (Axid và Alkaline phosphate) (Tabatabai &
Bremner, 1969; Eivazi & Tabatabai, 1977 )
- Thuốc thử :
+ Toluene.

+ Dung dịch MUB ( Modifide universal buffer ):
 12,1g Tris ( hydroxymethyl ) aminomethane ( THAM );
 11,6g Axid malic
 14,0g Axid Citric.
 6,3g H3BO3 trong 488 ml NaOH 1N.
 Và được pha loãng tới 1 lít nước
 Trữ trong tủ lạnh.
+ Dung dịch MUB, pH = 6,5 và 11: Lấy 200ml của MUB khuấy trong cốc
500 ml & lấy đủa khuấy , khuấy đều. Chuẩn độ pH = 6,5 với HCl 1N và thêm nước
cho đủ 1 lít. Chuẩn độ 200ml dung dịch MUB khác tới pH = 11 bởi NaOH 0,1N và
thêm nước cho đủ 1 lít.
+ P-Nitrophenyl phosphate tetrahydrate trong khoảng 40ml của MUB pH = 6
( pH = 11 ) và pha loãng dung dịch tới 50 lần bằng MUB cho giống với pH. Trữ
dung dịch trong tủ lạnh.
+ CaCl2 0,5M: Lấy 73,5g CaCl2. H2O trong 700ml nước sau đó thêm nước
cho đủ thể tích 1 lít.
+ Dung dịch p-nitrophenol chuẩn: Lấy 1,0g p-nitrophenol trong 70ml nước
và thêm nước cho đủ thể tích 1 lít trữ dung dịch trong tủ lạnh.
Lấy 1g đất ở 50ml – Erlenmeyer flask; 0,2 ml toluene và thêm a ml MUB (pH = 6
nếu là axid phosphatase hay pH = 11cho alkaline phosphate), 1ml p-nitrophenyl
phosphate giống như buffer và khuấy trộn vài lần ủ ở 37 0C trong 1 giờ. Sau đó cho
vào 1ml CaCl2 0,5M và 4ml NaOH 0,5M khuấy đều vài lần và lọc. Đo OD ở bước
sóng 420nm.
3.4.2.3 Enzim Urease :

Thuốc thử:
- Dung dịch urê: Hoà tan 2g urê trong 700ml H2O, thêm H2O cho đủ 1000ml
-

Dung dịch phenylmercuric acetat(PMA): Hoà tan 50mg PMA trong một lít

dung dịch PMA.
Dung dịch kali chloride-Phenylmercuric acetat(2M KCl-PMA): Hoà tan
1500g thuốc thử thuốc KCl trong 9 lít nước và thêm một lít dung dịch PMA.
Dung dịch diacetylmonoxime(DAM): Hoà tan 2.5g DAM trong 100ml H2O.
Dung dịch Thiosemicarbazide(TSC): Hoà tan 0.25g TSC trong 100ml H2O.

Lê Hà Phương


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

-

thuốc thử acid: Cho 300ml H3PO4 85% và 10ml H2SO4 vào 100ml H2O sau
đó năng thể tích lên 500ml.
- Thuốc thử màu: Chuẩn bị thuốc thử trước, cho 25ml dung dịch DAM và
10ml TSC vào 500ml thuóc thử acid.
- Dung dịch gốc urê: Hoà tan 0.5g urê trong 1500ml 2M KCl-PMA, pha loãng
đ ê 2 lít. Nếu sử dụng urê nguyên chất khô thì dung dịch này chứa 250µg
urê/ml. Trữ dung dịch này trong tủ lạnh.
Thí nghiệm
- 5g đất được xử lý với 5ml dung dịch urê. Ủ ở 37 oC trong 5 giờ. Thêm vào
5ml 2M KCl-PMA. Lắc trong một giờ. Sau đó, lọc dịch huyền phù đất bằng
Whatman 42.
- Hút từ 1-2ml dịch trích chứa 200µg urê cho vào chai 50ml, nâng thể tích lên
10ml bằng dung dịch 2M KCl-PMA, thêm vào 30ml thuốc thử màu. Lắc vài
giây và đặt vào bình nước đun sôi. Sau 30 phút lấy ra và làm lạnh dưới vòi
nước khoảng 15 phút. Sau đó nâng thể tích lên 50ml và trộn đều. Đo cường

độ màu đỏ bằng quang phổ.
3.5 Phân tích thành phần đất sau khi tiến hành thí nghiệm
- Phân tích thành phần đất sau 1 tháng
- Phân tích thành phần đất sau 2 tháng
- Phân tích thành phần đất sau 3 tháng
3.6

Khảo sát ảnh hưởng của dòng vi sinh vật thu được trên cây trồng trong
điều kiện invitro và nhà lưới :

3.6.1 Cách bố trí thí nghiệm trong phòng lab :
- Thử nghiệm tiến hành trên cây khóm, chủng vi sinh vật với 3 mật số khác nhau.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại.

Mẫu
NT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Lê Hà Phương

15


Đề cương luận án thạc sĩ k13

Trường Đại học Cần thơ

Đối
chứng
Chủng
vi sinh
vật mật
số 1

Chủng
vi sinh
vật mật
số 2
Chủng
vi sinh
vật mật
số 3
3.6.2 Cách bố trí thí nghiệm trong nhà lưới :
- Sau khi thử nghiệm ở phòng lab ta tiến hành thí nghiệm ngoài nhà lưới.
- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại.
Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Đối chứng
Chủng nồng
độ 1
Chủng nồng
độ 2
Chủng nồng
độ 3

Lê Hà Phương