Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được từ tôm hùm ở khánh hòa

i

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà tôi đã hoàn
thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc và
chân thành đến:
Trước hết là ThS. Lê Phương Chung, người trực tiếp hướng dẫn đề tài.
Trong suốt thời gian thực hiện, thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh
nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn
thành đồ án đúng định hướng ban đầu.
Sau đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Duy, Viện
phó, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận
tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án này. Đồng thời bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại
học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường
thuận lợi, cung cấp đầy đủ thiết bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách xuyên
suốt.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, chị
Nguyễn Minh Nhật, và các anh chị cao học.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả
mọi người sức khỏe thành đạt.


ii

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 2
Chƣơng I. TỔNG QUAN 4
1.1. Bacteriocin 4
1.1.1 Khái niệm 4
1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 4
1.1.3 Phân loại 6
1.1.4 Tính chất của bacteriocin 13
1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 15
1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin 16
1.2. Tôm hùm 19
1.2.1 Phân bố 20
1.2.2 Tập tính 20
1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng 21
1.2.4 Đặc điểm sinh sản 22
1.2.5 Giá trị của tôm hùm 22
1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin 23
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1 Nguyên liệu 28
2.1.2 Mẫu tôm hùm 28
2.1.3 Chủng chỉ thị 28
2.1.4 Môi trường hóa chất và thuốc thử 28
iii

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
2.1.5 Thiết bị chuyên dụng 29
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30
2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 32

2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin 34
2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 38
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm 44
3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập 45
3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin 47
3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 48
3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 50
3.5.1 Khả năng chịu muối 50
3.5.2 Thử catalase 51
3.5.3 Tính di động 52
3.5.4 Khả năng sinh hơi 53
3.6 Định danh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 53
Chƣơng IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54
4.1 Kết luận 54
4.2 Kiến nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC 58

iv

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I 5
Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II 6
Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16] 9
Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20] 12
Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi vi khuẩn 14

Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phân lập được 44
Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 46
Bảng 3.4: Khả năng chịu muối của N14 50


v

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của nisin 7
Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P 10
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin 16
Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I 18
Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II 19
Hình 1.6: Tôm hùm Bông 22
Hình 2.1: Quy trình thực hiện 31
Hình 2.2: Trình tự pha loãng 32
Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị 35
Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 36
Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin 37
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định đặc điểm vi khuẩn 38
Hình 3.1: Các chủng vi khuẩn ở nồng độ 10
-3
44
Hình 3.2: Kết quả của 12 chủng nổi bật đối kháng với chủng Bacillus B1.1 45
Hình 3.3 : Thử nghiệm với enzyme proteinase K và α-chymotripsin 48
Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14 49
Hình 3.5 : Khả năng chịu muối của chủng N14 51
Hình 3.6 : Khả năng sinh catalase của N14 52

Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 52
Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14 53





vi

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

STT
Kí hiệu viết tắt
Nghĩa
1
TSB
Tryptone Soya Broth
2
TSA
Tryptone Soya Agar
3
BC
Bacterial Cellulose
4
LAB
Lactic Acid Bacteria
5
ATP
Adenosine Triphosphate

6
DNA
Acid Deoxyribo Nucleic
7
HPK
Histidine protein kinase
8
RR
Response regulator

2


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
LỜI MỞ ĐẦU

Vào thời kỳ khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, nhiều nhà khoa học
đã nghiên cứu và phát hiện ra chất kháng sinh. Từ thế kỷ 17, một thầy thuốc Hoàng
gia Anh đã biết cách chữa bệnh bằng cách dùng rêu áp lên vết thương, hay dùng
mẫu bánh mì để chữa trị thương tích. Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ ―chất
kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm
hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh,
và một số nhà khoa học khác đã phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của một vài
chủng vi sinh vật. Vào năm 1929, khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh
penicillin từ nấm Penicillium notanum, có khả năng ức chế vi khuẩn sự sinh trưởng
của các loại vi khuẩn, được ứng dụng để chữa trị các bệnh nhiễm trùng trên phạm vi
rộng.
Việc tìm ra thuốc kháng sinh của Alexander Fleming đã mở ra bước ngoặc
mới cho y học loài người. Chỉ với một số lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi
sinh vật của penicillin rất cao. Thuốc kháng sinh không chỉ được ứng dụng trong

điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật
nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt;
tetracycline, oromycine… để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa
của thịt cá, tôm). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng
kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn.
Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận
thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại
thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn
cho thực phẩm. Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía
người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn
thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các
chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên.
3


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn
mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực
phẩm. Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có
bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không
gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị
ứng cho con người, an toàn với sức khỏe. Đó là một sự lựa chọn được xem là có
nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài
“ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin
phân lập đƣợc từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập
chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển
chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh
bacteriocin.
Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây:

- Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm.
- Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm có khả năng sinh
bacteriocin.
- Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được.
- Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng
phương pháp sinh học phân tử.






4


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Chƣơng I. TỔNG QUAN
1.1. Bacteriocin
Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu
của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của
Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến
những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của
colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở
những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được
nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp. và
Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia
tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu
bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an
toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm[12],[23].
1.1.1 Khái niệm

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng
hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn
khác có quan hệ gần gũi với chúng. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào
thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị
ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym
proteinase, lipase.
1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm :
- Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước,
nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương.
- Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở
vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo
5


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm .
Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn
Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu
về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến
hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này. Ba chủng vi
khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là
Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp.
Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu
nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an
toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi
proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người.

Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây
hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây
ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên
plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền.
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt
tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu
cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm.
Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I
Bacteiocin
Vi khuẩn
Nisin A
Nisin Z
Mutacin 1140
Carnocin U149
Cytolysin
Lacticin 481
Lactocin S
Salivaricin A
Mersacidi
Lactococcus lactis (nhiều chủng)
Lactococcus lactis (nhiều chủng)
Streptococcus mutans JH1000
Carnobacterium piscicola 149
Enterococcus faecalis DS16
Lactococcus Lactis CNRZ481
Lactobacillus sake L45
Streptococcus Salivarius 20P3
Bacillus spp

6


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II
Bacteiocin
Vi khuẩn
Bavaricin A
Bavaricin MN
Carnobacteriocin B2
Carnobacteriocin BM1
Curvacin A
Divercin V41
Enterocin A
Enterocin P
Leucocin A/B –Talla

Mesentericin Y105
Acidocin J1132
Lactacin F
Lacticin 3147
Lactobin A
Lactococcin G
Divergicin A
Lactococcin A –
Plantaricin 1.25β
Lactobacillus sake MI401
Lactobacillus sake MN
Carnobacterium pisciocola LV17B
Carnobacterium pisciocola LV17B

L. curvatus LTH1174
Carnobacterium pisciocola divergens V41
Enterococcus faecium CTC492/T136
Enterococcus faecium P13
Leuconostoc gelidum UAL187; Leuconostoc
carosum Talla
Leuconostoc mesenteroides Y105
L. acidophilus JCM 1132
L. johnsonii 11088
Lc. lactis DPC3147
L. amylovorus LMG P-13139
Lc. latis LMG2081
Cb. divergens LV13
Lc. lactis subsp. cremoris LMG 2130
L. plantarum TMW


1.1.3 Phân loại
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc
phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề
tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau.
Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và
cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [20]. Trong đó, phương pháp phân loại được
chấp nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp
III và lớp IV. Hai nhóm bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và
nghiên cứu nhiều hơn hơn hai nhóm còn lại.

7

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.3.1 Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa),
bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này là nisin.
Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc.
 Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương,
chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các
lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [24]. Nisin cũng thuộc
nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 aminoacid, các loại acidamin
phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan),
didehydroalanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb). Nisin có 2 biến thể
của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z. .





Hình 1.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005)
Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic,
được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram
(+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng
ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả
đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của
Bacillus spp. và Clostridium spp. [24]. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực
phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm
chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium .Nisin cũng được
ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [10].

8


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
 Phân lớp Ib
Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích
điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh
tổng hợp peptidoglycan [11], gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi
khuẩn nhạy cảm. Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng
của vi khuẩn. Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như mersacidine ,
actagardin, cinnamycin, mutacin A [20]





9


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16]

Bacteriocin
Khối lượng
phân tử (kDa)
Amino
acids
Vi sinh vật sản xuất
Lantibiotic
Actagardine

Ancovenin
Cinnamycin
Duramycin
Epidermin
Gallidermin
Lanthiopeptin
Mersacidin
Nisin
Pep5
Subtilin

1,9
2,0
2,0
2,0
2,2
2,2
2,0
1,8
3,4
3,5
3,3

19
19
19
19
22
22
19

19
34
34
32

Actinoplanes spp.
Streptomyces spp.
Streptomyces cinnamoneus
Streptomyces cinnamoneus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus gallinarum
Streptoverticullum cinnamoneum
Bacillus sp.
Lactococcus lactis
Staphylococcus epidermidis
Bacillus subtilis

Cystibiotics
Pediocin AcH/PA1
Leucocin A/UAL 187
Mesentericin Y 105
Sakacin A
Sakacin P
Lactacin F
Carnobacteriocin A
Carnobacteriocin BM1
Carnobacteriocin B2
Cerein 7/8

4,6

3,9
3,8
4,3
4,4
5,6
5,1
4,5
4,9
4,9

44
37
37
41
43
57
53
43
48
56

Pediociccus acidilactici H/PAC 1.0
Leuconostoc gelidium UAL 187
Leuconostocmesenteroides Y 105
Lactobacillus sake LB 706
Lactobacillus sake LTH 674
Lactobacillus acidophilus 11088
Carnobacterium piscicola LV 17 A
Carnobacterium piscicola LV 17 B
Carnobacterium piscicola LV 17 B

Bacillus cereus Bc7

Thiolbiotics
Lactococcin B

5,3

47

Lactococcus lactic subsp. cremoris 9 B4

No cysteine
Lactococcin A


Lactococcin M
a
Lactococcin N
a
Lactococcin Gα
a
Lactococcin Gβ
a

5,8


4,3
4,4
4,3

4,1

54


48
47
39
35

Lactococcus lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris LMG 2130
L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis
WM4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. lactis LMG 2081
L. lactis subsp. lactis LMG 2081
10


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.3.2 Lớp II
Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin
nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc.
 Lớp IIa
Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện
đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1. Các sakacin A, sakacin P
cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này. Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng

cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cân bằng và thất thoát ion
phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn [20].
Sakacin A là bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 706, được
cấu tạo bởi 41 acid amin (tiền thân là 90 acid amin). Bacteriocin này là một
polypeptide ổn định nhiệt, mang đặc tính di truyền[9].
Sakacin P là một polypeptide nhỏ, ổn định nhiệt, được tổng hợp bởi
ribosome, mang đặc tính di truyền [15], được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB
673.

Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P

Các bacteriocin này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng cộng nghiệp nhờ vào hoạt
động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng
11


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin). Sakacin được ứng dụng
trong sản xuất xúc xích, xử lý ở các sản phẩm thịt để giữ được lâu (như sản phẩm
jăm bông [18]và thịt đông lạnh [21]), pho mát, các sản phẩm lên men acid lactic
khác. Ngoài ra, còn được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn không mong
muốn, có thể là nguyên nhân gây nhớt và gây mùi ở các sản phẩm.
 Lớp IIb
Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide
này ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptide
bổ sung. Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ, cũng có thể liên hiệp
khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A, L50B) tạo lỗ trên màng tế bào, hoặc
chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn (lactococcins Gα/Gβ,
Lactococcins M/N và plantaricins EF, JK). Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này
là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK.

Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổ
sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ. Lactococcin Gα gồm có 39 acid amin,
còn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin. Bactericoin này được sử dụng như một
chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis.
Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của cả 2 peptid, mặc dù 2
peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập.
 Lớp IIc
Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng
nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Nhóm IIc bao gồm tất
cả các bacteriocin lớp II không rơi vào nhóm IIa, IIb. Trong phân lớp này tìm thấy
có 2 dạng [20]:
- Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một và
cystibiotics có 2 gốc cystein).
- Kháng khuẩn không có cystein (lactoccin A và acidocin B)

12


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20]
Bacteriocin
Vi sinh vật sản xuất
Khối lượng
phân tử(Da)
Amino
acid
Gốc
cystein
Cerein 7/8
Enterocin B

Carnobacteriocin A
Lactococcin A
Lactococcin B

Divergicin A
a
Acidocin B
a
Bacillus cereus Bc7
Entrococcus faecium T136
Entrococcus faecium CECT492
Carnobacterium piscicola
LV17A
Lactococcus lactis LMG2130
Lactococcus cremoris 9B4
Lactococcus lactis WM4
Carnobacterium divergens
LV13
Carnobacterium acidophilus
M46
4893
5465

5053
5778
5328

4224
5754

56
53

53
54
47

46
59
2
2

2
0
1

2
0

1.1.3.3 Lớp III
Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa,
không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi
khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp
III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus [24].
Đại diện cho nhóm này là halveticin J [17] được sản xuất bởi vi khuẩn L. halveticus
481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin A, lactacin B được sản xuất bởi L.
acidophilus.
13

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.3.4 Lớp IV
Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này. Một cách tổng quát các
bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứa lipid hoặc
carbohydrate moities. Bao gồm các glycoprotein (lactocin 27), hoặc lipoprotein
(lacstrepcins) được quy định bởi non-protein. [20]
1.1.4 Tính chất của bacteriocin
1.1.4.1 Thành phần hóa học
Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của protein
với các chất khác. Để kiểm tra bản chất protein, người ta sử dụng các enzyme đặc
trưng như proteinase. Dựa vào bảng phân tích hóa học cho thấy một vài bacteriocin
là protein đơn giản. Tuy nhiên, trong khi làm sạch bacteriocin của Staphylococcus,
Clostridium và Lactobacillus cho thấy là những phân tử phức tạp với thành phần
lipid, hydratcarbon và cộng thêm với protein. Một ví dụ khác về phân tử bacteriocin
có nhiều thành phần, streptocin STH1 là một trong những phân tử phức tạp bao
gồm protein, lipid và nhóm gốc phosphate.
1.1.4.2 Độ bền
 Độ bền nhiệt
Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng các loại bacteriocin của những
loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau. Mỗi loài có khả năng chịu
nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II. Chủng
ST28MS và ST26MS được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum không giảm khả
năng hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút tại 100
0
C hay 20 phút tại 121
0
C. Hay
đặc điểm tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin.
 Độ bền pH
Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới những

khoảng pH nhất định. Chủng ST28MS và ST26MS ngoài có độ bền nhiệt cao,
chúng lại có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12. Những
đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó. Độ bền
nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Tùy
14


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ
sung và sao cho phù hợp với mục đích sản xuất.
 Độ bền enzyme
Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các aminoacid khác nhau nên sẽ
chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau, thích hợp với nó. Khi bị phân
cắt bởi các enzyme này sẽ khiến bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn. Đồng
thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được đó có phải là bacteriocin không.
Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi
vi khuẩn Gram dương được trình bày ở bảng sau.
Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi vi khuẩn

Bacteriocin
Độ bền nhiệt
Độ bền pH
Enzyme thủy phân
Megacin A-216
60
0
C, 30 phút
2 – 7
Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin

Clostosin A
100
0
C, 30 phút
4 – 9
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pronase P, Rnase
Clostosin B
80
0
C, 10 phút
4 – 9
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pronase P, Rnase
Clostosin C
80
0
C, 10 phút
4 – 9
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pronase P, Rnase
Clostosin D
100
0
C, 30 phút
4 – 9
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pronase P, Rnase
Boticin E-S5
100

0
C, 10 phút
1,1 – 9,5
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pepsin
Bioticin P
60
0
C, 30 phút
6,5 – 7,5
Trypsin, Rnase, Alkaline
phosphotase, Phospholipases C, D
Butyricin 7423
100
0
C, 10 phút
2 – 12
Trypsin
Perfringocin 11105
100
0
C, 30 phút
2 – 12
Trypsin
15


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.4.3 Tính miễn dịch
Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều

bacteriocin có tính kháng nguyên cao. Tuy nhiên, hiện nay chỉ có duy nhất một vài
bài báo cáo nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi vi khuẩn Gram
dương. Megacin A-216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể
có khả năng chống lại ảnh hưởng giết chính nó. Việc nghiên cứu những kháng thể
đến bacteriocin trong huyết thanh của con người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho
những nghiên cứu sau này.
Một thuộc tính cần thiết để bảo đảm sự sống sót của vi sinh vật sinh
bacteriocin là có sự miễn dịch đặc biệt. Theo Koponen (2004) tế bào vi khuẩn có
một số cơ chế miễn dịch, đây là khả năng của tế bào trong việc bảo vệ chính nó để
chống lại bacteriocin sinh ra bởi sự trao đổi của chính mình.
Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo màng lipid của vi khuẩn cho
thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như sự kháng cự bacteriocin.
Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những bacteriocin đáng kể.
Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa những gen khác nhau,
những loài cùng bộ gene và thậm chí đến môi trường nuôi cấy từ những điều kiện
ngoại cảnh khác .
Có hai kiểu miễn dịch được thấy ở Lantibiotic. Một kiểu miễn dịch dựa vào
protein miễn dịch đặc trưng, LanI. Trong khi kiểu miễn dịch khác dựa vào vật
chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (Lan EFG). Bacteriocin sẽ nhận biết được
những vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ thể đặc biệt
và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinh vật đó[14].
1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin
1.1.5.1 Phạm vi hoạt động
Phạm vi hoạt động của bacteriocin được xem xét dựa trên phạm vi kháng
khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tính chất hóa sinh
và kiểu hoạt động của bacteriocin. Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp bởi vi
khuẩn Gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng. Đối với bacteriocin được
16

SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loài vi khuẩn Gram
dương đôi khi nó cũng ức chế một số loài vi khuẩn Gram âm.
1.1.5.2 Cơ chế hoạt động
Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh
làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng
phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Một loại bacteriocin là Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trên những tế
bào nhạy cảm bởi sự tuong tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên
màng tế bào tạo ra những kênh cho K
+
và phosphate vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong
sự nổ lực để tái tích lũy lại những ion này, các ATP sẽ bị thủy phân. Khi ATP được
yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng trong tế bào, như gradient
pH tại màng tế bào , thì đã không còn nữa, những chức năng sẽ bị phá vỡ và tế bào
dần mất năng lượng và chết [13],[1].
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin(Nguồn Fidel Toldrá, 2009)
1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin
Vì bacteriocin có bản chất là polypeptide nên sinh tổng hợp theo cơ chế của
sinh tổng hợp protein nhờ ribosome.
17


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Trong tế bào vi khuẩn có mang các gene mã hóa cho các protein tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. Qua quá trình phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra
các protein đi vào giai đoạn tạo ra bacteriocin hoàn chỉnh, giải phóng nó ra khỏi tế
bào vi khuẩn. Tuy nhiên vì hoạt tính ức chế/tiêu diệt vi khuẩn của bacteriocin nên
nó cũng có thể tác động ngược trở lại lên vi khuẩn sản xuất ra nó, do đó vi khuẩn
sản xuất đòi hỏi phải có protein miễn dịch, giúp nó miễn dịch khỏi tác động của

bacteriocin do chính nó tạo ra.
Các loại gen khác nhau được quy định cho việc tổng hợp bacteriocin:
- Gene tạo ra chất tiền thân của bacteriocin: pre – bacteriocin.
- Gene tạo miễn dịch cho chủng sản xuất (immunity gene)
- Gene mã hóa kênh vận chuyển cho pre – bacteriocin ra khỏi tế bào kích hoạt cơ
chế vận chuyển đặc biệt (kênh vận chuyển ABC – ABC transporter)
- Gene kích hoạt cơ chế tạo ra protein tiếp nhận thông tin (accessing protein), giữ
vai trò quan trọng vận chuyển và kích hoạt hoạt động kháng khuẩn của
bacteriocin khi bacterocin được xuất ra khỏi tế bào (từ pre – bacteriocin thành
bacteriocin). Ngoài ra còn có những gene khác trong sinh tổng hợp bacteriocin
được tìm thấy ở nhóm II.
Khi gặp vi khuẩn đối nghịch, để tổng hợp ra bacteriocin tiêu diệt/ức chế vi
khuẩn đối nghịch cần phải có cơ chế điều hòa tổng hợp bacteriocin, đó chính là
operon.
Gene điều hòa (Promoter) – trình tự nucleotide để 1 gene được phiên mã.
Promoter được nhận diện bởi RNA polymerase, bắt đầu quá trình phiên mã mRNA.
Trong tổng hợp RNA, promoter chỉ thị gene nào cần được sử dụng để tạo mRNA,
do đó kiểm soát tế bào tạo ra protein nào, protein ức chế để gắn vào gene chỉ huy
hay protein cần cho tế bào hoạt động.
Gene chỉ huy (Operator) – một đoạn DNA để protein kìm hãm gắn vào, do
đó ngăn cản RNA polymerase phiên mã gene.
Gene cấu trúc (Structural gene) – các gene được điều hòa tổng hợp bởi
operon. Quay trở lại cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin, trên gene cấu trúc có mang
18


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
thông tin để phiên mã tạo mRNA chứa thông tin tạo ra pre-bacteriocin (tiền
bacteriocin) cũng như các gene khác như gene miễn dịch (giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi
tác động tiêu diệt/ức chế của bacteriocin do chính nó tạo ra) mRNA sau đó cùng

với ribosome, tRNA đi vào quá trình dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, protein miễn
dịch
Sau khi quá trình phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, dưới tác động
của các enzyme trong tế bào chất, pre-bacteriocin khi được giải phóng ra khỏi màng
tế bào được cắt bỏ leader peptide để tạo thành bacteriocin hoàn chỉnh có khả năng
kháng khuẩn và được vận chuyển ra khỏi màng thông qua hệ thống vận chuyển
ABC. Vai trò của leader peptide trong pre-bacteriocin là để bảo vệ vi khuẩn chính
nó khỏi tác động tiêu diệt của bacteriocin trong khi tạo ra nó.
Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I (Nguồn P.Michael Davidson, 2005)
Mỗi nhóm bacteriocin sẽ có một cơ chế sinh tổng hợp khác nhau. Ở nhóm 1,
được tóm tắt như sau (hình 1.4 ):
1. Hình thành tiền bacteriocin
2. Tiền bacteriocin được biến đổi bởi LanB và LanC, được dịch mã thông
qua kênh vận chuyển ABC-transporter LanT, và được xử lý bởi LanP, kết
quả tạo ra được bacteriocin trưởng thành.
3. HPK nhận diện sự hiện diện của bacteriocin và tự động phosphoryl hóa.
19


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
4. Nhóm phosphoryl được truyền đến nhân tố đáp ứng điều hòa RR
5. RR phiên mã gen điều hòa.
6. Sản phẩm chất kháng khuẩn.

Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II(Nguồn P.Michael Davidson, 2005)
Khác với nhóm I, ở nhóm II ban đầu sẽ hình thành bacteriocin và IF (một
peptide có cấu trúc giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn) do đó
HPK phải nhận diện IF để truyền tín hiệu đến RR để kích hoạt tiếp quá trình phiên
mã, tạo được bacteriocin hoàn chỉnh. (hình 1.5 )
1.2. Tôm hùm

Tôm hùm là tên gọi chung của nhóm giáp xác mười chân thuộc 4 họ:
Palinuridae, Scyllaridae, Nephropidae và Synaxidae, giữa chúng có những điểm
đặc trưng về tập tính và môi trường sống. Với sự phong phú về thành phần giống
loài, chúng tạo nên mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và có vai trò thiết yếu
trong hệ sinh thái của biển và đại dương. Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định
được 9 loài thuộc họ tôm hùm Gai (Palinuridae), 9 loài thuộc họ tôm Mũ Ni
(Scyllaridae) và 4 loài thuộc họ Nephropidae. Trong đó, một số loài thuộc họ tôm
hùm Gai được nuôi phổ biến hiện nay như tôm hùm Bông (tôm hùm Sao, tôm hùm
20


SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Hèo), tôm hùm Đá (xanh chân ngắn), tôm hùm Đỏ (hùm lửa), tôm hùm Sỏi (xanh
chân dài, hùm ghì), tôm hùm Tre (Tề Thiên).
Hệ thống phân loại tôm hùm
Ngành Arthropoda
Lớp Malacostraca
Bộ Decapoda
Phân bộ Pleocyemata
Nhóm Palinura
Họ Paliniridae
Giống Panulirus
1.2.1 Phân bố
Trên thế giới tôm hùm phân bố chủ yếu ở các vùng biển Nhiệt đới đến Á
nhiệt đới như: Úc, Ðài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-si-a,…
Ở Việt Nam, tôm hùm phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung từ Quảng
Bình đến Bình Thuận, đặc biệt phân bố nhiều ở các tỉnh Khánh Hoà, Ninh Thuận và
Bình Thuận.
Phân bố theo độ sâu: Tùy vào giai đoạn phát triển và tùy vào từng loài mà
chúng phân bố theo độ sâu khác nhau. Ở giai đoạn trưởng thành tôm hùm bông

thường phân bố ở độ sâu từ 20m trở lên, ở giai đoạn ấu trùng và con non chúng
thường phân bố ở các bãi rạn, đá san hô ở độ sâu từ 2 - 10m nước.
Tôm hùm thường sống ở các bãi rạng đá, rạng san hô nơi có nhiều hang hốc,
khe rãnh ven biển. Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu là ở tầng đáy với chất
đáy sạch, không bùn. Ban ngày trú ẩn trong các hang đá ít hoạt động, ban đêm hoạt
động tích cực tìm mồi.
Tôm hùm sống thích hợp ở các vùng biển có độ mặn từ 30 -36 ‰, nhiệt độ
từ 25 – 32
o
C.
1.2.2 Tập tính
Tôm hùm là loại động vật ăn tạp, trong tự nhiên chúng ăn chủ yếu là các loại
động vật như: Cá, tôm, cua ghẹ, cầu gai, giáp xác nhỏ, nhuyễn thể, ngoài ra còn ăn