Nghiên cứu khả năng tinh sạch sơ bộ và bảo quản lạnh đông enzyme cellulase từ trichoderma sp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUỲNH NGỌC DUY
MSSV: 2071800

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ
BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE
TỪ TRICHODERMA SP

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ
BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE
TỪ TRICHODERMA SP

Giáo viên hướng dẫn
Ths. Nguyễn Thị Thu Thủy

Sinh viên thực hiện
Huỳnh Ngọc Duy
MSSV: 2071800
Lớp: CNTP 33

Cần Thơ, 2011


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp là cơ hội giúp cho sinh viên vận dụng
những kiến thức đã học để thực hiện nghiên cứu khoa học cho riêng mình. Đây
đồng thời cũng là thách thức lớn cho sinh viên để rèn luyện kĩ năng làm việc một
cách độc lập và khoa học. Sau hơn ba tháng thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp,
mặc dù gặp không ít những khó khăn, ngoài sự cố gắng của bản thân thì sự giúp đỡ
và động viên kịp thời của thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp em hoàn thành quá
trình nghiên cứu và đạt được những kết quả mong muốn. Em xin chân thành gởi lời
cảm ơn của mình đến:
Cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức chuyên
môn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt
những kiến thức quý báu trong thời gian em học ở trường.
Con xin cảm ơn ba, mẹ đã tạo mọi điều kiện để con có thể học tập và nghiên cứu và
luôn động viên con trong những lúc con khó khăn.
Tôi cũng xin cảm ơn các bạn và các chị ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện luận văn.
Cần Thơ, ngày 1 tháng 5 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Ngọc Duy

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Các chể phẩm enzyme thô thu được thường còn lẫn rất nhiều tạp chất nên hiệu quả sử
dụng không cao. Vì thế đề tài tiến hành nhằm tinh sạch sơ bộ một phần chế phẩm enzymen
cellulase thô từ Trichoderma sp nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho việc sử dụng ở
các bước tiếp theo. Ngoài ra, đề tài còn khảo sát khả năng bảo quản lạnh đông chế phẩm
enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme celulase thô từ Trichoderma sp bằng ethanol
với tỷ lệ giữa ethanol và dịch chiết enzyme thô là 3:1 (w/v) là tốt nhất, thể hiện ở hoạt tính
riêng là 0,110 U/mgprotein,hiệu suất thu hồi đạt 46,414% và độ tinh sạch tăng gấp 4,593 lần
so với mẫu enzyme thô . Sau khi tinh sạch sơ bộ, enzyme được bảo quản lạnh đông ở nhiệt
độ -20oC. Ở nhiệt độ này, sau 4 tuần bảo quản, hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng
muối (NH4)2SO4 có sự giảm hoạt tính nhẹ so với hoạt tính của enzyme được gây tủa bằng
ethanol (hoạt tính riêng giảm từ 0,065 U/mgprotein xuống còn 0,046 U/mgprotein , giảm
khoảng 1,4 lần), còn phần enzyme được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol thì hoạt tính riêng
thay đổi không đáng kể sau 4 tuần (hoạt tính riêng giảm từ 0,070 U/mgprotein xuống còn
0,055 U/mgprotein , giảm khoảng 1,27 lần).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................... ii
TÓM TẮT.......................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................ iii
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................ v
DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................ vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU............................................................................................ 1
1.1

Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU....................................................................... 2
2.1

Sơ lược về enzyme cellulase .............................................................................. 2

2.1.1 Phân loại enzyme cellulase.............................................................................. 2
2.1.2 Một số đặc tính của cellulase từ vi khuẩn ....................................................... 2
2.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase ............................................................ 3
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme............................... 4
2.1.5 Trung tâm hoạt động của enzyme .................................................................. 10
2.1.6 Ứng dụng của enzyme cellulase..................................................................... 10
2.2

Sản xuất enzyme cellulase từ vi sinh vật........................................................ 11

2.3

Tinh chế enzyme cellulase ............................................................................... 13

2.3.1

Kết tủa bằng muối ammonium sulfate .......................................................... 13

2.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ....................................................................... 14
2.4

Ly tâm ............................................................................................................... 14

2.5

Một số nghiên cứu có liên quan ...................................................................... 14

2.5.1 Nước ngoài..................................................................................................... 14
2.5.2 Trong nước..................................................................................................... 15
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16

3.1

Phương tiện ...................................................................................................... 16

3.1.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................... 16
3.1.2 Nguyên liệu. ................................................................................................... 16
3.1.3 Thiết bị và hóa chất ....................................................................................... 16
3.2

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 17

3.3

Nội dung và bố trí thí nghiệm......................................................................... 17

3.3.1 Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến
khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp ............................................. 17

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

3.3.2 Thí nghiệm 2. Khảo sát sự biến đổi hoạt tính và hàm lượng protein theo thời
gian bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông. ........................................................................ 18
3.3

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu .......................................................... 18

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 19
4.1
Ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme
cellulase từ Trichoderma sp ........................................................................................ 19
4.1.1 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp bằng
ammonium sulfate..................................................................................................... 19
4.1.2 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp bằng
ethanol ...................................................................................................................... 21
4.3
So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase thô theo hai phương pháp kết
tủa protein khác nhau ................................................................................................ 22
4.4
Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến sự ổn định của enzyme cellulase sau
các bước tinh sạch sơ bộ............................................................................................. 23
4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết
tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản ................................................. 23
4.4.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết
tủa với ethanol theo thời gian bảo quản ................................................................... 23
CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 25

5.1

Kết luận............................................................................................................. 25

5.2

Đề nghị .............................................................................................................. 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 26
PHỤ LỤC......................................................................................................................... vii

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase.......................................... 12
Bảng 2: Hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4 20
Bảng 3: Hiệu quả tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa với ethanol..... 21
Bảng 4: Kết quả so sánh hai phương pháp kết tủa khác nhau .......................................... 22
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết
tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản.......................................................... 23
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết
tủa với ethanol theo thời gian bảo quản............................................................................ 24

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang v

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose .......................... 4
Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng........................................ 5
Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng enzyme ........................... 5
Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme ................................... 6
Hình 5. Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng của enzyme ........................................... 7

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ enzyme đang phát triển rất nhanh và được sử dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp khác nhau. Bởi đây là chất xúc tác đặc hiệu, có tính ưu
việt hơn các chất xúc tác khác. Ngành công nghiệp enzyme hiện nay không những
khai thác enzyme từ động vật, thực vật mà còn tiến thêm một bước xa hơn là khai
thác chúng từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Bên cạnh đó, vi sinh vật là sinh
vật duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzyme quy mô công nghiệp, vì vi

sinh vật có tốc độ sinh sản rất nhanh, cho enzyme có hoạt tính cao, nguồn nguyên
liệu ban đầu rẻ tiền và dễ tìm. Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển
khai trên quy mô công nghiệp vì những hạn chế về sinh lí, kĩ thuật, giá thành…
Trong các ngành công nghiệp hiện nay, các enzyme được sử dụng nhiều như:
amylase, pectinase, protease, cellulase, polyphenoloxydase,…Trong đó, enzyme
cellulase được sử dụng rộng rãi trong: công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn gia
súc, sản xuất giấy, xử lí môi trường,… Enzyme này được sản xuất từ nhiều nguồn
vi sinh vật khác nhau như: nấm mốc (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Penicillium
spp,…), vi khuẩn (Acetobacter, Bacillus,…), xạ khuẩn (Actinomyces spp,
Thermomonospora,…) (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Hữu Phúc, 1996). Và đây
cũng là enzyme được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với các
enzyme amylase và protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Các ngành công nghiệp nước ta đang phát triển nhanh nên nhu cầu sử dụng enzyme
rất cao. Nhưng công nghệ sản xuất trong nước chưa đáp ứng được nhu cầu đó nên
chúng ta phải nhập nguồn enzyme từ nước ngoài với giá thành cao gây không ít khó
khăn cho việc sử dụng rộng rãi.
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme
cellulase được tổng hợp từ Trichoderma sp bằng muối ammonium sulfate và cồn
nhằm loại bỏ những tạp chất có lẫn chế phẩm enzyme thô để tăng hoạt tính, hiệu
quả sử dụng và tính kinh tế.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu đề tài nghiên cứu những vấn đề sau:
- Khảo sát nồng độ muối ammonium sulfate bão hòa và tỉ lệ ethanol thích
hợp cho việc tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase với hoạt tính cao nhất.
- Xác định sự thay đổi hoạt tính, hàm lượng protein của enzyme cellulase
trong điều kiện bảo quản lạnh đông theo thời gian.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 1

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1

Sơ lược về enzyme cellulase

2.1.1 Phân loại enzyme cellulase
Enzyme cellulase tham gia phản ứng phân hủy cellulose. Phức hệ enzyme này được
các nhà khoa học phân ra thành ba nhóm chủ yếu sau:
- Endoglucanase (EG), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là: Endo-1,4β -D-glucan-4 glucanohyrolase, EC 3.2.14. Enzyme này tham gia phân giải liên kết
β -1,4 glucoside trong cellulose, trong lichenin và β -D-glucan. Sản phẩm của qua

trình phân giải này là: cellodextrin, cellobiose, glucose. Chúng tham gia tác động
mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh. Enzyme này
còn có một số tên khác như: endocelulase, endo 1,4- β -glucanase, CMC-ase và Cxcellulase.
- Cellobiohydrolase (CBH), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là:1,4β -D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91. Enzyme này phân cắt liên kết β -1,4glucoside ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc cellodextrin để giải
phóng cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose dạng kết tinh
mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lí của chúng, giúp cho endocellulase bị phân hủy.
Enzyme này còn có một số tên khác như: exoglucanase, exocellulase,
cellobiosidase.
- β -glucosidase (BGL), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là: β -Dglucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21. Enzyme này tham gia phản ứng phân hủy
cellobiose và các cellodextrin phân tử thấp tạo thành glucose, chúng không có khả
năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Nó còn có tên là cellobiase (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
2.1.2 Một số đặc tính của cellulase từ vi khuẩn

(i)

Endoglucanase (EG):

EG được tổng hợp bởi Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai
loại EG 1 và EG 2.
- EG 1 chứa 459 amino acid, có trọng lượng phân tử 48,212 kD.
- EG 2 chứa 418 amino acid, có trọng lượng phân tử là 42,2 kD.
Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Ngoài ra endoglucanase còn
được tìm thấy ở Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

khác. Các endoglucanase thường có tính chất không khác biệt nhiều (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
(ii)

Cellobiohydrolase (CBH):

CBH được tổng hợp bởi Trichoderma reesei, gồm hai loại: CBH 1 và CBH 2.
- CBH 1 chiếm đến 60% khối lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma
reesei. Chúng có trọng lượng phân tử khoảng 65 kD, gồm khoảng 496 amino acid,
điểm đẳng điện pI 4,4. Enzyme này tác động lên cả cellulose định hình và cellulose

kết tinh. Nhưng chúng lại không tác động lên các dẫn xuất của cellulose như:
carboxy methyl cellulose (CMC) hay hydroxy ethyl cellulose, cellohexaose β nitrophenyl, β -glucoside hay β -glucan.
- CBH 2 có trọng lượng phân tử khoảng 53 kD với khoảng 471 amino acid, pI 5,0.
Chúng không tác động lên CMC, nhưng chúng có khả năng tác động lên cellulose
vô định hình và kết tinh.
Cellobiohydrolase của Cellulomonas fimi gồm 443 amino acid. Enzyme này có ba
cầu nối disulfite. Hai cầu nối disulfite nằm trong trung tâm hoạt động, còn cầu nối
còn lại nằm ngoài trung tâm hoạt động.
Cellobiohydrolase của Clostridium thermocellum có trọng lượng phân tử từ 68 - 75
kD (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
(iii)

β -glucosidase (BGL)

BGL là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở pH rất rộng
(pH 4,4 – 4,8), trọng lượng phân tử từ 50 – 98 kD, pI 8,4 và có thể hoạt động ở
nhiệt độ cao (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
BGL của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với trọng lượng phân tử là
75,34 kD. Trong dịch chiết, chúng chiếm khoảng 1% so với tổng lượng protein thu
được.
BGL của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại: BGL A và BGL B. Loại
A gồm khoảng 448 amino acid với trọng phân tử lượng khoảng 51,482 kD. Chúng
hoạt động mạnh ở pH từ 6,0 – 6,5 ở nhiệt độ 60oC, chúng tham gia thủy phân
cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Trong tự nhiên, khi thủy phân cellulose phải cần sự có mặt của ba loại ezyme:
endoglucanase, cellobiohydrolase và β -glucosidase. Các loại enzyme này thay
nhau phân hủy cellulose và sản phẩm tạo thành là glucose.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Trước tiên, endoglucanase sẽ tác động mạnh đến vùng cellulose vô định hình, cắt
bất kì cho ra những đoạn cello-oligomers. Sau đó, cellobiohydrolase sẽ tác động
vào phần kết tinh và phân hủy cho ra các cellobiose. Cuối cùng, β -glucosidase sẽ
thủy phân cellobiose cho ra glucose (một cellobiose bị thủy phân cho ra hai
glucose).
Cơ chế tác dụng của phức hệ enzyme cellulase lên mạch cellulase được minh họa
qua hình ảnh dưới đây:

Hình 1. Sơ đồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose
(Nguồn từ />
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme
(i)

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Khi có đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc tuyến tính vào nồng
độ enzyme. Biểu thức biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ
enzyme:
V= k[E]
Trong đó:
• V: Vận tốc phản ứng

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

• k: Hằng số tốc độ phản ứng

Tốc độ phản ứng (V)

• [E]: Nồng độ enzyme

Nồng độ [E]
Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng

Nồng độ enzyme càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh, nhưng nếu nồng độ này
quá cao thì tốc độ phản ứng chậm lại.
(ii)

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi có enzyme, phản ứng trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn
này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng tuyến tính với nồng độ cơ chất.
E + S ↔ ES
Giai đoạn hai: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó không
phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.

Giai đoạn ba: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này được
xem xét dựa trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.

Tốc độ phản ứng (V)

V

Vmax

0

Km

Nồng độ cơ chất

Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng enzyme
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

(iii)

Trường Đại học Cần Thơ

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme. Vận tốc phản ứng của

enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì tốc độ phản
ứng của enzyme sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu. Do bản chất của enzyme là protein
nên nó kém bền khi nhiệt độ tăng cao.

Tốc độ phản ứng (V)

Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Tại khoảng mà enzyme có thể
tồn tại, vận tốc phản ứng có thể tăng 1,4 – 2 lần khi nhiệt độ tăng 10oC.

Nhiệt độ 0C
Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme

Hệ số nhiệt Q10 được sử dụng để biểu thị sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ
phản ứng. Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất được gọi là nhiệt độ
tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh ở nhiệt độ 40 – 50oC. Mỗi
loại enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau và phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng.
Một số enzyme có nhiệt độ tối thích ở 60oC, số khác lại là 70oC. Enzyme cellulase
có nguồn gốc từ nấm mốc có nhiệt độ tối thích từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ
55 – 62oC.
Khi nhiệt độ cao hơn mức tối ưu thì hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm. khi đó hoạt
tính của enzyme không thể phục hồi. Ngược lại, ở nhiệt độ thấp 0oC thì hoạt tính
của enzyme cũng sẽ bị giảm nhưng có khả năng phục hồi hoạt tính khi tăng dần
nhiệt độ lên đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự
có mặt của kim loại, pH, cơ chất,…
Phần lớn enzyme cellulase có nhiệt độ tối thích từ 30 – 50oC, hoạt động mạnh ở 35
– 40oC và bị vô hoạt khi nhiệt độ trên 70oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn theo
phương trình bậc nhất:

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

ln

Trường Đại học Cần Thơ

[E ] = - kt
[E0 ]

Trong đó:
• k: hằng số vận tốc phản ứng
• E0: Nồng độ ban đầu của enzyme
• E: Nồng độ của enzyme hoạt động theo thời gian t
Yếu tố nhiệt độ thường được sử dụng để điều khiển hoạt động của enzyme, tốc độ
phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.
(iv)

Ảnh hưởng của pH

Tốc độ phản ứng

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, vì nó ảnh hưởng đến mức
độ ion hóa của cơ chất enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein trong enzyme.
Đa số enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 và 9, độ bền của enzyme của enzyme
có thể tăng lên khi có cơ chất, coenzyme, Ca2+,…mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh
nhất ở một vùng pH gọi là pH tối thích. pH của môi trường thường ảnh hưởng đến

mức độ ion hóa cơ chất, độ bền của enzyme. Vì thế, pH có ảnh hưởng rất lớn đến
phản ứng của enzyme.

pH
Hình 5. Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng của enzyme

Enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều enzyme
hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, tuy nhiên cũng có enzyme hoạt động mạnh ở
pH acid. Enzyme cellulase từ Trichoderma có điểm đẳng điện và pH tối thích nằm
trong khoảng acid khoảng pH 5.
Dựa trên sự thay đổi của pH mà người ta điều hòa phản ứng trong bảo quản, trong
chế biến lương thực, thực phẩm, tuyển chọn giống vi sinh vật,…
(v)

Ảnh hưởng của các chất ức chế

Chất ức chế là chất có khả năng làm suy yếu hay chấm dứt hoàn toàn khả năng hoạt
động của enzyme. Các chất ức chế có thể là: các ion kim loại, các anion, các hợp
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Các chất ức chế có khả năng ức chế thuận
nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp chất ức chế thuận nghịch, phản
ứng giữa enzyme và chất ức chế sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng:

K1
E+I

EI
K-1

Trong đó:
• E: Enzyme
• I: Chất ức chế
• K1, K-1: Hằng số vận tốc phản ứng thuận nghịch
Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất ức chế mà người ta chia ra
những chất ức chế sau:
- Các chất ức chế cạnh tranh:
Là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là
những chất ức chế thuận nghịch và có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động
của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động là
cho cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau
của chất ức chế và cơ chất làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Ở
kiểu ức chế này, I và S đều cạnh tranh với nhau để kết hợp với enzyme. Vận tốc
phản ứng sẽ phụ thuộc vào tương quan nồng độ của S và I đối với enzyme. Thường
thì nếu nồng độ [S] rất lớn so với [I] có thể loại trừ hoàn toàn tác dụng của chất ức
chế I. Do đó, cơ chất mất một phần khả năng tương tác làm cho tốc độ phản ứng
không tăng. Phản ứng trong trường hợp có chất cạnh tranh của enzyme sẽ như sau:
E + S ↔ ES → E + P
E + I ↔ EI
P: sản phẩm của phản ứng
Như đã nói, chất ức chế cạnh tranh cũng kết hợp vào trung tâm hoạt động của
enzyme nhưng khác với cơ chất ở chỗ bản thân chất ức chế không bị chuyển hóa
dưới tác dụng của enzyme.
- Các chất ức chế không cạnh tranh:

Chất kìm ức chế không cạnh tranh kết hợp với các enzyme ở các vị trí khác với
trung tâm hoạt động. Chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme,
làm giảm hoạt động xúc tác dẫn đến giảm vận tốc phản ứng.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của
enzyme. Sau khi kết hợp với chất ức chế để tạo thành phức hợp EI, enzyme vẫn có
khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như sau:
E + S ↔ ES → E + P
E + I ↔ EI
ES + I ↔ EIS
EI + S ↔ EIS
Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng của chúng:
Các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất ức chế không cạnh tranh.
Nếu như phản ứng xảy ra với chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo
thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A va chất B.
Khi đó sản phẩm P1, P2 được xem như là chất ức chế của enzyme.
- Kìm hãm do thừa cơ chất:
Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất ức chế của phản ứng
E + S ↔ ES → E + P
Nếu có cơ chất thứ hai tham gia phản ứng và có khả năng đính vào một vị trí nào đó
trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho enzyme không hoạt động, khi đó cơ

chất thứ hai này xem như là chất ức chế.
ES + S ↔ ESS
(vi)

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạt hóa
enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion,các ion kim loại
nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của Bảng hệ thống tuần hoàn các nguyên tố hóa học
Mendeleev. Những chất này có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt
động sang trạng thái hoạt động, từ trạng thái hoạt động yếu sang trạng thái hoạt
động mạnh. Các chất hoạt hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có
thể là:
- Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, gốc trong các phản ứng
hóa học.
- Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt động
enzyme.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử của proenzyme làm
loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần nhau để
hình thành trung tâm hoạt động.

Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 – 1,65 Ao (K+, Na+, Ca+, Mg+)
và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt
hóa, các ion kim loại có khả năng kết hợp để tạo thành trung tâm hoạt động, làm
cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian
cần cho sự xúc tác enzyme.
Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu,...) có ảnh hưởng dến khả năng
tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Fe, Mn, Zn có tác dụng kích thích để tạo thành
enzyme này từ nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Fe là 2 – 10 mg/l, Zn là 0,11 –
2,2 mg/l, Mn 3,4 – 27,2 mg/l (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.1.5 Trung tâm hoạt động của enzyme
Hoạt tính xúc tác của enzyme phần lớn thường được thể hiện và quyết định bởi các
trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động thường là một phức hoặc một nhóm liên
kết chặt chẽ với mạch protein của enzyme. Các phản ứng thường xảy ra trên bề mặt
của trung tâm hoạt động. Các cơ chất tiến tới gần trung tâm hoạt động tạo phức
enzyme - cơ chất. Về mặt nhiệt động học, phức enzyme - cơ chất làm giảm năng
lượng hoạt hóa của phản ứng làm cho phản ứng xảy ra dễ dàng.
Các nhóm chức gắn trong mạch protein có thể từng cặp tạo thành trung tâm hoạt
động cùng hỗ trợ tham gia vào quá trình xúc tác (Trần Đình Toại, 2005).
2.1.6 Ứng dụng của enzyme cellulase
Trong thời đại mà ngành công nghiệp enzyme phát triển nhanh chóng, enzyme
cellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật đang được sản xuất với quy mô công nghiệp
để đáp ứng cho nhu cầu rất lớn như hiện nay. Enzyme cellulase tuy là được nghiên
cứu và ứng dụng chậm hơn so với các enzyme khác nhưng đó là một enzyme có vai
trò rất quan trọng trong cộc sống của chúng ta.
Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy: enzyme CHB được dùng làm sợi để
tiết kiệm năng lượng và làm tăng độ mềm dẻo của sợi. Các enzyme cellulase khác
sẽ tham gia phản ứng tách các phần tử mực ra khỏi bề mặt sợi giấy hoặc dùng để
thủy phân chất mang phần tử mực.
Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được dùng để thủy phân vách tế bào của
malt làm tăng hiệu quả lắng, lọc, giảm cặn lắng, làm tăng năng suất trong chế biến

bia. Bên cạnh đó, chế biến nước trái cây và rượu vang cellulase cũng được dùng
cùng với pectinase và hemicellulase để làm mềm lớp vỏ quả, tăng hiệu suất lắng,
lọc nước quả, tăng chất lượng và ổn định rượu. (Tenkanen et al.,2003)
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Trong chăn nuôi, nếu dùng hỗn hợp các enzyme trong đó có enzyme cellulase để
sản xuất thức ăn dễ tiêu hóa cho động vật, đặc biệt là động vật còn non thì sẽ làm
tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (Phạm Thị Trân Châu et al., 2007).
Trong công nghiệp sản xuất bột giặt và các chất tẩy, dùng cellulase các loại:
CBH 1, CBH 2, EG 1, EG 2, EG 3, EG 5, EG 6. Các enzyme này tẩy các chất bẩn
có phân tử nhỏ bám vào quần áo bằng vải sợi, enzyme sẽ loại phần sợi cellulose
mảnh ở trên bề mặt đã bị bẩn ra khỏi bề mặt sợi vải. Còn đối với ngành công nghiệp
sản xuất sợi, vải người ta dùng enzyme cellulase để làm bóng sợi, loại các sợi xù xì,
giữ cho vải luôn được mới.
Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc từ thực vật, trong nuôi cấy tế bào và tái tổ
hợp: cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất có trong
thực vật được dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Trong xử lý chất thải hữu cơ có chứa cellulose như rác thải ở các nhà máy chế biến
rau quả, bãi rác ở những khu đô thị,... enzyme cellulase được dùng để phân hủy
tránh được sự ô nhiễm đất, nước, không khí,... Vì vậy rất có ý nghĩa trong công
nghệ bảo vệ môi trường (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004).
Từ nguồn nguyên liệu cellulose sẵn có sử dụng enzyme cellulase của Trichoderma
viride để chuyển hóa thành dịch đường. Dịch đường này được sử dụng để dùng cho

nấm men lên men tạo thành ethanol, đây là dạng nguyên liệu trong tương lai đang
được nghiên cứu, áp dụng (Lê Ngọc Tú et al., 2002).
Sử dụng enzyme cellulase trong tế bào vi sinh vật như một loại phân bón vi sinh
vật. Khi bón chế phẩm vi sinh vật này vào đất trồng, chúng sẽ phân hủy nhanh các
chất hữu cơ có trong đất trồng thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
2.2

Sản xuất enzyme cellulase từ vi sinh vật

Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase được cho ở bảng sau:

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

Bảng 1. Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase
Nguồn nấm mốc
Enzyme

α -amylase

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Pennicilium emersonii

Pennicilium funiculosum

Trichoderma harzianum

Cellulase
Glucoamylase
Endoarabinase
Hemicellulase
Pectinase
Xylanase
α -amylase
Cellulase
Glucoamylase
Hemicellulase
Lipase
Pectinase
Protease
Cellulase
Glucanase
Xylanase
Cellulase
Cellobiase
Dextranase
Glucanase
Glucoamylase
Glucosidase
Pectinase

Xylanase
Cellulase
Glucanase
Glucosidase
Hemicellulase
Xylanase

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2004)

Enzyme cellulase từ vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng
thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Cellulase có thể được sản xuất từ nhiều nguồn
nấm mốc và vi khuẩn.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

2.3

Trường Đại học Cần Thơ

Tinh chế enzyme cellulase

Việc tinh sạch enzyme cellulase có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác
nhau. Phổ biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký
ái lực, sắc ký lọc gel) (Ishii et al.,1979).
Trong phạm vi nghiên cứu này, đề tài được thực hiện với phương pháp kết tủa.

Phương pháp này được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh
học, đặc biệt là các phân tử có bản chất protein như enzyme. Cấu tạo phân tử
enzyme rất phúc tạp, chúng có cả những nhóm kỵ nước lẫn các nhóm ưa nước nên
tính tan phụ thuộc vào các nhóm ưa nước trên bề mặt.
Có thể dùng nhiều cách khác nhau để tủa enzyme như tủa bằng muối, bằng các
dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa enzyme. Các dung môi
hoặc các chất ưa nước có ái lực mạnh hơn enzyme nên có thể lôi kéo nước ra khỏi
phân tử enzyme, làm cho chúng mất lớp áo nước và tủa xuống.
Kết tủa được xem như là bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch enzyme thô. Sau
khi kết tủa, tiến hành ly tâm hoặc lọc hỗn hợp lỏng-rắn để thu được phần rắn. Tiếp
theo hòa tan phần rắn bằng dung dịch đệm, sau đó là khử muối nếu cần thiết
(Harris, 1995).
2.3.1

Kết tủa bằng muối ammonium sulfate

Ammonium sulfate rất thường được sử dụng để tủa enzyme ở bước đầu trong quy
trình tách chiết và tinh sạch. Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích
trên bề mặt enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh liên kết hydro tạo
lớp áo nước quanh phân tử. Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao,
các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước
làm cho enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Banerjee,
2006).
Các loại muối thường được dùng là (NH4)2SO4, NaCl, MgSO4. Nhiều nghiên cứu
cho thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì có khả năng ổn định hầu hết các loại
enzyme. Có thể dùng muối (NH4)2SO4 dạng rắn hoặc dạng dung dịch bão hòa (tính
theo phần trăm bão hòa).
Phương pháp này cũng được sử dụng để kết tủa và thu phân đoạn các enzyme trong
hỗn hợp dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở
mỗi nồng độ muối khác nhau.

Enzyme bị kết tủa bằng muối ít bị biến tính nhưng cần phải tiến hành thêm bước
thẩm tách để loại muối ra khỏi dung dịch trước khi tiến hành sắc ký.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ thuộc
vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với phân tử nước.
Khả năng hydrate hóa của enzyme sẽ bị giảm khi thêm dung dịch các dung môi hữu
cơ, các phân tử enzyme liên kết lại với nhau và kết tủa xuống. Dung môi hữu cơ
thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Ở phương pháp này cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới 5oC) nhằm tránh biến
tính enzyme. Có thể dùng các dung môi hữu cơ này để tách phân đoạn enzyme dưới
0oC, như vậy sẽ có tác dụng tốt đến sự ổn định của enzyme. Khi đã có kết tủa, phải
tách nhanh kết tủa ra bằng máy ly tâm. Phương pháp này có ưu điểm là không cần
loại muối, các dung môi hữu cơ có nhiệt độ bay hơi thấp nên dễ dàng tách ra khỏi
enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay có màu (Lương Đức Phẩm,
2004).
2.4

Ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme,

phương pháp ly tâm thường được sử dụng khá rộng rãi trong thu nhận dung dịch
enzyme. Dung dịch enzyme sau khi khuấy trộn với các hóa chất gây tủa và để ổn
định thì sẽ được đem ly tâm để thu phần protein kết tủa, trong đó có phần enzyme
cần nghiên cứu.
Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta
thường tiến hành ly tâm lạnh.
2.5

Một số nghiên cứu có liên quan

2.5.1 Nước ngoài
Tinh sạch enzyme cellulase từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã được
thực hiện và đưa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới.
- Jamil et al (2005) đã nghiên cứu khả năng tinh sạch và xác định tính chất của
enzyme cellulase (EG, CBH) từ Trichoderma harzianum .Theo đó, độ tinh sạch của
enzyme EG tăng gấp 4,219 lần ban đầu, hoạt tính riêng tăng từ 0,087 U/mg lên
0,37 U/mg, độ tinh sạch của enzyme CBH tăng gấp 1,35 lần ban đầu, hoạt tính riêng
tăng 2,25 U/mg lên 3,04 U/mg sau các bước kết tủa bằng (NH4)2SO4.
- Yasushi Morikawa et al (1998) đã nghiên cứu khả năng tinh sạch enzyme CBH từ
Trichoderma reesei. Kết quả thu được là độ tinh sạch của enzyme CBH tăng 1,66
lần so với ban đầu, hoạt tính riêng tăng từ 1,11 U/mg lên 1,84 U/mg.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

2.5.2 Trong nước
Ngoài việc kết tủa sơ bộ hỗn hợp protein chứa enzyme sau quá trình lên men bằng
(NH4)2SO4, thì dung môi ethanol lạnh cũng được sử dụng làm tác nhân kết tủa
enzyme trước khi tinh sạch. Enzyme cellulase từ Bacillus subtilis có thể được tinh
sạch bằng ethanol lạnh với tỷ lệ dung môi: dịch chiết là 4: 1 ở nhiệt độ 4oC. Kết quả
thu được là hoạt tính enzyme tăng 4,5% so với ban đầu (Trần Thị Ánh Tuyết và
Trương Quốc Huy., 2010).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1

Phương tiện

3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: 3/1/2011 – 22/4/2011
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp và
Sinh học ứng dụng.
3.1.2 Nguyên liệu
Enzyme cellulase thô thu nhận từ nấm mốc Trichoderma sp.
3.1.3 Thiết bị và hóa chất

(i)

Thiết bị
- pH kế cầm tay Hanna
- Bể điều nhiệt Lauda 2000
- Máy ly tâm Hermle Z323K
- Tủ lạnh
- Máy đo quang phổ Hitachi 2800
- Cân phân tích
- Một số thiết bị khác

(ii)

Hóa chất

- 3,5-dinitro salicylic acid (DNS) – (Phân tích, Merk)
- Sodium potassium tartrate (tinh khiết, Trung Quốc)
- Glucose (tinh khiết, Trung Quốc)
- NaOH (tinh khiết, Trung Quốc)
- (NH4)2SO4 (tinh khiết, Trung Quốc)
- Carboxy methyl cellulose (CMC) (tinh khiết, Trung Quốc)
- CH3COOH (tinh khiết, Trung Quốc)
- CH3COONa (tinh khiết, Trung Quốc)
- NaCl (tinh khiết, Trung Quốc)
- BSA (Bovine serum albumin) (Phân tích, Merk)
- CuSO4.5H2O , C2H5OH (tinh khiết, Trung Quốc)
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 16

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011

3.2

Trường Đại học Cần Thơ

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát các nồng độ ammonium sulfate và các tỉ lệ ethanol thích hợp cho việc tinh
sạch sơ bộ enzyme cellulase
Mục đích: tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa
cellulase tốt nhất mà không làm biến tính enzyme này. Enzyme sẽ được đo hoạt tính
và hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch để xác định khả năng tinh sạch của
hai chất trên.
Hoạt tính của enzyme cellulase được xác định với 1% (w/v) carboxy methyl
cellulose (CMC) làm cơ chất (theo phương pháp Miller, 1959). 1ml dung dịch
enzyme cellulase được ủ trong 30 phút với 1ml CMC 1% và 1ml dung dịch đệm
natri acetate 50 mM (pH 5) ở 60oC. Sau khi phản ứng kết thúc, xác định nồng độ
đường khử tạo thành bằng cách cho 3 ml thuốc thử DNS đun sôi trong vòng 10 phút
rồi đem làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem đo độ hấp thu bằng máy quang phổ ở
bước sóng 575 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme (IU/ml) được tính dựa vào đường
chuẩn glucose.
Hàm lượng của protein được định lượng theo phương pháp phản ứng Biuret.
3.3

Nội dung và bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến
khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp

(i)

Mục đích:

Tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa enzyme
cellulase từ Trichoderma sp tốt nhất mà không làm biến tính cellulase từ
Trichoderma sp.
(ii)

Tiến hành:

Thí nghiệm được tiến hành theo phương thức kết hợp 2 nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhân tố A: Hóa chất dùng để kết tủa enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp, có 2
loại hóa chất
A1: Ammonium sulfate

A2: ethanol

Nhân tố B: Tỉ lệ hóa chất sử dụng: dịch chiết enzyme thô
Nhân tố B1: Tỷ lệ ammonium sulfate : enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp
(w/v), thay đổi ở 10 mức độ
B1.1: 30%

B1.2: 35%

B1.3: 40%

B1.4: 45%

B1.5: 50%

B1.6: 55%

B1.7: 60%

B1.8: 65%

B1.9: 70%

B1.10: 75%

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 17