Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic co có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muống chua

Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN HỮU CHÍ
MSSV: 2071797
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CO TÍNH KHÁNG
KHUẨN TỪ NEM CHUA VÀ RAU MUỐI CHUA
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

Người hướng dẫn
Tiến sĩ LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY

Cần Thơ, năm 2011

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

i


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ thực phẩm của tôi đã được hội
đồng chấm luận văn thông qua.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

ii


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY đã tận tình hướng dẫn,
cung cấp cho tôi những tài liệu cần thiết và hữu ích giúp quá trình nghiên cứu được
tiến hành thuận lợi và nhanh chóng. Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi giúp tôi
hoàn thành tốt đề tài này trong thời gian quy định.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy, Cô trong bộ môn Công Nghệ Thực
Phẩm trường ĐẠI HỌC CẦN THƠ đã cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báo trong
suốt những năm học vừa qua. Những kiến thức mà Thầy, Cô truyền dạy đã giúp tôi rất
nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã luôn luôn động viên, tạo điều kiện
thuận lợi, hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Do kiến thức còn hạn chế nên sẽ còn nhiều khuyết điểm, thiếu sót trong quyển luận
văn này, rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành của quý Thầy, Cô và các
bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cần Thơ, ngày 12 tháng 5 năm 2011

Nguyễn Hữu Chí

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

iii


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau muối
chua là tìm ra trên hai nguyên liệu này những chủng vi khuẩn thuần khiết sinh axit
lactic có thể sinh tổng hợp những hợp chất có khả năng kìm hãm sự hoạt động hay
tiêu diệt một số vi khuẩn khác. Để thực hiện điều này, chúng tôi tiến hành phân lập từ
nem chua và rau muối chua trên thị trường. Môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập
là MRS chứa 1,5% Agar, 0,5% CaCO3, pH môi trường là 6,3. Môi trường phân lập
được tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Từ 180 khuẩn lạc vi khuẩn lactic thu được trên nem chua khi tiến hành phân lập, sau
quá trình cấy chuyền chúng tôi thu được 120 chủng vi khuẩn lactic thuần nhất (gọi tắt
là LAB). Tăng sinh 120 chủng LAB này (thời gian 16÷18 giờ, ở 370C) trong môi
trường MRS có pH 6,3, sau đó ly tâm. Phần dịch trong thu được sau ly tâm có pH
trung bình 3,4 được chỉnh đến pH 7 rồi đun sôi ở 1000C trong 6 phút. Phần dịch sau
đun sôi được thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn theo hai cách thử nghiệm: cấy mẫu lên
môi trường chứa vi khuẩn chuẩn ngay sau khi đun (thử nghiệm 1) và cấy mẫu khi đã
để mẫu ổn định 16÷18 giờ sau khi đun (thử nghiệm 2) rồi ủ qua đêm ở từng nhiệt độ
tối thích của từng chủng vi khuẩn chuẩn. Vi khuẩn chuẩn được dùng là Lactobacillus
plantarum ATCC 14917T, Lactobacillus sakei subsp. Sakei JCM 1157T , Lactobacillus
sakei TISTR 890 và Bacillus Coagulans JCM 2257, chúng được dùng như là những vi

khuẩn chỉ thị đối với đặc tính kháng khuẩn của chủng LAB cần tìm.
Kết quả: không có chủng nào có đặc tính kháng khuẩn trên 120 chủng LAB được
tuyển chọn từ nem.
Thực hiện việc phân lập, cấy chuyền, tăng sinh rồi thử dặc tính kháng khuẩn các
chủng LAB thu được từ rau muối chua với cách tiến hành hoàn toàn tương tự như trên
nem. Kết quả thu được như sau:
Từ 175 khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân lập được trên rau muối chua. Trong tổng số 122
chủng LAB được tuyển chọn qua quá trình cấy chuyền, có 7 chủng thể hiện đặc tính
kháng khuẩn trên cả bốn loại vi khuẩn chỉ thị ở cách thử nghiệm thứ hai. Các chủng
đó là: R1, R3, R5, R8,R 9, R15, R17.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

iv


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

MỤC LỤC
CẢM TẠ ....................................................................................................................iii
TÓM LƯỢC...............................................................................................................iv
MỤC LỤC ..................................................................................................................v
CHƯƠNG 1:
MỞ ĐẦU ...................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................1
CHƯƠNG 2:
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..............................................................2

2.1 Giới thiệu nguyên liệu......................................................................................................2
2.1.1 Nem chua ..................................................................................................................2
2.1.2 Rau muối chua ..........................................................................................................4
2.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic ............................................................................................6
2.3 Phân loại vi khuẩn lactic ..................................................................................................6
2.4 Sinh lý của vi khuẩn lactic ...............................................................................................6
2.5 Cơ chế lên men của vi khuẩn lactic .................................................................................7
2.5.1 Vi khuẩn lactic đồng hình .........................................................................................7
2.5.2 Vi khuẩn lactic dị hình............................................................................................10
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic..........................................11
2.7 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic .............................................................................12
2.7.1 Ứng dụng sự lên men lactic trong công nghệ thực phẩm .......................................12
2.7.1.1. Sản xuất acid lactic ......................................................................................12
2.7.1.2. Muối chua rau quả - ủ chua thức ăn gia súc.................................................12
2.7.1.3 Ứng dụng lên men lactic trong ngành sữa ....................................................13
2.7.1.4 Ứng dụng lên men lactic trong ngành thịt, cá ...............................................13
2.7.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học ..............................................................13
2.7.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong công nghệ lên men chất kháng sinh...............13
2.8 Khái quát về chất kháng sinh sinh học...........................................................................13
2.9 Khái quát về Bacteriocin................................................................................................14
2.9.1 Phân loại bacteriocin...............................................................................................15
2.9.2 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin ..........................................................................15
2.9.3 Kiểu hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic..................................................16
2.9.4 Ứng dụng của bacteriocin từ vi khuẩn lactic ..........................................................16
2.10 Một số vấn đề liên quan đến việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật.........................17
2.10.1 Vấn đề khử trùng môi trường dinh dưỡng ............................................................17
2.10.2 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh .................................................................................18
2.10.3 Nguyên tắc phân lập các giống thuần khiết ..........................................................18
2.11 Môi trường dinh dưỡng................................................................................................19
2.11.1 Nguyên tắc thành lập môi trường..........................................................................19

2.11.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn lactic .........................................................19
2.12 Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ..............................................................20
2.12.1 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng ......................20
2.12.2 Phương pháp giữ giống trên môi trường đất, cát ..................................................20
2.12.3 Phương pháp lạnh đông và đông khô....................................................................20
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM....................22
3.1 Phương tiện thí nghiệm..................................................................................................22
3.2 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................................23
3.2.1 Phương pháp chung ................................................................................................23
3.2.2 Tiến hành thí nghiệm ..............................................................................................23
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

v


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

3.2.2.1 Thí nghiệm 1 : Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua ...........23
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Thử đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB thu được từ
nem chua ...................................................................................................................26
3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất trên rau
muối chua..................................................................................................................31
3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn trên những chủng LAB thu
được từ rau muối chua ..............................................................................................33
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................35
4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất từ nem chua............35
4.2 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB ........................35
4.3 Thí nghiệm 3: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic thuần nhất từ rau muối chua ....43

4.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm đặc tính kháng khuẩn của các chủng LAB ........................43
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................51
5.1 Kết luận ..........................................................................................................................51
5.2 Đề nghị...........................................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................52

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

vi


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

CHƯƠNG 1:

Trường Đại Học Cần Thơ

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, việc nghiên cứu để tìm ra những phương thức bảo quản thực phẩm sao cho
đạt hiệu quả cao mà vẫn an toàn tuyệt đối cho người tiêu dùng đang là vấn đề cấp
thiết. Nó không chỉ là nhiệm vụ của ngành khoa học thực phẩm mà còn liên quan đến
nhiều ngành khoa học khác. Vai trò của các chất phụ gia, chất hoá học dùng trong bảo
quản thực phẩm từ trước đến nay là không thể phủ nhận. Thế nhưng việc sử dụng
chúng đã và đang gây ra một số ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ của người tiêu dùng nếu
liều lượng sử dụng vượt quy định hay việc tích trữ dần trong cơ thể theo thời gian.
Nên vấn đề cần được suy nghĩ lại.
Thêm vào đó, ngành công nghiệp chế biến đồ hộp với chế độ thanh trùng nghiêm ngặt
để tiêu diệt bào tử của một số loại vi khuẩn gây ngộ độc đã gián tiếp làm giảm đi phần

nào chất lượng của sản phẩm nhưng nguy cơ còn sót lại các bào tử này sau thanh trùng
là vẫn có, dù rất ít. Một chế độ thanh trùng ôn hoà hơn mà vẫn mang lại hiệu quả cao
đồng thời kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa trong trường hợp bào tử còn sót
nếu chúng ta sử dụng những hợp chất đặc biệt được tổng hợp từ những vi sinh vật có
lợi.
Khoa học về vi sinh vật cho phép chúng ta tìm được những chủng vi khuẩn sản sinh
những chất kháng khuẩn đặc biệt có thể đảm nhận những vai trò như vừa nêu mà
không hề gây hại đến sức khoẻ con người.
Bacteriocin, tên chung của các peptit do vi khuẩn lactic tổng hợp nên có được những
tính chất quý báu này. Với những ích lợi đó, chúng tôi tiến hành việc nghiên cứu phân
lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ nem chua và rau
muối chua nhằm phục vụ cho ngành khoa học thực phẩm.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được những chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn trên nem chua và rau
muối chua.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

1


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

CHƯƠNG 2:

Trường Đại Học Cần Thơ

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu nguyên liệu

2.1.1 Nem chua
Nem chua là sản phẩm lên men lactic từ thịt heo tươi có trộn thêm đường và gia vị cần
thiết.
Bản chất của quá trình là sự tạo thành acid lactic trong thịt nhờ chủ yếu vào vi khuẩn
lactobacillus và micrococus. Sản phẩm càng chua nếu lượng axit lactic tích tụ nhiều
khi quá trình lên men kéo dài. Vì thế chất lượng sản phẩm sẽ khác nhau tuỳ theo kỷ
thuật và thời gian lên men khác nhau.
Mô tả công nghệ
Thịt heo dùng để sản xuất phải là heo tươi vừa mới giết mỗ, thịt có màu hồng, không
dùng thịt cũ, qua đêm, màu sẫm, có mùi lạ. Quá trình làm nhuyễn thịt có thể dùng máy
xay hoặc giã nhuyễn.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

2


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Quy trình công nghệ sản xuất nem chua theo phương pháp truyền thống:
Thịt heo tươi (95%)

Bì heo

Rữa sạch

Làm sạch

Xay nhuyễn

Luộc chín

Trộn gia vị (muối, tỏi,
bột ngọt, đường, ớt)

Loại mỡ

Thái nhỏ

Làm khô

Trộ đều

Tạo hình

Bổ sung gia vị

Bao gói

Lên men

Sản phẩm

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

3

Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Bì heo sau khi luộc chín, cần loại mỡ thật kỹ và thái nhỏ thành sợi và hong khô trước
khi trộn với thịt heo xay nhuyễn đã ướp gia vị. Trong quá trình trộn có thể bổ sung
thêm gia vị.
Toàn bộ nguyên liệu được tạo hình, vuông hay tròn dài như khúc giò rồi được gói chặt
bằng lá vông (có tác dụng giữ nhiệt thích hợp cho lên men). Sau đó gói bằng 2 ÷ 3 lớp
lá chuối, buộc chặt để tạo điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vi khuẩn lactic hoạt động
mạnh dần, axit lactic tích tụ ngày càng nhiều làm cho thịt có mùi thơm và vị chua. Khi
thấy mặt nem khô, mịn và có mùi thơm đặc trưng là có thể dùng được. Thời gian lên
men từ 8 ÷ 10 ngày. Tuỳ theo khẩu vị ăn chua mà có thể cho lên men thêm 1 ÷ 2 ngày
nữa.
2.1.2 Rau muối chua
Rau muối chua là sản phẩm chế biến từ rau, bằng cách cho đường có sẵn trong nguyên
liệu lên men lactic. Axit lactic và các sản phẩm của quá trình lên men tạo thành , làm
cho sản phẩm có hương vị đặc biệt, có tính sát trùng, ức chế hoạt động của các vi sinh
vật lạ và giữ cho sản phẩm khỏi bị hư hỏng.
Quy trình sản xuất rau muối chua:
Cải bẹ

Làm sạch sơ bộ

Chần

Bổ sung đường, muối, nước

Lên men yếm khí

Sản phẩm

Bảo quản nhiệt độ thấp

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

4


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

- Cải: Cải dùng làm dưa có độ già thích hợp để cấu trúc dưa giòn, thơm ngon.
- Làm sạch sơ bộ: rữa sạch tro, bùn, các loại côn trùng bám trên nguyên liệu, không
rữa quá lâu sẽ làm mất vi khuẩn lactic bàm trên bề mặt nguyên liệu.
- Chần: Chần trong nước có nhiệt độ khỏang 850C trong 1 ÷ 2 phút. Chần để ổn định
cấu trúc của sản phẩm đồng thời tiêu diệt một số vi sinh vật có trên nguyên liệu nhưng
thời gian và nhiệt độ được kiểm soát để đảm bảo vi khuẩn lactic không bị tiêu diệt.
- Bổ sung muối, đường, nước: Muối để tạo áp suất thẩm thấu, làm cho các chất khô
được thoát nhanh ra ngoài, làm cho các mô của nguyên liệu được nén chặt lại và trở
nên giòn. Muối còn có tác dụng làm tăng hương vị cho sản phẩm, hạn chế sự hoạt
động của vi sinh vật gây thối, tăng cường hoạt động của vi khuẩn lactic. Nồng độ
muối sử dụng khoảng 3 ÷ 5%. Đường cung cấp thêm dinh dưỡng cho sự hoạt động
của vi khuẩn lactic, giúp sản phẩm có vị dịu ngọt. Nước giúp tạo môi trường yếm khí
cho vi khuẩn lactic hoạt động, hoà tan các thành phần đường, muối và các chất khô
thoát ra từ nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic.
- Lên men: Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 26 ÷ 350C, thời gian lên men
từ 6 ÷ 7 ngày. Khi lượng axit đạt đến mức thích hợp cần trữ sản phẩm ở nhiệt độ thấp
để tránh pH hạ quá thấp ảnh hưởng đến vi khuẩn lactic và tạo điều kiện cho các vi

sinh vật gây hại phát triển.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

5


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ lactobacilliaceae, chúng có nhiều trong thiên nhiên, tồn tại
nhiều ở cỏ nhất là cỏ khô. Chúng tồn tại ở người và đông vật, thường ở trong đường
ruột, trong miệng.
Tế bào vi khuẩn lactic có dạng hình que hay hình cầu. Dạng hình que có thể ngắn gần
như hình cầu, chúng đứng riêng lẽ, kết đôi hoặc kết thành chuỗi, chiều dài khoảng 0,5
÷ 0,7 µ m. Dạng hình cầu còn có dạng ovan, đứng riêng lẽ hoặc kết đôi hay chuỗi,
đường kính từ 0,5 ÷ 0,6 µ m, có khi đến 1 µ m.
Kích thước của chúng phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy. Trong môi
trường có hàm lượng rượu cao tế bào vi khuẩn thường dài ra, rượu etylic còn có tác
dụng kìm hãm sự phân chia tế bào của vi khuẩn lactic.
Các tế bào vi khuẩn lactic không chuyển động, không tạo thành bào tử (tuy nhiên hiện
nay người ta tìm thấy một số giống có khả năng tạo bào tử), không tạo thành sắc tố, vi
khuẩn lactic thuộc vi khuẩn gam dương.
Vi khuẩn lactic là thể kỵ khí, vi hiếu khí. Chúng sinh trưởng và hoạt động mạnh trong
điều kiện kỵ khí nhưng vẫn sống được trong điều kiện hiếu khí.
Phân cắt tế bào là hình thức sinh sản của vi khuẩn lactic. Với điều kiện thuận lợi thời
gian thế hệ của chúng là 15 phút, nếu điều kiện không thuận lợi có thể kéo dài đến 24
giờ.

2.3 Phân loại vi khuẩn lactic
Theo khoá phân loại của Bengay, họ Lactobacteriaceae chia làm hai họ:
Họ: Streptococcae
Họ: Lactobacilaceae
Họ streptococcae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. Họ Lactobacilaceae chỉ có
một loài là lactobacillus.
Có một số loài trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh.
2.4 Sinh lý của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic hoạt động sống ở điều kiện kỵ khí nên đặc điểm cơ bản của vi khuẩn
này là không có enzyme catalaza. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme này đã được tìm
thấy ở một số chủng vi khuẩn lactic ở dạng Pseudocatalaza trong những năm gần đây.
Pseudocatalaza có ở một số loài thuộc các giống leuconostoc và lactobicillus.
Hoạt tính proteaza tìm thấy ở cầu khuẩn, trực khuẩn và liên trực khuẩn, nhóm trực
khuẩn thường có hoạt lực này cao hơn, nhất là các chủng được phân lập từ ruột non
của bê nghé. Proteaza của vi khuẩn lactic gồm cả peptinaza và proteinaza.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

6


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Hoạt tính lipaza của vi khuẩn lactic có ở cả cầu khuẩn và trực khuẩn. Chế phẩm lipaza
thu được từ dịch chiết không có tế bào vi khuẩn dễ dàng phân huỷ những triglycerit
đơn giản.
Hoạt tính hoá sinh của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào đặc điểm lên men các loại
đường. Vi khuẩn lactic lên men được mono và disacarit. Nhưng không phải tất cả vi
khuẩn lactic nào cũng đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào. Một số không lên

men được sacaroza, số khác lại không sử dụng maltoza. Các vi khuẩn lactic không lên
men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài Lactobacillus delbrueckii là
đồng hoá được tinh bột).
Khi nghiên cứu khả năng lên men lactic từ các nguyên liệu chứa đường, dựa vào các
sản phẩm lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm hoàn toàn khác nhau:
- Vi khuẩn lactic đồng hình
- Vi khuẩn lactic dị hình
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo axit lactic trong môi trường,
và do đó sức chịu axit (độ bền với axit) của chúng cũng khác nhau. Đa số các trực
khuẩn lactic đồng hình hình thành axit cao hơn (khoảng 2%÷3%), liên cầu khuẩn
(khoảng 1%). Các trực khuẩn có thể phát triển ở pH = 4÷3,8. Cầu khuẩn không phát
triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở vùng pH =
5,5÷6.
Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều
loài vẫn sống được trong môi trường có 10÷15% cồn, một số trực khuẩn bền với NaCl
(tới 7÷10%).
Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25÷350C, loại ưa nhiệt
có nhiệt độ tối thích là 40÷450C, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng
50C hay thấp hơn). Hầu hết chúng đều chết khi gia nhiệt tới 60÷800C sau 10÷30 phút.
2.5 Cơ chế lên men của vi khuẩn lactic
2.5.1 Vi khuẩn lactic đồng hình
Nhóm vi khuẩn này có chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Sản
phẩm chính của quá trình lên men các loại đường là axit lactic. Axit lactic được tạo
thành theo sơ đồ Embden-Meyerhosf, hydro bị tách ra và chuyển tới pyruvat.
Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90%. Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử cacbon
để chuyển thành axit acetic, etanol, CO2 và axetion, lượng sản phẩm phụ được tạo ra
này phụ thuộc vào sự có mặt của oxy.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

7


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Một số giống vi khuẩn lactic đồng hình phổ biến: Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillu bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus
plantarum, Streptococus cremoris, Streptococcus lactic, Streptococus thermophilus.
• Phương trình tổng quát biểu hiện lên men lactic:
C6H12O6
(đường glucoza)

2C3H6O3 + Q
(axit lactic)

• Quá trình lên men lactic của tất cả các vi khuẩn lactic đồng hình được tiến hành theo
cơ chế chung như sau:

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

8


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ
Glucose
ATP

ADP

Glucose - 6 - photphat

Fructose - 6 - photphat
ATP
ADP

Fructose - 1,6 - photphat
Aldolase
Triose - 3 - photphat
ATP
ADP

3 - phosphoglicerinic axit

2 - phosphoglicerinic axit

Phosphonol piruvi axit
ATP
ADP

Piruvat
NAD-H2
ADP

Axit lactic

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

9


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

2.5.2 Vi khuẩn lactic dị hình
Trong lên men lactic dị hình, ngoài sản phẩm chính là axit lactic còn có các sản phẩm
khác như axit acetic, sucxinic, etanol, CO2 và H2. Nhóm này không có hai enzym cơ
bản là enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase nên lên men lactic dạng này
khác với lên men đồng hình là ở chổ quá trình diễn ra theo con đường
pentosephotphat.
Trong lên men dị hình axit lactic có thể tạo thành từ 40% đường dùng cho lên men,
axit sucxinic khoảng 20%, etanol 20%, axit acetic 10%, CO2 20%.
Một số giống vi khuẩn lactic dị hình phổ biến: Lactobacillus brevis, Lactobacillus
lycopersici, Lactobacillus pasteurianus, Streptococcus cumoris, Streptococcus
falcalis, Streptolacticus lactic.
• Phương trình tổng quát biểu hiện lên men lactic dị hình:
2C6H12

C3H6O3 + C4H6O4 + C2H4O2 + C2H5OH + CO2 + H2 + Q
(a.lactic) (a. sucxinic) (a.acetic) (etanol)

• Cơ chế chung của quá trình lên men:

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

10

Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ
Glucose
ATP
ADP

Glucose - 6 - photphat
NAD+
NAD – H2

6 – photphogluconic axit
NAD+
NAD – H2

Ribose - 5 - photphat

Xilulose - 5 - photphat

Pentose photphocetelase

Aldehyde photphoglycerinic

Piruvat

Axit lactic

Acetyl phosphate

Acetaldehyde

Etanol

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic
- Dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic sử dụng nguồn năng lượng chính từ các đường
mono và disacarit như glucoza, lactoza, maltoza, sacaroza, các axit hữu cơ như axit
citrit, malic, furamic, pyruvic…làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc, đối với vi
khuẩn lactic thì nguồn cacbon chính là glucoza. Khi không có nguồn cacbon, vi khuẩn
lactic sử dụng nguồn năng lượng là các axit amin (axit glutamic, arginin, tirozin…).
Khi axit amin được sử dụng, CO2 sẽ tách ra ngoài.
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

11


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

- Dinh dưỡng nitơ: Phần lớn vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp được các
dạng nitơ hữu cơ phức tạp, do đó chúng cần hỗn hợp các axit amin, dịch thuỷ phân
protein từ casein, bột đậu tương…làm nguồn pepton, peptit.
- Vitamin: Vitamin là nguồn chất dinh dưỡng quan trọng của vi khuẩn lactic, đặc biệt
là trực khuẩn. Hầu hết vi khuẩn lactic yêu cầu một số vitamin cho sự sinh trưởng và
phát triển như vitamin B1, B2, B6, PP, axit folic, biotin…
Các chất vô cơ: Các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, photpho, iod, lưu huỳnh,
mangan, đặc biệt là mangan rất cần cho việc phòng ngừa sự tự phân của tế bào.
- Oxy: Quan hệ giữa các loài vi khuẩn lactic với oxy ở mức độ hiếu khí khác nhau là
rất khác nhau. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt chỉ làm cho trực khuẩn lên men dị

hình chậm phát triển ở giai đoạn đầu, đối với trực khuẩn lên men đồng hình sinh
trưởng bị giảm 10%, lên men giảm 23%. Các loài lên men dị hình sinh trưởng tốt ở
điều kiện kỵ khí, những loài không sử dụng petoza thì phát triển rất kém ở điều kiện
này.
- Nhiệt độ: Chỉ có loài Lactobacillus delbrueckii là loài chịu được nhiệt độ 500C mà
vẫn phát triển và hoạt động mạnh mẽ, hầu hết các vi khuẩn lactic còn lại thích hợp với
nhiệt độ thấp hơn.
pH môi trường: Các chủng lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn tách
từ rượu vang có thể chịu được pH 3,5 ÷ 3 hoặc thấp hơn, các chủng tách từ dưa muối
chua, mắm chua chịu được pH 3,7 trở lên. Các cầu khuẩn lên men dị hình chịu được
axit cao, ít hơn là các trực khuẩn lên men dị hình, các trực khuẩn lên men đồng hình
chiếm vị trí trung gian.
2.7 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic
2.7.1 Ứng dụng sự lên men lactic trong công nghệ thực phẩm
2.7.1.1. Sản xuất acid lactic
Trong công nghiệp thực phẩm, axit lactic được sử dụng để thay thế một phần axit
acetic trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, đồ hộp… Ngoài ra, trong công nghiệp
đã xây dựng các dây chuyền công nghệ lên men để sản xuất axit lactic. Sản phẩm này
được ứng dụng trong nha khoa, phẩu thuật chỉnh hình, sản xuất vật liệu sinh học, mỹ
phẩm, chế tạo chất dẻo trong tương lai.
2.7.1.2. Muối chua rau quả - ủ chua thức ăn gia súc
Các quá trình muối chua rau quả và ủ chua thức ăn gia súc là quá trình lên men lactic
có trên rau, quả hoặc trên thức ăn tươi ban đầu của gia súc và được lên men tự nhiên

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

12


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

trong điều kiện yếm khí. Đây là quá trình mang tính chất vừa chế biến vừa bảo quản
nhờ hoạt động của vi khuẩn lactic.
2.7.1.3 Ứng dụng lên men lactic trong ngành sữa
Sữa động vật là loại thực phẩm quý chứa nhiều chất dinh dưỡng. Sự tồn tại và hoạt
động của vi khuẩn lactic trong sữa sẽ tích tụ axit lactic làm cho pH sữa càng thấp và sẽ
hạn chế, tiêu diệt các loại vi khuẩn gây thối rữa có trong sữa. Lợi dụng tính chất này,
người ta cho lên men lactic dung dịch sữa để bảo quản được lâu, đồng thời tạo ra một
số sản phẩm có giá trị khác như sữa chua, bơ, phomat, v.v…
2.7.1.4 Ứng dụng lên men lactic trong ngành thịt, cá
Ứng dụng sự lên men của vi khuẩn lactic để sản xuất sản phẩm truyền thống như nem
chua. Những năm gần đây vi khuẩn lactic đã được đưa vào trong việc chế biến một số
dạng sản phẩm như giò chả, xúc xích, trong quá trình làm chín cá muối để rút ngắn
thời gian của quá trình công nghệ và cải thiện một số tính chất của sản phẩm (vị,
hương thơm, độ rắn chắc…).
2.7.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học
Việc ứng dụng này đã được Việt Nam sử dụng từ lâu. Khi người ta bị tiêu chảy, thầy
thuốc khuyên hàng ngày uống 1 ÷ 2 chén (bát) nước dưa chua. Phương pháp này tỏ ra
rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển.
Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản
xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên Biolactyl. Sản
phẩm này trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic.
2.7.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong công nghệ lên men chất kháng sinh
Một số vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp những chất kháng khuẩn. Các chế phẩm
này đang được triển khai thử nghiệm ứng dụng rất có hiệu quả trong việc bảo quản sản
phẩm thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới.
2.8 Khái quát về chất kháng sinh sinh học
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để

mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên
động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành
tính khác. Năm 1885, Babes đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một
chủng vi sinh vật là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm
hãm các chủng đối kháng.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

13


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có
nguồn gốc sinh học (phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay cả ở nồng độ
thất hay rất thấp đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây
bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
Tuỳ thuộc vào bản chất của mỗi chất kháng sinh mà cơ chế tác dụng lên vi sinh vật
gây hại (gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất thường mang đặc điểm riêng. Những kiểu
tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết
quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình
sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản AND, hoặc tương tác đặc hiệu với
những giai đoạn nhất định trong các chuyển hoá trao đổi chất.
Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu
thị bằng một trong các đơn vị sau: mg/mL, µ g/mL, hay đơn vị kháng sinh UI/mL
hoặc UI/g. International Unit – đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng
kháng sinh tối thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế
hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn.

Hiệu quả ứng dụng của mỗi chất kháng sinh được xác định qua việc xem xét hàng loạt
các chỉ tiêu khác nhau, một số chỉ tiêu chính là: phổ kháng sinh, hoạt tính kháng sinh
đặc hiệu, đáp ứng phản hồi của mầm bệnh đối với kháng sinh đó, đường hướng đào
thải và tương tác qua lại giữa các loại khi sử dụng.
Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt có
chọn lọc các chủng vi sinh gây hại mà không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho
phép trên người sử dụng. Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các
chủng gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này. Theo đó, chất kháng sinh phổ rộng là
chất có thể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau, chất tiêu diệt ít mầm bệnh
hơn là chất kháng sinh phổ hẹp. Việc phân loại chất kháng sinh có thể dựa theo một
trong các nguyên tắc sau: phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất
kháng sinh, phân loại theo phổ kháng sinh, phân loại theo cơ chế tác dụng hay phân
loại theo cơ chế sinh tổng hợp ra chất kháng sinh đó.
2.9 Khái quát về Bacteriocin
Bacteriocin được A. Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu
cách thức tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển
những nghiên cứu về chất kháng sinh, chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn.
Bacteriocin là tên chung của các peptit do vi khuẩn sinh tổng hợp nên, có hoạt tính
kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi
khuẩn khác. Loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

14


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề
về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase.
Thời gian qua, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn gram
âm, trong đó điển hình là colicins. Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng đã tiến hành, có nhiều báo cáo đã cung
cấp những thông tin về vấn đề này, đặc biệt là những nghiên cứu về chúng trên vi
khuẩn lactic.
Các chế phẩm bacteriocin điển hình từ vi khuẩn lactic là: nisin, diplococin, subtilin,
lactotrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococus); lactocidin, acidolin,
acidophilin, reuterin, lactacin F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus);
leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (từ Leuconostoc), pediocin A, pediocin PA-1,
pediocin AcH (từ Pediococus)…
Có nhiều tiêu chí để định nghĩa về bacteriocin, những tiêu chí này được dùng trong
nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau cho những bacteriocin khác
nhau, những tiêu chí đó là:
- Phạm vi ức chế đối với những loại khác
- Sự có mặt của loại protein hoạt động
- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn
- Loại tế bào mà nó tác dụng
- Các yếu tố di truyền
- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế
2.9.1 Phân loại bacteriocin
Một lượng lớn bacteriocin được tổng hợp từ vi khuẩn lactic và được phân loại theo
những đặc tính hoá sinh và di truyền học của chúng.
a/ Loại Lantibiotic:
Khối lượng phân tử nhỏ, hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào, tạo những lỗ
trong tế bào chất của loài nhạy cảm. Chất điển hình thuộc nhóm này là nisin.
b/ Loại Non-Lantibiotic:
Khối lượng phân tử biến thiên, ổn định nhiệt, chứa những amino axit thông thường.
Đại diện tiêu biểu là Leucocin A, pediocin P1-A, những peptit này thường kháng

Listeria
2.9.2 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin
Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành tính chất làm thay
đổi tính thấm của màng tế bào, một số loại bacteriocin còn có khả năng phân giải
ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Lacticin 3147
Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

15


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành
tế bào. Đó là nguyên nhân làm cho màng tế bào tạo ra những đường hướng cho
photphat vô cơ đi ra khỏi tế bào. Để tái tích luỹ lại những ion này, những hệ thống hấp
thu phụ thuộc ATP dẫn tới sự thuỷ phân của ATP bên trong, làm chức năng tế bào bị
phá vỡ, tế bào dần mất năng lượng và chết.
2.9.3 Kiểu hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic
Một số bacteriocin thuộc loại Lantibiotic như nisin có kiểu hoạt động điển hình là
chúng có thể kết hợp với lipid của tế bào như phương tiện vận chuyển peptidoglycan
subunits từ tế bào chất đến thành tế bào, do đó ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào, làm
tế bào chết.
2.9.4 Ứng dụng của bacteriocin từ vi khuẩn lactic
Nisin, đại diện tiêu biểu cho các bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic là
một polypeptit có khả năng kìm hãm đặc hiệu nhiều loại vi khuẩn khác nhau, đặc biệt
là các vi khuẩn Clostridium, nisin hầu như hoàn toàn vô hại với người do chúng dễ
dàng bị phân huỷ bởi các enzym đường tiêu hoá. Nhờ có đặc tính này mà các chế
phẩm nisin hiện được ứng dụng rộng rãi để làm chất bảo quản thực phẩm.

Một ưu điểm lớn của nisin là do hầu như không tác dụng lên các loài vi khuẩn gram
âm nên chúng không làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột có lợi của người.
Trong công nghệ chế biến sữa, để khắc phục hiện tượng lên men sinh hơi khó chịu và
kiểm soát quá trình lên men butyric do vi khuẩn Clostridium gây ra (trong công nghệ
sản xuất phomat) người ta sử dụng nisin thay cho nitrit trước đây, vì việc dùng nitrit
đã tạo ra một số dẫn xuất rất độc và có hoạt tính gây ung thư. Việc sử dụng nisin theo
hướng này đã mang lại hiệu quả tích cực.
Trong công nghệ chế biến đồ hộp, việc sử dụng nisin nhằm làm giảm khả năng chịu
nhiệt của những vi khuẩn bền nhiệt sinh bào tử như Clostridum perfrigens,
Clostridium thermocacharolyticum hay Bacillus stearothermophilus nhằm hạ thấp
nhiệt độ và thời gian thanh trùng nhưng vẫn đảm bảo tính hiệu quả của quá trình. Bên
cạnh đó nisin còn kìm hãm và ngăn ngừa quá trình thối rữa nếu bào tử còn sót lại sau
thanh trùng. Nhóm sản phẩm thường áp dụng là cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản
phẩm nấm mũ, đậu quả đông hộp…
Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt, người ta đang nổ lực tìm kiếm một giải
pháp công nghệ để thay thế cho việc sử dụng nitrit và nisin đang thu hút được sự quan
tâm của các nhà sản xuất, trong đo hướng phối hợp nisin – nitrit cho hiệu quả rất khả
quan và đang tiếp tục được thử nghiệm.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

16


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

2.10 Một số vấn đề liên quan đến việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật
Vô trùng là một vấn đề tối quan trọng trong việc phân tích vi sinh nói chung cũng như

việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật. Nếu khâu vô trùng không được thực hiện một
cách triệt để thì quá trình nghiên cứu sẽ không thu được kết quả như mong muốn.
2.10.1 Vấn đề khử trùng môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dường dùng cho phân lập rất dễ bị vi sinh vật bên ngoài nhiễm vào
trong quá trình pha chế hay tiếp xúc với không khí, dụng cụ chứa, nên vi sinh vật cần
phân lập sẽ bị cạnh tranh bởi những vi sinh vật tạp nhiễm này do dinh dưỡng trong
môi trường là có giới hạn. Ngoài ra vi sinh vật tạp nhiễm có thể sinh ra những những
sản phẩm có hại làm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật cần phân lập. Do đó môi
trường không được phép có bất kỳ một vi sinh vật sống nào, hay nói cách khác là hoàn
toàn vô trùng trước khi đưa vào phân lập.
• Các phương pháp tiệt trùng:
- Nhiệt là phương pháp tiệt trùng phổ biến. Nó được dùng đối với môi trường lỏng
hoặc rắn mà có thể gia nhiệt được. Gia nhiệt có thể là khô hay ướt (hơi nước). Gia
nhiệt ướt có hiệu quả cao hơn gia nhiệt khô vì sự chịu nhiệt của bản thân các tế bào vi
khuẩn sinh dưỡng thường tăng rất nhiều khi ở trạng thái khô hoàn toàn, do đó tốc độ
chết nhiệt của tế bào khô thấp hơn tế bào ướt. Vì vậy, tiệt trùng nhiệt khô chỉ dùng cho
thuỷ tinh hoặc nguyên liệu rắn có thể chịu nhiệt. Với các nồi hấp áp lực, nhiệt độ của
hơi nước có thể tăng cao hơn nhiệt độ sôi của nước rất nhiều. Các nồi hấp tiệt trùng
trong phòng thí nghiệm thường hoạt động ở áp suất 30 psia hoặc tương ứng với
1210C. Ở nhiệt độ này bào tử của vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt.
- Các tác nhân hoá học có thể được dùng để tiêu diệt vi sinh vật bởi tính oxy hoá mạnh
của chúng. Tuy nhiên, chúng không được dùng để tiệt trùng môi trường vì hoá chất dư
thừa có thể ức chế vi sinh vật cần nghiên cứu.
- Tia cực tím có thể tiêu diệt tế bào do sự phá huỷ cấu trúc AND, làm chết tế bào khi
tế bào hấp phụ. Tuy nhiên, khả năng xuyên qua vật liệu của tia cực tím là rất hạn chế.
Nên nó chỉ được dùng giới hạn trong việc làm giảm số lượng vi sinh vật trong phòng
nơi mà cần phải duy trì điều kiện vô trùng như phòng mổ của bệnh viện, phòng vô
trùng trong phòng thí nghiệm.
- Tia X tiêu diệt được vi sinh vật và có khả năng xuyên thấu cao. Tuy nhiên việc sử
dụng chúng cho vô trùng là không thực tế vì giá rất đắt và không an toàn cho người sử

dụng.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

17


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

- Sóng âm thanh và sóng siêu âm với cường độ cao có thể phá vỡ hoặc tiêu diệt tế bào
. Kỹ thuật này thường được dùng để phá vỡ tế bào trong trường hợp trích ly nội bào
hơn là cho mục đích vô trùng.
Trong các phương pháp trên, tiệt trùng nhiệt ướt là hiệu quả nhất để tiệt trùng môi
trường dinh dưỡng dùng để phân lập vi sinh vật.
Môi trường đem khử trùng trong nồi áp lực được rót ở mức không quá 1/2 chiều cao
của bình đựng chúng. Các bình dụng cụ chứa môi trường được đậy bằng nút bông khá
chặt và các sợi bông phải sắp xếp đều. Không nên đậy các bình chứa môi trường trong
nồi hấp áp lực bằng cellophan hay các vật kính khác không cho hơi đi qua vì khi đó
nhiệt độ của môi trường không đạt được nhiệt độ khử trùng. Môi trường sau khi tiệt
trùng được giữ trong tủ ấm ổn nhiệt ở 300C trong một đến 2 ngày để kiểm tra tình
trạng vô trùng.
2.10.2 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh
Phương pháp khử trùng các dụng cụ thuỷ tinh là phương pháp khử trùng bằng không
khí nóng. Nhiệt độ khử trùng từ 165 ÷ 1800C trong 2 giờ, khi đó các bào tử lẫn tế bào
sinh dưỡng của vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt.
Dụng cụ thuỷ tinh trước khử trùng phải được rữa kỹ, sau đó làm khô và gói giấy kỹ để
đảm bảo tính vô trùng khi sử dụng. Miệng của các ống pipet phải được bịt bằng nút
bông và được quấn giấy từ đầu nhỏ giọt theo hình xoắn ốc đến hết chiều dài pipet. Các

ống nghiệm thuỷ tinh được đậy bằng nút bông và được gói thành từng bó 5 ÷10 ống.
Đĩa petri được gói thành từng chồng 4 ÷ 5 cái.
Các dụng cụ được xếp vào tủ sấy không quá khít để đảm bảo không khí được lưu
thông. Nhiệt độ tủ không nên quá 1800C vì sẽ làm cháy giấy. Sau khi khử trùng phải
hạ nhiệt độ 800C mới được mở tủ sấy để tránh nứt vỡ dụng cụ.
2.10.3 Nguyên tắc phân lập các giống thuần khiết
Các chủng vi sinh vật cần phân lập được tích luỹ trong những nguyên liệu được
nghiên cứu, trong đó có thể có nhiều chủng vi sinh vật khác cùng tồn tại và sinh
trưởng. Để phân lập được các chủng cần nghiên cứu, cần phải hiểu rõ những đặc tính
cơ bản của chủng cũng như các phản ứng đặc trưng để nhận diện. Do đó, môi trường
phân lập ngoài những thành phần dinh dưỡng cần thiết cho chủng sinh trưởng cần phải
có những thành phần đặc trưng có thể tương tác với các quá trình sinh lý của chủng
qua những phản ứng hoá học để từ đó có thể nhận diện chính xác chủng từ những
khuẩn lạc tách rời.

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

18


Luận văn tốt nghiệp khoá 33 - 2011

Trường Đại Học Cần Thơ

Để thu được các chủng thuần khiết từ những khuẩn lạc thu được phải tiến hành cấy
chuyền lặp lại từ 1 ÷ 2 lần rồi chọn từ đó những khuẩn lạc đặc trưng nhất. Giống thuần
khiết thu được cần giữ lại để phục vụ quá trình nghiên cứu.
2.11 Môi trường dinh dưỡng
2.11.1 Nguyên tắc thành lập môi trường
Do khả năng tổng hợp và cách thức thu nhận năng lượng của các vi sinh vật khác nhau

nên nhu cầu vế các chất dinh dưỡng cacbon, nitơ, khoáng… cũng khác nhau. Vì vậy,
khi thành lập môi trường phục vụ cho việc nuối cấy, phân lập, bảo quản giống vi sinh
vật thì môi trường đó cần phải chứa đựng tất cả các thành phần cho các quá trình cấu
trúc và năng lượng của tế bào bao gồm cacbon, nitơ, khoáng, các nguyên tố vi
lượng…Chúng được đưa vào môi trường dưới dạng các chất khác nhau.
2.11.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn lactic
- Môi trường LBS Medium:
Pancreatic digest of casein
10g
Yeats Extract
Monopotassium photphat
Ammonium citrate

5g
6g
2g

Dextrose
Sorbitan monooleate
Sodium acetate hydrate

20g
1g
25g

Sulfate Mg
Sulfate Fe
Sulfate Mn

0,575g

0,034g
0,120g

Agar
15g
Nước cất
1 lít
Hoà tan các thành phần, gia nhiệt rồi sau đó thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.
- Môi trường MRS:
Proteose peptone No.3
Beef Extract
Yeast Extract

10g
10g
5g

Dextrose
Polysorbate 80
Ammonium citrate
Sodium Acetate

20g
1g
2g
5g

Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

19