Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp pectin methylesterase từ aspergillus niger sử dụng phụ phẩm n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGÔ THỊ THẢO OANH
MSSV: 2071829

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
ĐẾN HIỆU QUẢ SINH TỔNG HỢP
PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
SỬ DỤNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

Người hướng dẫn
Ths TRẦN THANH TRÚC

NĂM 2010


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu
quả sinh tổng hợp Pectin Methylesterase từ Aspergillus Niger sử dụng phụ phẩm
nông nghiệp” do sinh viên Ngô Thị Thảo Oanh thực hiện và báo cáo đã được hội
đồng chấm luận văn thông qua.

Người viết

Ngô Thị Thảo Oanh

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ

Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, mà đề tài tốt nghiệp đã hoàn thành sau
ba tháng làm việc tại phòng thí nghiêm. Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi
lời cảm ơn đến:
Cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng dẫn và luôn quan tâm giúp đỡ
em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy
Nguyễn Văn Mười đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn . Mặc
dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy cô vẫn thường xuyên theo dõi, hướng
dẫn và giúp đỡ em rất tận tình.
Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, những người đã cho em những kiến thức
quý báu trong thời gian học tập tại trường.Cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công
Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần
Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình.

Các chị học viên cao học Công nghệ sinh học K16, Công nghệ Thực phẩm và Đồ
Uống K17 cùng bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K33 đã nhiệt tình đóng góp
ý kiến và động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí
nghiệm.
Em cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần
Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường.
Cuối lời, con kính gởi đến cha mẹ và những người thân yêu của con lòng biết ơn sâu
sắc nhất về những gì đã giành cho con, luôn bên con, tạo đầy đủ điều kiện cho con học
tập và nghiên cứu.
Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong cuộc
sống.
Em xin chân thành cảm ơn !
Cần Thơ, 06 tháng 12 năm 2010
Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Thảo Oanh

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT

Mục tiêu của đề tài là khảo sát hiệu quả của quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme pectin
methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ Aspergillus niger trong điều kiện lên men bề mặt trên
môi trường rắn (SSF) trên cơ chất gồm bã táo ta khô và vỏ bưởi tươi ở các tỷ lệ khác nhau.
Sự thay đổi thành phần hóa học của cơ chất lên men cũng được xác định trong suốt quá trình
nghiên cứu nhằm tạo điều kiện lên men tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzyme pectin
methylesterase.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học của bã táo khô có khá đầy đủ những thành
phần dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men sinh enzyme PME như hàm lượng pectin
cao (34,83%) thêm vào đó kết hợp với vỏ bưởi tươi có độ DE đến 84,77% là một trong
những điều kiện tối thích cho Aspergillus niger sinh tổng hợp PME. Trên cơ chất bã táo khô
và vỏ bưởi tươi, tỷ lệ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME là 5:5 (bổ sung nước tạo độ
ẩm 60%). Hoạt tính enzyme đạt giá trị cao nhất sau 4 ngày lên men và hoạt tính thu được
khoảng 41,16 ± 4,18 U/mL, cao gấp 8,5 lần khi so sánh với môi trường lên men chỉ sử dụng
bã táo.
Từ khóa: Aspergillus niger, PME, bã táo, vỏ bưởi, thời gian ủ, hoạt tính.

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................................i
LỜI CẢM TẠ ...........................................................................................................................ii

TÓM TẮT .............................................................................................................................. iii
MỤC LỤC ...............................................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH ...............................................................................................................vi
DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................................vii
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN .................................................................................................0

1.1

Tính cấp thiết của đề tài ..............................................................................................0

1.2

Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................................2

CHƯƠNG 2
2.1

Cơ chất pectin..............................................................................................................2

2.1.1
2.2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..............................................................................2

Tổng quan về cơ chất pectin ................................................................................2

Enzyme pectin methylesterase (PME) ........................................................................5

2.2.1

Giới thiệu chung...................................................................................................5

2.2.2

Các tính chất của PME.........................................................................................6

2.2.3

Các nguồn PME khác nhau trong tự nhiên và đặc tính của từng loại.................7

2.2.4

Ứng dụng của PME............................................................................................10

2.3

Sơ lược về nấm mốc Aspergillus...............................................................................10

2.3.1

Aspergillus .........................................................................................................10

2.3.2

Aspergillus niger................................................................................................11

2.4

Thu nhận enzyme PME từ nấm mốc Aspergillus niger ............................................12

2.5

Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger ...................13

2.5.1

Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME ........................13

2.5.2

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME...............14

2.6

Giới thiệu sơ lược về táo bưởi, nguồn cơ chất giàu pectin........................................15

2.6.1

Táo ta .................................................................................................................15

2.6.2

Bưởi ...................................................................................................................16

2.7

Các nghiên cứu có liên quan .....................................................................................17

CHƯƠNG 3
3.1

PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................19

Phương tiện nghiên cứu.............................................................................................19

3.1.1

Thời gian, địa điểm nghiên cứu .........................................................................19

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2

Dụng cụ, thiết bị.................................................................................................19

3.1.3

Hóa chất .............................................................................................................20

3.1.4

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................20

3.2

Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................20

3.2.1

Phương pháp chuẩn bị mẫu................................................................................20

3.2.2

Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả .........................................................21

3.2.3

Phương pháp thu thập và xử lý kết quả..............................................................22

3.3

Phương pháp bố trí thí nghiệm..................................................................................22

3.3.1

Phân tích thành phần hóa học của cơ chất lên men ...........................................22

3.3.2

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giữa bã táo và vỏ bưởi...............22

3.3.3

Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger .23

CHƯƠNG 4
4.1

KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................25

Xác định thành phần hoá học (pectin, DE, đường tổng số, đạm ), và độ ẩm trong cơ

chất lên men.........................................................................................................................25
4.2

Ảnh của tỷ lệ phối trộn của bã táo và vỏ bưởi đến khả năng sinh tổng hợp PME từ

nấm mốc A.niger .................................................................................................................25
4.3

Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger ............28

4.4

Xác định hàm lượng pectin, DE, pH và độ ẩm trong cơ chất lên men sau thời gian

lên men ................................................................................................................................30
CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................32

5.1

Kết luận .....................................................................................................................32

5.2

Kiến nghị ...................................................................................................................32

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................33
PHỤ LỤC 1

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................................................................ viii

PHỤ LỤC 2

KẾT QUẢ THỐNG KÊ............................................................................. xiii

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao ......................................................3
Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin ..................................................................................................4
Hình 3: Sơ đồ thủy phân pectin của PME..................................................................................6
Hình 4: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl ...............................................7
Hình 5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình ......................................11
Hình 6: Aspergillus niger.........................................................................................................11
Hình 7: Táo ta ..........................................................................................................................16
Hình 8: Bưởi da xanh...............................................................................................................17
Hình 9 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ...........................................................................................23
Hình 10: Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME theo tỷ lệ cơ chất....................................................27
Hình 11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính PME...................30

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Hàm lượng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây ..........................5
Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của một số PME tinh khiết từ thực vật............................................8
Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu ...........................................................21
Bảng 4. Hàm lượng đường, đạm, pectin, DE và độ ẩm của cơ chất lên men. ........................25
Bảng 5: Hoạt tính enzyme theo tỷ lệ cơ chất ...........................................................................26

Bảng 6 : Hàm lượng pectin, DE theo từng tỷ lệ cơ chất sau khi thanh trùng ..........................28
Bảng 7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính PME từ A.niger ..............................29
Bảng 8: Hàm lượng pectin, DE, pH và độ ẩm cơ chất lên men sau thời gian nuôi cấy...........30
Bảng PL1. Bảng tra lượng đường nghịch chuyển...................................................................xii

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang vii


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƯƠNG 1

Trường Đại học Cần Thơ

TỔNG QUAN

1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật ngày càng hiện đại thì ngành công
nghệ sinh học với những nghiên cứu, phát minh mới mẻ ngày càng khẳng định vai
trò khoa học của mình trong đời sống. Trong đó, công nghệ enzyme là một lĩnh
vực không kém phần quan trọng của công nghệ sinh học.
Enzyme là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học, bản chất của enzyme là protein.
Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme, con người đã
tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp. Trong lĩnh vực thực
phẩm enzyme được ứng dụng khá rộng rãi. Đặc biệt, trong quá trình sản xuất rượu
vang, nước quả, nước uống không cồn thì nhóm enzyme pectinase đóng vai trò
quan trọng. Trong nhóm enzyme pectinase, pectin methylesterase (PME) đảm
nhiệm chức năng thủy phân các pectin thành các phân tử pectin có độ methoxyl

thấp hoặc acid pectic (Martin et al., 2004). Enzyme pectin methylesterase được
chú ý quan tâm nhằm: hạn chế sự phá hủy cấu trúc của tế bào thực vật, tăng hiệu
suất trích ly nước quả và thúc đẩy sự tách nước từ mô tế bào trong suốt quá trình
sấy (Van Buren, 1979). Việc gia tăng hoạt động của PME trong quá trình chế biến
rau quả có thể thực hiện bằng cách kích hoạt nội enzyme ở điều kiện thích hợp như
nhiệt độ, áp suất, thời gian, nồng độ muối,... (Duvetter, 2007) hay bổ sung chế
phẩm PME (Tran Thanh Truc et al., 2008). Đối với các loại rau quả có sự hiện
diện của PME trong nội bào thấp, việc nghiên cứu bổ sung chế phẩm PME là biện
pháp khả thi nhất.
Lĩnh vực trích ly và ứng dụng PME có nguồn gốc từ thực vật trong công nghiệp
chế biến các sản phẩm ở Việt Nam vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Trong khi
đó lại đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia (Suutarinen et al., 2002). Hiện
nay, PME thương mại vẫn chưa được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu các chế
phẩm PME từ nước ngoài thường có giá rất cao. Chính vì thế, nghiên cứu ly trích
PME trong điều kiện hiện tại của Việt Nam là cần thiết, cần được quan tâm.
PME có thể được sản xuất từ rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc bao gồm:
Aspergillus spp., Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer,
Trichoderma sp… (Polizeli et al.,1991), nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu
(Torres et al.,2005). Aspergillus niger (A.niger) được sử dụng phổ biến trong công
nghệ thực phẩm trong nhiều thập kỷ qua và được đánh giá là an toàn đối với sức
khỏe con người (Taylor et al.,1979 &Dijck et al., 2003). Thêm vào đó, Aspergillus
niger còn là loại nấm mốc có khả năng phát triển nhanh chóng trên các cơ chất rẻ
tiền và tiết ra enzyme trong môi trường, dễ dàng thu hồi (Oxenboll, 1994).
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 1


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Trong trường hợp sinh tổng hợp pectin methylesterase (PME) cũng như các
pectinase khác (enzyme thủy phân rau quả giàu pectin), cơ chất cảm ứng tương
thích là yếu tố quan trọng, vì để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần
phải tiến hành quá trình nuôi cấy thích hợp với sự tham gia của cơ chất cảm ứng
(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Sự hiện diện của cơ chất cảm ứng thích hợp trong
môi trường nuôi cấy sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm,
nhờ đó thúc đẩy hiệu quả sinh tổng hợp enzyme. Cơ chất được biết đến của PME
là pectin, acid pectic, D-galacturonate và một số nguồn carbohydrate khác
(Sajjaanantakul &Pitifer, 1991). Vì thế, theo các nghiên cứu của Beg et al., 2000
&Martin et al., 2004 ; Joshi et al., 2006 ; Martin et al., 2000 ; Silva et al., 2002
&2005 ; Boccas et al., 1994 thì nhiều phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin đã được
sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men trạng thái rắn (SSF) để sản xuất PME từ
Aspergillus niger như :bã cam, bã táo, vỏ cam, bã cà phê ,... và bã táo là phế phẩm
được chú ý nhất.
Táo (Ziziphus mauritiana) là một trong những loại quả được trồng phổ biến ở đồng
bằng sông Cửu Long. Đây là loại quả được xếp hàng đầu trong việc cung cấp và
sản xuất pectin (Denes et al., 2000; Marcon et al., 2005), cơ chất cho quá trình lên
men và thu nhận nhiều loại enzyme và nguồn phân lập, tuyển chọn nấm mốc có
khả năng sinh pectinase nói chung (Martin et al., 2004). Trần Thanh Trúc và cộng
sự (2010) đã cho thấy hiệu quả khi nghiên cứu sử dụng bã táo ta và vỏ cam sành
làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme PME từ Aspergillus niger. Ngoài
cam thì bưởi cũng là một trong những loại quả được trồng nhiều ở miền Nam,
cùng họ citrus với cam. Vỏ quả bưởi cũng chứa hàm lượng pectin cao, thêm vào
đó, bề mặt vỏ quả bưởi còn là môi trường thích hợp cho sự phát triển của một số
loài nấm mốc, trong đó có Aspergillus niger (Lê Thị Thanh Hương & Nguyễn
Thùy Châu, 2005). Việc sử dụng phụ phẩm từ táo và bưởi cho quá trình sinh tổng
hợp PME từ Aspergillus niger là hướng nghiên cứu mới, góp phần tích cực vào
việc nâng cao giá trị kinh tế cho một số loại cây ăn quả ở đồng bằng sông Cửu

Long đồng thời giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme. Chính vì thế, sử dụng bã
táo ta và vỏ quả bưởi làm cơ chất chính cho quá trình lên men sinh tổng hợp PME
từ Aspergillus niger được đề nghị.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xác định tác động của thành phần cơ chất,
thông qua việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta và vỏ bưởi cho quá
trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lên men bề mặt
trên môi trường rắn.

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 2


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƯƠNG 2

Trường Đại học Cần Thơ

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Cơ chất pectin
2.1.1 Tổng quan về cơ chất pectin
Pectin là một phụ gia thực phẩm thường được sử dụng để tạo gel trong chế biến
các sản phẩm dạng đông như chế biến và bảo quản mứt, mứt đông, kẹo pectin.
Pectin thường được bảo quản ở dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng nhạt. Trong tự
nhiên, pectin có mặt trong quả, củ, thân cây. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai
dạng: pectin hòa tan và protopectin, chuyển hóa giữa hai dạng tồn tại này ảnh
hưởng trực tiếp đến cấu trúc rau quả. Tiền thân của pectin là protopectin có nhiều

trong mô trái cây còn xanh, quá trình chín sẽ kèm theo sự thủy phân protopectin
thành pectin bị hoà tan, tế bào sẽ kém liên kết chặt chẽ với nhau, nên các tế bào trở
nên mềm hơn. Ngoài ra pectin còn có vai trò vận chuyển nước và lưu chất cho trái
cây đang trưởng thành.
Protopectin không tan trong nước, tạo độ cứng cho quả xanh. Cấu tạo hoá học của
protopectin phức tạp, gồm pectin ở trạng thái liên kết với các vi sợi cellulose trong
vách tế bào, các ion Ca2+, Mg2+… Dưới tác dụng của enzyme protopectinase, acid
hay khi đun nóng, protopectin bị thủy phân giải phóng pectin hòa tan.
Cấu trúc vách tế bào thực vật có thể được chia thành ba lớp: phiến giữa (lớp
chung-middle lamella), vách sơ cấp (primary wall), vách thứ cấp (secondary wall)
(Brett & Waldron, 1996). Phần đầu tiên của thành tế bào do tế bào non đang phát
triển tạo ra gọi là thành sơ cấp. Nơi thành của 2 tế bào chạm nhau, lớp giữa chúng
được gọi là tấm trung gian sẽ gắn chúng với nhau chính là pectin.

Hình 1: Mô hình cấu trúc của vách tế bào thực vật bậc cao
Nguồn: Davidson (2005) (URL: />
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 3


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Về mặt cấu trúc hoá học, pectin là một phức hệ sợi nhỏ trong tự nhiên (Vicken et
al., 2003). Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp các
acid polygalacturonic (GalA) qua các liên kết α-1,4 glycoside. Pectin gồm chủ yếu
các đơn vị galacturonic acid mặc dù chúng có thể được cấu tạo từ 17 loại
monosaccharide khác nhau. Có 3 loại pectic polymer chính cấu thành pectin:

homogalacturonan (HG), rhamnogalacturonan I (RGI) và rhamnogalacturonan II
(RGII) (Vincken et al., 2003; Caffall &Mohnen, 2009). Khối lượng phân tử của
pectin dao động trong khoảng 80.000 ÷ 200.000 Da tùy thuộc vào nguồn pectin
(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Pectin thương mại thường có hàm lượng acid
galacturonic hơn 75% và độ ester hóa từ 30 ÷ 80 %, tùy thuộc nguồn gốc (Ly
Nguyen, 2004).

Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin
Nguồn: Caffall và Mohnen, 2009

Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là: DE (Degree of
Esterification) – chỉ số ester hóa, thể hiện mức độ ester hóa của phân tử
galacturonic acid trong phân tử pectin (Smout et al., 2004) và MI – chỉ số
methoxyl hóa, biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl (-OCH3) có
trong phân tử pectin. Dựa vào chỉ số mức độ ester hóa DE, pectin được chia thành
ba nhóm: pectin hòa tan, acid pectinic và acid pectic.
• Pectin hoà tan: DE rất cao gần 100%, là ester methylic của acid
polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 4


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

acid polygalacturonic được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa
sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ
cao (khoảng 60 ÷ 65%).

• Pectinic acid: DE trung bình, là polygalacturonic acid có 1 phần nhỏ các
nhóm carboxyl được ester hoá trung bình bằng methanol (Nguyễn Đức
Lượng, 2004), có muối là pectinase.
• Pectic acid: DE rất thấp hoặc không có. Pectic acid là polygalacturonic acid
đã giải phóng hoàn toàn ra khỏi 1 đơn vị galacturonic acid trong đó có chứa
một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị acid galacturonic. Pectate là muối
của pectic acid (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Chỉ số DE của một loại pectin chi phối khả năng tạo thành và mức độ bền vững
của phức calcium - pectate. Điều này được giải thích do khi 2 nhóm carboxyl tự do
của 2 chuỗi HG đứng cạnh nhau sẽ tạo nên một vùng tích điện âm có thể gắn kết
với ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+, bằng cách đó mà gel calcium - pectate có thể
được tạo thành. Phải có ít nhất 9 đơn vị GalA không ester hóa để tạo nên phức bền
vững giữa các chuỗi (Liners et al., 1992).
Bảng 1: Hàm lượng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây
Loại trái cây
Táo
Nho
Vỏ cam
Lê
Khóm
Dâu tây

Hàm lượng pectin %
1.0 ÷ 1,6
0,1 ÷ 1,4
3,5 ÷ 5,5
0,7 ÷ 0,9
0,04 ÷ 0,1
0,5 ÷ 0,7

Mức độ ester hóa DE%
80 ÷ 92
50 ÷ 65
65
50 ÷ 70
22 ÷ 40
20 ÷ 60

Nguồn: Wolfgang Aehle, 2004

Dựa vào chỉ số MI – chỉ số methoxyl hóa, pectin thương mại được chia thành 2
loại:
• Pectin có độ methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin -HMP): MI > 7%.
Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm.
• Pectin có độ methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin - LMP): MI < 7%.
Tạo thành bằng cách tách nhóm methoxyl trong phân tử pectin. Chất này có
thể tạo gel trong môi trường không có đường và thường dùng làm màng bao
bọc sản phẩm.
Pectin là một phụ gia thực phẩm được nhiều người chấp nhận nhất và được chứng
minh bởi hàm lượng ADI (lượng tối đa ăn vào hằng ngày) cho phép, ngoài ra nó ít
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 5


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

bị biến đổi trong quá trình bảo quản do vi sinh vật, vì đây không phải là môi

trường dinh dưỡng thích hợp cho các vi sinh vật phát triển. Trong công nghiệp,
pectin được thu nhận từ dịch chiết của các nguyên liệu thực vật thường là táo hay
các quả có múi như: cam, quýt, bưởi…
2.2 Enzyme pectin methylesterase (PME)
2.2.1

Giới thiệu chung

Pectin methylesterase (PME) thuộc nhóm enzyme pectinase - nhóm các enzyme sử
dụng pectin như chất nền. PME còn có tên khác là pectinesterase (PE) và được
đánh số trong hệ thống phân loại là 3.1.1.11. Vị trí thủy phân của PME là các
nhóm methylester (-COOCH3) của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị
ester hóa (-COOH) (Ly Nguyen, 2004). Sự thủy phân pectin bằng PME tạo thành
acid pectinic và methanol. Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này rất cao, có
thể đạt 98%.

Hình 3: Sơ đồ thủy phân pectin của PME
Nguồn: Reinikainen, 2004

Các thành viên khác của hệ enzyme pectinases như polygalacturonase (PG) và
lyase pectate (PL) tác động thủy phân pectin theo các hình thức khác nhau. Các
loại PME được tìm thấy trong rất nhiều loại thực vật và cũng được sản xuất từ các
loại vi sinh vật gây bệnh cho cây.
2.2.2 Các tính chất của PME
PME là những enzyme có kích thước trung bình và phân tử khối (MM) vào khoảng
25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003). Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đến 11.

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 6

Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường
hợp có PME có tính acid (Bordenave, 1996). Từ những nguồn khác nhau dẫn đến
PME có những đặc trưng khác nhauvề phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa.

Bắt đầu ở nhóm carboxyl tự do
PME nấm mốc: pH tối ưu 4,5; khử nhóm ester theo phương thức tự do
PME thực vật: pH tối ưu > 7; khử ester hóa theo từng block

Hình 4: Sự phân cắt pectin của PME bắt đầu từ nhóm carboxyl
Nguồn: Duvetter, 2007

2.2.3 Các nguồn PME khác nhau trong tự nhiên và đặc tính của từng loại
PME có thể được thu nhận từ hai nguồn chủ yếu là thực vật và vi sinh vật.
i.

PME từ thực vật

PME hiện diện trong hầu hết cây ăn trái với hàm lượng khác nhau. Chúng thường
nằm trong vách tế bào và gia tăng khi trái bắt đầu chín. Các loại trái chứa PME
được nhắc đến nhiều nhất là cà chua, cam, chuối, kiwi, táo,… PME nội bào của
thực vật được tin là có liên quan đến sự thoái hóa của pectin trong suốt quá trình
phát triển của cây (Bordenave, 1996). Phối hợp với các enzyme pectinase khác,
PME có trách nhiệm trong việc điều khiển sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi
của mô thực vật trong quá trình chín.

Khối lượng phân tử của PME thực vật nằm trong khoảng 21 ÷ 57 kDa (Ly
Nguyen, 2004). Hầu hết chúng hoạt động trong khoảng pH hơi kiềm 6,0 ÷ 8,0 và
pI gần bằng 9,0 .Trong khi đó, nhiệt độ tối ưu là trong khoảng 55 ÷ 60oC (Ly
Nguyen, 2004). PME cà chua có pH tối ưu 7,6 và bị bất hoạt 50% sau khi đun 5
phút ở 67oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tuy nhiên, hai loại PME từ jelly sung lại
là những enzyme có pI trong khoảng acid 3,5 ÷ 4,4 (Lin et al., 1989). Các cation
kim loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 7


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

enzyme như ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng
độ lần lượt là 0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996). Ngoài ra, hoạt tính có thể
được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt được cường độ hoạt động tối ưu ở áp
suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa và nhiệt độ từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al.,
2004)
Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật thủy phân liên kết ester của pectin từ đầu
khử hoặc đầu không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân
tử pectin bằng cơ chế chuỗi đơn phản ứng, hình thành các khối pectin chứa các
nhóm carboxylate (Nguyễn Đức Lượng, 2004), khối này rất mẫn cảm với calcium.
Các phản ứng khử ester bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự do hay từ đầu khử của
mạch polygalacturonic (chỉ tác dụng tại một vị trí trên mạch), kết quả tạo thành các
gốc galacturonic bị khử nhóm ester (Solms &Deuel, 1955; Rexova, Benkova &
Markovic, 1976; Markovic & Kohn, 1984; Willats et al., 2001). Do hoạt động cần

có nhóm carboxyl tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực vật ít hoạt động
trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có độ ester hóa từ 20 ÷ 30%
(Evans &MacHale, 1978; Seymour et al., 1991).
Bảng 2: Đặc tính sinh hóa của một số PME tinh khiết từ thực vật
Nguồn ly
trích PME
Cà chua
Cà chua

Khối lượng phân tử
(kDa)
23,0
23,8
24,2
35,0
34,2
25,0
27,2
55,9
55,9
55,9
36,0
53,5

pI

Nguồn tài liệu

–
9,30

8,90
> 9,30
9,80
> 8,66
> 8,66
7,05
6,36
5,24
> 10,0
> 10,0

Tucker et al., 1982
Pressey& Woods, 1992

Đu đủ

53,0

–

Đu đủ

28,0
27,0

> 9,00
> 9,00

Lourenco & Catutani,
1984

Lim & Chung, 1993

Cà chua
Carrot
Carrot
Cherry

Nho

Giovane et al., 1994
Markovic et al., 2002
Alonso et al., 2003
Alonso et al., 1996

Seymour et al., 1991b

Nguồn: Ly Nguyen, 2004

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 8


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

PME thực vật thường tồn tại các dạng đồng phân, và các dạng đồng phân của
chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI hoặc khối lượng phân tử (Bondenave, 1996).
Mối quan hệ tỷ lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy theo mức độ

tăng trưởng của trái và các nguồn PME khác nhau (Bondenave & Goldberg, 1994).
Ví dụ như cà chua có hai loại đồng phân là PME1 và PME2. Trong giai đoạn trái
bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1
giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín (Nguyễn Đức Lượng,
2004). Hoặc như hai dạng đồng phân của PME trong cam, PME1 có pI là 10,05 và
PME2 có pI >11. Các đồng phân trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng
pI nhưng lại khác nhau về tính bền nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
ii.

PME từ vi sinh vật

Bên cạnh PME từ thực vật, nguồn giàu PME và được sử dụng nhiều nhất trong các
chế phẩm pectinase thương mại là PME từ vi sinh vật. PME từ vi sinh vật có khối
lượng phân tử từ 27,8 ÷ 40 kDa. Các PME của nấm mốc khác với PME của thực
vật theo cơ cấu đa dạng, các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly
Nguyen, 2004). PME từ nấm mốc (Aspergillus spp.) có thể phân cắt cơ chất một
cách ngẫu nhiên (Ishi et al., 1979; Kohn et al., 1982; Limberg et al., 2000), ngoại
trừ PME từ nấm mốc Trichoderma reesei khử ester hóa theo từng block (Markovic
&Kohn, 1984), và phản ứng khử nhóm ester của PME từ nấm Erwinia
chrysanthemi cũng tương tự như ở PME từ thực vật (Cheristensen et al., 2001).
Tuy nhiên, các PME có nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiệt kém hơn so với các
PME có nguồn gốc từ thực vật. Các loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp PME
gồm:
Nấm men: Saccharomyces fragilis
Nấm mốc: Aspergillus spp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme,
Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer, Trichoderma spp., Neurospora
crassa…
Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes...(Joshi el al., 2006).
• PME từ nấm mốc

PME thường được thu nhận từ các loại nấm sợi. PME từ nấm mốc là các loại
enzyme ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu 30 ÷ 45°C
và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55°C. Giá trị pH tối ưu của nấm mốc trong
khoảng 3 ÷ 5,5. PME từ các loài Aspergillus là điển hình cho các PME có
điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A.niger

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 9


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

đạt tối đa ở pH 4,5 và nhiệt độ 40°C. Trong khi pH tối ưu của PME từ
A.species là 3,7 ÷ 4,2 và PME từ A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
• PME từ vi khuẩn
Cùng có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng PME từ vi khuẩn không có tính acid
mà lại có tính hơi kiềm. pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7 ÷ 8 và hầu
hết bị vô hoạt ở 85°C (Nguyễn Đức Lượng, 2004). PME từ vi khuẩn Erwinia
chrysanthemi có pI là 9,64 (Laratta et al., 1995).
2.2.4 Ứng dụng của PME
Hệ enzyme pectinase nói chung và PME nói riêng có nhiều ứng dụng trong công
nghiệp chế biến thực phẩm (Pilling et al.,2000). Chúng thường được áp dụng để
phân cắt thành tế bào, thủy phân pectin tạo điều kiện thu được nhiều dịch bào
trong chế biến nước quả ép. Quá trình này thường được kết hợp với việc sử dụng
enzyme cellulase để sự phân cắt được tốt hơn.
Pectinesterase có tác dụng hữu hiệu trong việc làm trong dịch quả trước khi lên
men sản xuất rượu vang, chế biến các loại nước quả trong. Sử dụng pectinesterase

sẽ cho hiệu quả làm trong cao, thay thế cho các phương pháp hóa-lý (lắng lọc tự
nhiên) kém hiệu quả, dễ nhiễm khuẩn và thời gian dài. Pectinase còn được ứng
dụng trong việc tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm rượu do hình thành các sản
phẩm trao đổi chất của nấm mốc trong nguyên liệu (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Ứng dụng quan trọng nhất của PME trong công nghiệp chế biến thực phẩm là khả
năng cải thiện cấu trúc của rau quả đóng hộp ( Baker &Wicker, 1996). Khi được
kích hoạt, PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết
với ion Ca2+, tạo độ giòn và độ cứng chắc cho sản phẩm.
Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào. Do đó,
nhiều phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật
nguyên vẹn (Baker &Wicker, 1996) và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm –
thấm thụ động. Tuy nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme
vào mô chỉ giới hạn ở bề mặt. Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia.
2.3 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus
2.3.1 Aspergillus
Nấm mốc Aspergillus được tìm ra vào năm 1729 bởi Micheli. Giống Aspergillus
đã được tìm ra trên 180 loài và có vai trò quan trọng trong ngành nấm sợi
Ascomycetes. Một trong các loài được sử dụng nhiều nhất là Aspergilllus niger,
Aspergilllus oryzae, đã được FDA công nhận là an toàn. Aspergillus thuộc nhóm
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 10


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), cuống đính bào tử có đầu
phình ra. Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang

bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu
ngọn có cuống bào tử. Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách
ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng
mọc tỏa khắp mọi hướng.

Hình 5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi và thể bình
Sharma, 1998

2.3.2 Aspergillus niger
Aspergillus niger là loại nấm bất toàn (Deuteromycetes) thuộc bộ Moniliales, họ
Moniliaceae, giống Aspergillus. Nấm mốc Aspergillus niger (A.niger) được biết
đến như loại nấm mốc màu đen (Abarca et al., 2004), là thành viên của
Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) thuộc nhóm sinh sản vô tính. Nhóm này gồm
trên dưới 10 loài. Chúng có màu đen khi quan sát bằng mắt thường do tạo bào tử
đính màu đen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng
đại thấp. A.niger có 2 bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu hơi đen và
có gai. Bọng và sợi cuống thường có màu nâu bóng.

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 11


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Hình 6: Aspergillus niger
/>ch:1&tbnid=LClJxeJjFoKQDM:&imgrefurl

2.4 Thu nhận enzyme PME từ nấm mốc Aspergillus niger
Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc thu nhận
enzyme bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn rất khó khăn và tốn kém nên
enzyme thường được thu nhận từ các nguồn sinh học (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế
bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể
tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu
được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng. Việc phân bố của
enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có
nhiều enzyme này song không có enzyme khác. Lượng enzyme lại thay đổi tùy
theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài. Chính vì thế,
việc chọn lựa nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme
cần được quan tâm (Torres et al., 2005).
Enzyme pectin methylesterase có thể được thu nhận từ hai nguồn là thực vật và vi
sinh vật. Trong hầu hết các loại cây ăn trái, đều có sự hiện diện của PME với hàm
lượng khác nhau. Việc ly trích PME thực vật cũng được tiến hành trên nhiều loại
quả như cà chua (Pressey &Woods, 1992; Giovane et al., 1994), cà rốt (Alonso et
al., 2003) hay bơ (Awad &Young, 1980). Mặc dù vậy, việc thu nhận PME từ thực
vật vẫn gặp nhiều hạn chế, rất khó sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme với
quy mô lớn bởi các nhược điểm như:
• Chu kỳ sinh trưởng của thực vật khá dài,
• Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được,

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 12


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

• Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm, không có tính kinh tế khi sử dụng
làm nguồn ly trích enzyme thương mại
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme là giải pháp
khả thi do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật rất ngắn (16 ÷ 100 giờ), tốc độ sinh
sản nhanh. Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng
tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực
vật không tổng hợp được. Nhiều vi sinh vật sinh enzyme thường có khả năng phát
triển trên các môi trường đơn giản, dễ tìm như các phế liệu của các ngành sản xuất.
Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch
muối vô cơ để nuôi vi sinh vật. Chính vì thế, sử dụng vi sinh vật làm nguồn thu
nhận enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao
(Nguyễn Đức Lượng, 2004; Favelar – Torres et al., 2006).
Mặc dù có nhiều giống nấm mốc và vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme PME,
tuy nhiên Aspergillus spp là nguồn chủ yếu ( Patil &Dayanand, 2006; Arotupin et
al., 2008 ; Joshi et al., 2006). Đặc biệt, A.niger có thể sản xuất ra nhiều loại
enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử pectin, gồm pectin
methylesterase,pectin
acetylesterase
,endopolygalacturonase
và
exopolygalacturonase,...Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra
pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và
pectate lyase. Như đã đề cập, A.niger là loài nấm mốc phát triển dễ dàng trên cơ
chất rẻ tiền, đồng thời việc thu nhận enzyme PME từ A.niger cho hoạt tính khá cao
(Deraeve et al., 2003). Ngoài ra, A.niger còn được Viện nghiên cứu thực phẩm và
thuốc của Mỹ (FDA) đã chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS). Chính vì thế quá
trình sinh tổng hợp enzyme PME từ nguồn nấm mốc Aspergillus niger được ưu

tiên chọn lựa.
Hiệu quả của quá trình lên men sinh PME còn phụ thuộc vào rất nhiều thông số
khác như thành phần cơ chất, các vi chất dinh dưỡng và điều kiện lên men. Khi đã
tuyển chọn được chủng vi sinh vật có hoạt tính PME cao thì thành phần cơ chất và
điều kiện lên men là những nhân tố thiết yếu, có ảnh hưởng sâu sắc đến hiệu quả
của quá trình nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme mong muốn (Rao, 2005).
2.5

Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A.niger

2.5.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng
như các enzyme khác từ vi sinh vật, trong đó thành phần pectin giữ vai trò rất quan

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 13


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

trọng (Patil, 2006). Các phụ phẩm nông nghiệp như cám mì (Taragano et al.,
1997), bã mía, bã củ cải đường (Solis-Pereira et al., 1993), xác đậu cô ve (Boccas
et al., 1994), vỏ chanh (Larios et al., 1989), vỏ cam, vỏ bưởi (Hamdy, 2005) và bã
táo (Hours et al., 1988; Joshi et al., 2006) có hàm lượng pectin cao (15 ÷ 25%)
được biết đến như nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase cũng như
PME nguồn gốc vi sinh vật.
Ngoài ra, độ methoxyl hóa cao (65 – 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông

nghiệp chính là điều kiện thuận lợi cho hoạt động của PME (Jayani et al., 2005).
Một ưu điểm khác của việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất cho quá
trình nuôi cấy sinh enzyme PME là sự hiện diện trong nguyên liệu của một số
thành phần nitơ, chất xơ và khoáng cần thiết cho quá trình lên men (Martin et al.,
2004; Favelar – Torres et al., 2006).
Đối với từng loại enzyme chuyên biệt, tỷ lệ tối ưu cho hoạt động cảm ứng của cơ
chất thay đổi khác nhau. Tỷ lệ pectin dao động trong khoảng 2% thường được lựa
chọn cho quá trình lên men sinh enzyme pectin esterase (Grebechova et al., 2007).
Tuy nhiên, việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có hiệu quả rất tích cực trong việc
đẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonad
& Callieri, 2005). Ở cùng một tỷ lệ pectin sử dụng, nguồn gốc nguyên liệu khác
nhau cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính PME thu nhận được (Grebechova et al.,
2007). Chính vì thế, việc khảo sát tỷ lệ pectin thích hợp cho quá trình lên men sinh
enzyme cần phải được tiến hành cho từng cơ chất chuyên biệt và điều kiện nuôi
cấy cụ thể.
2.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME
Bên cạnh ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện môi
trường như độ ẩm, pH, nhiệt độ… Tùy thuộc vào đặc điểm của chủng vi sinh vật
nuôi cấy, phương thức lên men và tính chất enzyme mà điều kiện tối thích cho quá
trình lên men sinh tổng hợp enzyme có thay đổi khác nhau. Việc đo lường hoạt
tính đã chỉ ra sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác
nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave & Goldberg,
1993).
i. Độ ẩm
Độ ẩm cao của môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí, khi đó độ ẩm thấp quá sẽ
kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm cũng như khả năng tạo enzyme.
Bên cạnh đó, độ ẩm của môi trường còn liên quan đến sự kết dính, từ đó ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi cũng như khả năng tạo
enzyme.
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 14


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 ÷ 60% và
phải giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong quá trình nuôi. Độ ẩm vượt quá
70% làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50 ÷ 55% thì kiềm hãm sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme (Ashok et al., 2000).
Ảnh hưởng của không khí: A.niger là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển
bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường phải xốp,
rải thành lớp dày không quá 2,5 ÷ 3 cm, phòng nuôi phải thoáng (Nguyễn Đức
Lượng, 2004)
ii. Nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật và tổng hợp
enzyme. Nếu không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt lực của các
enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30°C. Nhiệt độ
thấp hoặc cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của nấm mốc, đến một mức tới hạn
nào đó sẽ ức chế hoàn toàn sự phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;
Joshi et al., 2006).
Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng như
hoạt tính của enzyme. Thời gian nuôi cấy để thu được lượng enzyme lớn thường
được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì
thường làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo
enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức
Lượng et al., 2004). Nấm mốc Aspergillus niger thường được nuôi cấy trong thời
gian 48 đến 96 giờ cho quá trình sinh tổng hợp PME (Schmitz, 2002; Joshi et al.,

2006).
iii. Nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp enzyme
của vi sinh vật. Cation Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4
sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi. Lưu huỳnh kích thích
tạo enzyme (Lưu huỳnh có trong thành phần các acid amin quan trọng như
methionine, cystein). Ngoài ra, calcium, mangan, corban, … cũng ảnh hưởng đến
sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Theo nhiều tác giả, các ion K+, Na+, Ca2+ có ảnh hưởng tới hiệu quả tác dụng của
PME. Kretovits và Iarovenko (1982) thừa nhận rằng muối Ca2+ và Mg2+ nâng cao
hoạt độ của enzyme, còn các ion Ca2+, Mg2+ và Cu2+ là nhân tố ức chế hoạt động
của enzyme PME. Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl2, H2O2 không có tác dụng tới hoạt
độ PME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO3 với nồng độ thấp có khả năng
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 15


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

nâng cao hoạt độ của enzyme này. Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đưa ra kết
luận EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của
Aspergillus repens, làm giảm hoạt tính PME.
Ngoài các yếu tố ảnh hưởng như trên, khả năng sinh PME còn chịu ảnh hưởng của
các nhân tố khác như: pH, điều kiện thoáng khí, acid amin... Hiểu rõ đặc tính sinh
PME của Aspergillus niger sẽ giúp cho khả năng thu enzyme đạt được hiệu quả
cao nhất (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.6 Giới thiệu sơ lược về táo bưởi, nguồn cơ chất giàu pectin

2.6.1 Táo ta
Táo là một trong các loại cây ăn trái phổ biến nhất được tiêu thụ rộng rãi ở hầu hết
quốc gia, hiện có hơn 7500 loại táo được biết đến (Denes et al., 2000). Bên cạnh
một số giống táo được nhập khẩu và tiêu thụ ở Việt Nam, hai giống táo ta (họ
Rhamnaceae) phổ biến ở Việt Nam là Ziziphus mauritiana và Ziziphus
nummularia cũng được biết đến, tuy nhiên, phổ biến nhất là giống Ziziphus
mauritiana. Táo ta là loại cây ăn quả vùng nhiệt đới. Quả là loại quả hạch, khi chín
nó mềm, chứa nhiều nước, có vị ngọt. Quả có dạng hình trứng xuôi, hình trứng
ngược, tròn hay thuôn dài, lớp vỏ trơn, bóng hay sần sùi, mỏng nhưng cứng,
chuyển từ lục nhạt sang vàng, nếu để chín kỹ sẽ trở thành một trong các màu như
cam cháy, nâu đỏ, đỏ một phần hay toàn bộ. Quả chứa một hột cứng hình ôvan hay
thuôn dài, cứng. Hột chứa 2 hạt hình elip, màu nâu, dài 6 mm (0,25 inch).

Hình 7: Táo ta
/>
Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 16


Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Táo là nguyên liệu quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm. Khoảng 30%
sản lượng táo được sử dụng cho chế biến các sản phẩm khác nhau như nước ép táo,
táo cô đặc, rượu vang táo,…(Joshi et al., 2005).Táo là loại trái cây ăn tươi rất ngon
và tốt cho sức khoẻ.
Ngoài ra, đây còn là loại quả được xếp hàng đầu trong việc cung cấp pectin, chính
vì thế táo ta được biết đến như nguồn sản xuất pectin, cơ chất cho lên men và thu

nhận nhiều loại enzyme từ bã táo và nguồn phân lập, tuyển chọn nấm mốc có khả
năng sinh pectinase nói chung (Martin et al., 2004; Joshi et al., 2005).
2.6.2 Bưởi
Bưởi có tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeek, tên đồng nghĩa Citrus maxima
(Burm.) Merr, C. decumana Merr. Bưởi là giống cây có múi chịu được nóng ẩm,
trồng nhiều ở nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả hình cầu to, vỏ dày, màu thay đổi tùy
theo giống (Nguyễn Hữu Đống, 2003). Hiện nay, bưởi là một trong những mặt
hàng xuất khẩu có giá trị và được trồng phổ biến từ Bắc đến Nam, đặc biệt bưởi
được phân bố ở vùng đồng bằng sông Cửu Long với diện tích lớn.

Hình 8: Bưởi da xanh
/>
Ngoài phần thịt quả có giá trị kinh tế, vỏ quả bưởi còn lại chiếm 35% được biết
đến như là nguyên liệu chứa hàm lượng pectin cao. Hàm lượng pectin hòa tan
trong nước, có độ methoxyl hóa cao (69,32 ÷ 78,68%) chiếm đến 8,12 ÷10,87%,
trong khi pectin hòa tan trong oxalate (có độ methoxyl hóa thấp, từ 21,01 đến
55,41%) chiếm khoảng 4,89 ÷ 8,62% (Chaidedgumjorn et al., 2009). Nghiên cứu
trước đó của Phuangsinou et al. (2008) cho thấy, một giống bưởi lai tạo tại địa

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp và SHUD

Trang 17