Sử dụng bức xạ gamma và chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn để tạo giống lúa chịu hạn

Mở đầu

Lúa là một trong những cây lơng thực quan trọng của con ngời. Trên thế
giới cây lúa đợc xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mỳ về sản lợng và diện tích.
ở Châu á lúa đợc coi là cây lơng thực quan trọng nhất chiếm diện tích 135
triệu ha trong tổng số 148,4 triệu ha của toàn thế giới. Mặc dù sản lợng lúa
gạo hàng năm đều tăng, tuy nhiên theo thông báo của FAO hiện có 39 nớc
đang thiếu lơng thực trong đó có 25 nớc ở Châu Phi.
Trong các yếu tố khí hậu, đất đai, cỏ dại và dịch bệnh, hạn hán là một
trong những yếu tố khốc liệt nhất ảnh hởng lên năng suất cây trồng. Đặc biệt
là đối với cây lúa một cây bán thuỷ sinh thì hạn hán là yếu tố chính làm giảm
năng suất thậm chí làm mất mùa tuỳ vào cờng độ cũng nh thời gian tác động
lên quá trình sinh trởng và phát triển. Theo số liệu thống kê năm 2002 diện
tích gieo trồng lúa hàng năm ở nớc ta biến thiên từ 7,3-7,5 triệu ha trong đó
1,5-1,8 triệu ha đang bị thiếu nớc và 1,5-2,0 triệu ha cần phải đầu t để chống
úng khi gặp ma to và ma tập trung. Điển hình cho hạn hán ở nớc ta phải kể
đến hai năm 1993 và 1998. Trong năm 1993 hạn hán kéo dài ở miền Trung và
Nam bộ làm năng suất lúa giảm từ 4 tấn xuống 2 tấn/ ha. Năm 1998 do hạn
nặng ở cả hai vụ (Xuân và Mùa) đã làm các tỉnh ở miền Trung nh Nghệ An,
Quảng Trị hầu nh không đợc thu hoạch ( Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn).
Vì vậy việc nghiên cứu tính chịu hạn và chọn tạo những giống lúa có
khả năng chịu hạn đã trở thành một trong những nội dung nghiên cứu quan
trọng ở cả Việt Nam và trên thế giới. Các phơng pháp tạo giống truyền thống
trong một thời gian dài đã mang đến những giá trị nhất định trong thực tiễn
sản xuất song còn nhiều hạn chế. Ngày nay việc sử dụng đột biến nhân tạo là
một trong những phơng pháp có giá trị trong chọn giống cây trồng, thuận lợi
chủ yếu của phơng pháp này là kiểu gen của giống ít bị thay đổi hơn so với

1

việc lai tạo hai giống khác biệt mà vẫn có thể cải thiện đợc một số đặc tính và
rút ngắn đợc thời gian chọn lọc. Trong số các tác nhân vật lý gây đột biến thì
tia gamma đợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu chọn giống với mục đích cải
thiện các đặc tính nông học của cây trồng (Nguyễn Hữu Đống) [6].
Cùng với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS-Marker Assisted
Selecsion) liên kết chặt với các gen đặc hiệu đã cho phép các nhà chọn tạo
giống phát hiện ra sự có mặt hay vắng mặt của các gen quan tâm mà không
cần đánh giá kiểu hình, vì thế mà chọn tạo giống đã trở nên nhanh hơn và hiệu
quả hơn. ở lúa chỉ thị STS, SSR liên kết với tính trạng hình thái rễ đang đợc sử
dụng để chọn dòng chịu hạn.
Xuất phát từ những phân tích trên chúng tôi chọn đề tài: S dng bc
x gamma v ch th phõn t liờn kt vi tớnh chu hn to ging lỳa
chu hn. Với mục đích nghiên cứu ảnh hởng của phóng xạ lên khả năng nảy
mầm, sự sinh trởng và phát triển của cây mạ, đánh giá sự thay đổi trong hệ
gen của các dòng chiếu xạ, bớc đầu chọn lọc những dòng có thể mang tính
chịu hạn phục vụ cho công tác chọn giống tiếp theo.

2


Chơng 1. Tổng Quan Tài Liệu
1.1. Đại cơng về cây lúa

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại lúa trồng
Cây lúa là cây trồng có từ lâu đời, gắn liền với quá trình phát triển của
xã hội loài ngời. Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa hoang dại do quá
trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo lâu dài mà nên. Qua các công
trình nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy nguồn gốc của cây lúa là từ vùng
đầm lầy nóng ẩm Đông Nam á, sau đó đợc lan truyền ra nhiều nơi.

Theo đặc điểm sinh vật học và quá trình diễn biến thì lúa trồng thuộc họ
Graminae (nay là Poaceae), chi Oryza, loài Oryza-sativa L. Chi Oryza có 23
loài trong đó có hai loài lúa trồng là Oryza sativa phổ biến ở Châu á và Oryza
glaberrima phổ biến ở Tây Phi (Oka, 1958). Oryza sativa có 3 loài phụ là
Indica (lúa tiên), Japonica (lúa cánh), và Javanica (lúa bù lu). Indica là loại
hình lúa đợc trồng ở các vùng nhiệt đới, Japonica là lúa đợc trồng ở vùng ôn
đới, còn loại hình trung gian Javanica là Japonica nhiệt đới (Glaszman, 1987)
[10].
Lúa trồng hiện nay chủ yếu là Oryza sativa, đây là loại lúa đợc trồng ở
điều kiện ruộng nớc, trong quá trình sống và phát triển chịu sự tác động của
chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mà hình thành nên nhiều loài lúa phù
hợp với điều kiện sinh thái nh: lúa nớc, lúa nơng, lúa nổi
Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L) còn đợc gọi là lúa Châu á vì nó đợc
thuần hoá từ lúa dại từ 3 trung tâm đầu tiên ở Châu á: Assam (ấn Độ), biên
giới Thái Lan-Myanma, và Trung Du Tây Bắc Việt Nam. Theo đặc điểm lúa
trồng việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica (Bùi Huy Đáp, 2000) [5].

3


1.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam và trên thế giới
Lúa là cây lơng thực quan trọng trong đời sống con ngời. Lúa cung cấp
lơng thực cho 1/2 dân số thế giới, trên 2/3 lợng calo cho 3 tỷ dân Châu á , 1/3
lợng calo cho 1,5 tỷ dân Châu Phi và Mỹ La Tinh. Trong cơ cấu sản xuất lơng
thực của thế giới, lúa mỳ chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24% còn lại là các
loại ngũ cốc khác.
Trên thế giới diện tích trồng lúa ở Châu á chiếm 89,5% tổng diện tích
và sản lợng chiếm 91,1% tổng sản lợng. Trong đó ấn Độ là nớc có diện tích
trồng lúa lớn nhất thế giới (42 triệu ha với sản lợng 121,3 triệu tấn), Trung
Quốc là nớc có sản lợng lúa cao nhất thế giới (187,45 triệu tấn), còn Thái Lan

là nớc xuất khẩu gạo đứng đầu thế giới chiếm hơn 30% thị phần của thị trờng
thế giới.
ở Việt Nam lúa là cây trồng chính của hơn 70% dân số. Diện tích trồng
lúa không tăng nhng sản lợng lúa hàng năm đều tăng lên rõ rệt. Đặc biệt 10
năm trở lại đây (1993-2003) sản lợng lúa bình quân tăng một triệu tấn một
năm (Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn). Hiện nay Việt Nam là nớc xuất
khẩu gạo đứng thứ hai thế giới, điển hình là năm 1999 kỷ lục xuất khẩu gạo là
4,55 triệu tấn. Tuy nhiên ở nớc ta năng suất lúa còn cha ổn định do điều kiện
khí hậu và địa hình không bằng phẳng, đồng thời cha chú trọng nhiều đến chất
lợng nên còn nhiều vấn đề bất cập. Vì thế cần phải đầu t hơn nữa để tạo ra các
giống lúa cho năng suất cao, ổn định; phẩm chất tốt; sức chống chịu khá
thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau.

4


1.2. Đại cơng về tính chịu hạn ở cây trồng

1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật
1.2.1.1. Khái niệm và phân loại hạn
Nớc có vai trò quan trọng đối với thực vật, do vậy thiếu nớc sẽ gây nên
những hậu quả lớn cho hoạt động sống của cây. Trớc tiên là ảnh hởng đến cân
bằng nớc trong cây, sau đó ảnh hởng đến quang hợp, hô hấp, trao đổi chất,
sinh trởng và phát triển của cây. Nguyên nhân gây nên thiếu nớc ở cây trồng
thờng là hạn hán.
Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nớc ở thực vật do môi trờng gây
nên trong suốt quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hởng đến sự phát
triển. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển bình thờng và cho năng suất
ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Và khả năng của thực vật
để ngăn ngừa sự tổn thơng do sự thiếu hụt nớc gây ra gọi là tính chịu hạn . Về

mặt cân bằng nớc trong cây thì hạn hán đợc chia làm hai giai đoạn chính: Hạn
không khí và hạn đất.
Hạn không khí thờng xẩy ra khi không khí môi trờng có nhiệt độ cao
(39-42oC) và độ ẩm thấp (dới 65%). ở nớc ta hiện tợng này thờng gặp ở những
tỉnh khu Bốn vào những tháng có gió Tây Nam và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu
và đầu đông. Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí
thờng gây ra hiện tợng héo tạm thời vì làm cho các bộ phận non của cây bị
thiếu nớc. Mức độ phản ửng của cây với sự thiếu hụt nớc tuỳ thuộc từng giai
đoạn phát triển của cây. Đối với cây lúa, hạn không khí ảnh hởng nghiêm
trọng trong giai đoạn bắt đầu hình thành cơ quan sinh sản đến lúc kết thúc quá
trình thụ phấn. Nguy hại nhất là vào giai đoạn lúa phơi màu. Vì nhiệt độ cao
và độ ẩm thấp làm cho hạt phấn không có khả năng nảy mầm , quá trình thụ
phấn không diễn ra làm hạt bị lép.

5


Hạn không khí kéo dài sẽ làm khô đất và dẫn đến hạn đất. Hạn đất sẽ
làm mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh đợc với lực giữ nớc của
đất khiến cây không thể lấy nớc vào tế bào qua rễ, và làm toàn bộ cây bị thiếu
nớc dẫn đến cây bị héo lâu dài. Hạn đất phụ thuộc nhiều vào sự bốc hơi nớc bề
mặt và khả năng giữ nớc của đất. Đất thịt nặng có khả năng giữ nớc cao nhất
(57%), còn đất cát là giữ nớc kém nhất (19%), (McKersie & Cs, 1994).
Nói chung hạn không khí và hạn đất thờng đi song song với nhau và đợc gọi là hạn kết hợp. Đây là loại hạn khốc liệt nhất, nếu kéo dài sẽ làm cây
héo vĩnh viễn không có khả năng phục hồi. Tuy nhiên, cũng có lúc trong đất
đủ nớc mà cây vẫn bị héo nh: khi gặp nhiệt độ quá thấp, thiếu oxy, hay cây bị
ngập mặn hoặc bị bón phân hoá học quá đậm đặclàm hoạt động của rễ bị
giảm sút. Trờng hợp này gọi là hạn sinh lý.
1.2.1.2. Tác hại của hạn lên thực vật
Hạn có tác hại rất lớn. Trớc tiên nó phá vỡ cân bằng nớc trong cây, từ

đó ảnh hởng đến các hoạt động sinh lý khác của cây nh: Hô hấp, quang hợp,
dinh dỡng khoáng, vận chuyển và tích luỹ các chất hữu cơ Hạn ảnh h ởng
tổng hợp lên sinh trởng và phát triển của cây, làm giảm năng suất và thu
hoạch. Hạn kết hợp với gió nóng, khô làm chết phần lớn lá, nhất là những lá ở
tầng dới ( ở cây hoà thảo làm khô đầu lá, cây gỗ thì gây chết ở đỉnh cành).
Hạn gây ra sự mất nớc, để bù lại phần nào lợng nớc mất đi lá phải hút
nớc từ các nụ, hoa và chồi non gây hại trực tiếp cho các bộ phận này. Làm
rụng nụ, hoa và quả non, làm giảm năng suất thu hoạch. Nếu hạn muộn hơn
vào giai đoạn cuối làm ảnh hởng đến sự tạo và vận chuyển dinh dỡng về hạt
làm hạt bị lép ( Trần Nguyên Tháp, 2001) [19]
Về ảnh hởng của hạn đến cấu trúc và chức năng sinh lý của tế bào thì
hàng loạt các nghiên cứu của Maximop, Ratne, Moise đều thống nhất rằng
khi cây bị héo thì trạng thái chất nguyên sinh của tế bào bị thay đổi mạnh. Độ

6


phân tán của hệ thống keo bị giảm , làm giảm khả năng trơng nớc và tính đàn
hồi của keo sinh chất. Các biến đổi trong cây chuyển từ chiều hớng tổng hợp
sang phân giải và hoàn toàn bất lợi cho trao đổi chất của tế bào.
Hạn còn ảnh hởng pha sinh trởng giãn của tế bào. Nếu tế bào đang ở
giai đoạn giãn mà bị thiếu nớc thì tế bào sẽ ngừng sinh trởng và cây còi cọc.
Vì vậy ngời ta có thể điều khiển sinh trởng của cây thông qua việc điều tiết nớc.
1.2.2. Cơ chế chống chịu hạn
Trong cùng một điều kiện hạn, một số cây trồng vẫn sinh trởng phát
triển và hình thành năng suất, trong khi đó một số cây trồng thì không cho thu
hoạch. Nguyên nhân là do chúng có những cơ chế chống chịu hạn khác nhau.
Có ba kiểu chống chịu hạn chính ở cây trồng là: lẩn tránh hạn (trốn hạn), chịu
hạn ở thế nớc trong mô cao và chịu hạn ở thế nớc trong mô thấp.
1.2.2.1. Cơ chế lẩn tránh hạn

Lẩn tránh hạn là khả năng cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của chúng
trớc khi sự thiếu hụt nớc nghiêm trọng xảy ra. Thực vật thuộc nhóm này thờng
là những cây hàng năm, hay những cây đoản sinh trởng sống ở xa mạc. Chúng
có thời gian sinh trởng ngắn. Hạt giống của chúng nảy mầm khi bắt đầu có ma
đất ẩm, sau đó chúng sinh trởng và phát triển nhanh chóng, hình thành hạt và
chết trớc khi mùa khô hạn đến.
Nói chung những thực vật này không có những đặc trng thích ứng cho
chống chịu hạn. Song chúng thờng có thế thẩm thấu thấp nên có thể chống
chịu sự thiếu hụt nớc của môi trờng.

7


1.2.2.2. Cơ chế chịu hạn ở thế nớc trong mô cao
Để duy trì trạng thái nớc luôn cao trong mô khi sự bay hơi nớc mạnh và
độ thiếu hụt nớc trong đất lớn thì cây trồng cần có hai đặc trng cơ bản sau:
Hạn chế sự thoát hơi nớc và duy trì việc cung cấp nớc.
Cây giảm sự thoát hơi nớc bằng ba đờng hớng sau:
- Điều chỉnh sự đóng mở của khí khổng: Khí khổng đợc đặt trong một
biểu bì không thấm nớc và hoạt động nh van điều chỉnh giữa độ ẩm của lá và
độ khô của không khí, tạo ra cơ chế chính kiểm soát tốc độ mất nớc. Đây là cơ
chế sinh lý hiệu quả nhất để hạn chế sự mất nớc. Những cây mọng nớc thờng
đóng khí khổng để giảm mất nớc. Khí khổng của chúng rất nhạy cảm với sự
giảm thế nớc tổng số và có khuynh hớng mở khí khổng vào ban đêm khi sự
thoát hơi nớc là thấp nhất để tiếp nhận co2. Khí khổng của chúng có thể
không mở liên tục, thậm chí đến 40 ngày nh ở cây xơng rồng khi thế nớc của
đất còn thấp hơn thế nớc của cây. Giá trị thế nớc gây ra sự đóng khí khổng ở
những cây khác nhau là rất khác nhau, phụ thuộc vào tuổi lá và điều kiện môi
trờng. Ví dụ khí khổng ở lá dâu đóng ở thế nớc -8 bar, còn ở bông là -28 bar
Tuy sự đóng khí khổng là rất quan trọng để duy trì trạng thái nớc của mô. Nhng nó gây ra hiệu ứng kèm theo là giảm sự trao đổi khí quang hợp, giảm

quang hợp và năng suất. Và khi mất nớc quá nhiều thì khí khổng không còn
khả năng đóng dẫn đến cây mất nớc ồ ạt và chết (Bohnert & Jensen, 1996)
[22].
- Giảm sự hấp thụ bức xạ mặt trời: Cây có thể giảm sự hấp thu bức xạ
mặt trời bằng cách lá vận động song song với tia sáng để nhận ánh sáng ít
nhất, đặc biệt là vào buổi tra. Lá có góc nghiêng 70 độ làm giảm nhiệt độ lá ở
điều kiện khắc nhiệt xuống 2-30C và giảm thoát hơi nớc 8-12% (Jone & Cs,

8


1981) [27]. Ngoài ra sự cuộn tròn lá, sự cụp lá, sự phủ một lớp lông dày hoặc
một lớp sáp dày hay lớp tinh thể muối trên lá cũng tránh đợc sự bay hơi nớc.
Trong một số loài cây nghiên cứu thì lớp sáp ở lúa mỳ là có hiệu quả
cao nhất, và lớp sáp ở lúa nớc là thấp nhất trong họ Graminae (bằng khoảng
1/5 so với lúa mỳ) và hầu nh không có liên quan đến sự thoát hơi nớc
(OToole & Cruz, 1983; Jordan & Cs, 1983) [28] [34].
- Giảm bề mặt bay hơi nớc: Sự thiếu hụt nớc sẽ làm giảm sự sinh trởng
của lá, giảm diện tích lá. Ngoài ra một số lá bị chết đi hoặc bị rụng khi thiếu
nớc cũng làm giảm sự bay hơi nớc. ở lúa mỳ, những giống có bộ lá hẹp đã
làm giảm sự bốc thoát hơi nớc có hiệu quả (Jone & Cs, 1981).
Sự giảm diện tích lá cùng với sự đóng khí khổng, giảm năng luợng hấp
thu đều làm giảm quang hợp, sinh trởng và năng suất.
Cây duy trì duy trì sự hấp thu nớc :
Để duy trì trạng thái nớc cao trong mô thì hệ rễ của cây phải đợc tăng
mạnh về số lợng và mật độ. Bộ rễ phải ăn sâu hơn để lấy nớc ở những tầng đất
sâu khi khô hạn . Vì thế mà tỷ lệ rễ/ thân tăng lên khi gặp hạn. Ngoài ra để
tăng dòng vận chuyển nớc từ rễ lên lá thì đờng kính rễ và số lợng mạch dẫn
phải tăng. Hơn nữa một hệ thống rễ phát triễn ngoài việc giải quyết đợc vấn đề
hạn còn cải thiện đợc sự cạnh tranh với cỏ dại và dành đợc dinh dỡng

(Mambani & Lal, 1983) [31].
1.2.2.3. Cơ chế chịu hạn ở thế nớc trong mô thấp
Một đặc tính thích nghi quan trọng khi cây bị hạn là khả năng duy trì
sức trơng của tế bào khi thế nớc của chúng giảm. Các quá trình sinh lý, sinh
hoá và phát sinh hình thái của cây đều chịu ảnh hởng của sức trơng tế bào. Cơ
chế này ở cây có thể đợc thực hiện nhờ sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và tính
mềm dẻo của mô tế bào.

9


- Điều chỉnh áp suất thẩm thấu:
Khi thực vật tồn tại trong môi trờng thiếu nớc thì sẽ bị mất cân bằng về
thẩm thấu. Để chống lại cây đã có những cơ chế đặc biệt liên quan đến những
thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự tích luỹ các chất tan bao
gồm: các loại đờng, protein, axit amin, ion K+Các chất này có chức năng
điều chỉnh và bảo vệ thẩm thấu loại bỏ gốc tự do khi cây bị thiếu nớc.
Bng1. Các sản phẩm đợc tích luỹ và chức năng của chúng trong việc
chống chịu sự thiếu nớc (Bohnert & Jensen, 1996) [22].
Nhóm chất

Tên chất và hợp chất

Chức năng

Ion

K+

Điều chỉnh thẩm thấu, loại bỏ và thu nhận

Na+ , điều tiết các chất dinh dỡng chính

Protein

Acid amin
Đờng
Polyol

LEA/dehydrin

Bảo vệ thẩm thấu

Osmotin

Các protein hình thành ở điều kiện bất lợi

SOD/catalase

Phân giải gốc tự do

Proline

Điều chỉnh áp suất thẩm thấu

Ectoine

Bảo vệ thẩm thấu

Sucrose

Điều chỉnh thẩm thấu

Fructan

Bảo vệ thẩm thấu, dự trữ carbon

Manitol

Dự trữ carbon, điều chỉnh thẩm thấu

Pinitol

Điều chỉnh và bảo vệ thẩm thấu, loại bỏ
gốc tự do

Polyamin

Spermine

Cân bằng ion, bảo vệ chất nhiễm sắc

Spermidine
Amin bậc 4 Glycine betaine

Bảo vệ thẩm thấu

- Alanine betaine

Bảo vệ thẩm thấu

Dimethyl sylfonio

Bảo vệ thẩm thấu

propionate
Sắc tố và

Carotenoid, anthocyanin Bảo vệ quang ức chế

carotenoid

betalaine

10


- Sự mềm dẻo của mô: tính mềm dẻo của mô cũng liên quan đến sự điều
chỉnh sức trơng của mô tế bào. Tế bào càng nhỏ, tính dẻo dai của mô càng cao
thì duy trì sức trơng của chúng tốt hơn.
1.2.2.4. Cơ chế phục hồi sau hạn
Cơ chế phục hồi là khả năng huy động các cơ chế sửa chữa khi tái hấp
thụ nớc đem lại sự phục hồi các tổn hại trong quá trình khô hạn. Tham gia vào
cơ chế phục hồi này là các protein và các chất tan khác.
Các protein có bản chất là protease phân giải các protein bị phá huỷ
không thể sửa chữa do tác động của khô hạn (Guerrero & Cs, 1990) [25].
Các protein sốc nhiệt HPS (Heat Shock Protein) là các protein kèm có
chức năng sửa chữa, giúp các protein khác phục hồi lại cấu trúc tự nhiên sau
khi bị biến tính hoặc bị tháo xoắn khi có hạn (Kiyosue & Cs, 1994) [30].
Nhiều chất tan trong điều chỉnh thẩm thấu của tế bào trong điều kiện
bất lợi cũng có tác dụng trong quá trình phục hồi của cây. Sự tích luỹ protein

khi thiếu nớc có thể có chức năng khác nh bảo vệ Enzym và giữ ổn định màng
sinh học. Sự phân giải proline có thể tăng năng luợng của tế bảo phục hồi
(Saradhi, 1991) [36].
1.2.3. Các biện pháp khắc phục nâng cao tính chịu hạn
Để khắc phục và nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trồng, hiện
nay có những biện pháp sau:
Biện pháp kỹ thuật: Sử dụng phơng pháp tôi hạt giống của Ghenken, xử
lý hạt giống bằng các nguyên tố vi lợng (Mo, Zn, Cu, Bo). Những nghiên
cứu gần đây trên các vùng hạn nặng ở Châu Phi cho thấy, có khả năng sử dụng
các chế phẩm hoá học đặc hiệu để làm tăng tính chịu hạn cho cây. Cơ sở khoa
học của biện pháp này là sử dụng các chất chống thoát hơi nớc. Các chất thờng sử dụng là: Axit usnic, usanat amon, axetat phenyl đồng Thực nghiệm

11


cho thấy khi sử dụng axit usnic bón vào đất trớc khi gieo hạt đã làm tăng năng
suất đậu đỗ lên đáng kể so với đối chứng cùng trồng trong điều kiện khô hạn.
Khi bón 12,5 kg axit usnic năng suất hạt tăng 37,7% [12].
Biện pháp thứ hai là chọn tạo và sử dụng các giống chịu hạn. Đây là
biện pháp tích cực, lâu dài và cho hiệu quả cao nhất. Đặc trng cơ bản là tính
chín sớm, tuy năng suất của chúng thấp nhng lại có khả năng sử dụng nớc rất
tiết kiệm. Để chọn giống chịu hạn nguời ta thờng dựa vào các đặc điểm hình
thái nh: Các đặc trng về bộ rễ, khí khổng, độ rắn và độ dày của lá, hình dạng
màu sắc lá, sự định hớng của lá, độ dày của tầng cutinNgoài ra còn căn cứ
vào chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá và quá trình trao đổi chất khi gặp hạn nh: Khả
năng quang hợp, sự tích luỹ protein, hàm lợng axit absicic Cùng với sự ra
đời của các chỉ thị phân tử liên kết với các đặc trng chống chịu hạn, đã tạo ra
bớc tiến mới trong công tác chọn giống cây trồng.
ở lúa những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá
của hai nhóm: lúa nớc, lúa cạn và lúa chịu hạn cho thấy:

- Bộ rễ của nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn ăn sâu hơn đáng kể so với
nhóm lúa nớc. Sự phân bố khối lợng rễ của nhóm lúa nớc tập trung chủ yếu ở
lớp đất mặt 0-20 cm ( đạt khoảng 85-91%). Còn đối với nhóm lúa cạn và lúa
chịu hạn ở tầng đất 61-80 cm vẫn còn đạt 3,6-7,3%.
- Lá của nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn dày hơn, mật độ khí khổng ít
hơn, màu sắc lá xanh nhạt hơn do hàm lợng diệp lục a, b ít hơn và hàm lợng
sắc tố carotenoid nhiều hơn nhóm lúa nớc.
- Các số liệu phân tích về hàm lợng proline cho thấy trong điều kiện đủ
nớc thì hàm lợng proline của hai nhóm trên là nh nhau. Nhng trong điều kiện
thiếu nớc hàm lợng proline trong lá của nhóm lúa cạn và chịu hạn tăng lên,
còn nhóm lúa nớc lại giảm đi rõ rệt. Điều này cho thấy hàm lợng proline trong

12


lá là nhân tố quan trọng trong việc giữ nớc và cân bằng nớc trong mô tế bào
(Nguyễn Tấn Hinh, Trơng văn Kính, 2002) [3].
1.3. Một số phơng pháp tạo dòng chịu hạn

1.3.1. Chọn dòng chịu hạn thông qua kỹ thuật chọn dòng tế bào
Kỹ thuật chọn dòng tế bào chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trờng thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đang là công cụ có hiệu
quả cao trong chọn giống cây trồng. Sự xuất hiện các biến dị soma xảy ra
trong nuôi cấy đặc biệt là dới tác động của tác nhân và điều kiện chọn lọc, đã
giúp các nhà khoa học phân lập ra các tế bào có khả năng chịu hạn khá. Các
chất gây áp suất thẩm thấu nh PEG, Manitol, Sorbitol, Sucrose đợc xem nh
tác nhân gây khô hạn trong môi trờng nuôi cấy. Các chất kìm hãm sinh trởng
nh axit abcisic, đợc coi là nhân tố tác động để tăng cờng khả năng giử nớc và
chịu mất nớc của mô.
1.3.2. Chọn dòng chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen
Có thể nói chịu đợc hạn và hình thành năng suất trong điều kiện hạn là

kết quả tổng hợp của sự tác động đa gen trong các thời kỳ sinh trởng và phát
triển (bao gồm sinh trởng của bộ rễ, đặc điểm chống chịu hạn của thân lá, khả
năng phục hồi sau hạn, các yếu tố cấu thành năng suất).
Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra các nhóm gen chịu các điều kiện
bất lợi về nớc nh: Nhóm gen LEA của cây lúa mạch mã hoá protein trong giai
đoạn muộn của qúa trình hình thành phôi, giúp bảo vệ phôi trong quá trình
ngủ nghỉ và chịu hạn của phôi trong hạt khô (Xu & Cs, 1996). Nhóm gen
RAB (Responsive to Absicis acid) của cây lúa nớc, phản ứng với ABA nội
sinh và ngoại sinh cho ra những protein có chức năng ức chế và bảo vệ thẩm
thấu (Claes, 1990; Yamaguchi 1989). Nhóm gen thuộc chu trình sinh tổng hợp
proline, các gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu[13].

13


1.3.3. Chọn dòng chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử MAS
MAS (Marker Assisted Selection) và bản đồ di truyền đã cho các nhà
chọn giống thấy rõ mối quan hệ giữa tính trạng-gen-môi trờng. Nhờ những chỉ
thị phân tử liên kết chặt với các gen quan tâm cho phép chọn lọc các cá thể
ngay ở giai đoạn sớm mà không cần đánh giá kiểu hình cũng nh không phụ
thuộc vào điều kiện môi trờng. Đối với lúa MAS đã đợc ứng dụng với các gen
kháng bệnh bạc lá, đạo ôn và ruồi đục thân. Bằng con đờng MAS ngời ta đã
qui tụ đợc một số dòng mang 2, 3 và 4 gen kháng bệnh bạc lá (Huang et al,
1997); qui tụ thành công 3 gen kháng nấm đạo ôn và đa gen kháng ruồi đục
thân Gm2, Gm4t, Gm7 vào các giống lúa có tiềm năng năng suất cao [17].
Đối với gen tính trạng số lợng (đặc biệt là các gen chống chịu điều kiện
bất lợi) việc ứng dụng MAS còn nhiều khó khăn và đến nay mới đạt đợc
những kết quả bớc đầu nh việc lập bản đồ và xây dựng QTL (Quantitative
Trait Loci) cho một số tính trạng ở lúa nh tính chịu hạn, tính chịu nhôm . Về
tính chịu hạn thì MAS liên kết với tính trạng hình thái rễ nh: độ dài rễ, số lợng

rễ, tỷ lệ khối lợng khô của rễ trên thân, tỷ lệ khối lợng khô của rễ sâu trên
thân... đang đợc quan tâm [9].
1.4. Đột biến phóng xạ trong tạo giống

1.4.1. Các thành tựu về chọn tạo giống đột biến
Tạo giống đột biến đã có lịch sử phát triển lâu đời và rộng lớn. Tuy
nhiên, đến năm 1909 khi Hugo De Vries tiến hành nghiên cứu và đa ra học
thuyết đột biến thì nó mới đợc chấp nhận. Đến năm 1953 ngời ta đã tìm ra các
hoá chất siêu đột biến nh: Ethylenimine (EI), Ethylmethane sulphonate
(EMS), Nitrozoethylurea (NEU), Diethylsulphonate (DES) Những chất này
có thể gây đột biến ở cây trồng, động vật, thậm chí ở cả vi sinh vật. Cùng với
những khám phá về cấu trúc vật liệu di truyền của Watson và Crick đã mang

14


lại nhiều tiến bộ mới trong nghiên cứu cơ chế đột biến ở mức độ phân tử, quá
trình tự sửa chữa và tạo đột biến.
Từ năm 1965 trở đi những nghiên cứu về đột biến tiếp tục phát triển.
Tạo đột biến không chỉ là một phơng pháp hữu hiệu để tạo giống cây trồng mà
nó còn làm tăng tính đa dạng sinh học. Nhiều nớc đã chú trọng áp dụng tác
nhân gây đột biến nhân tạo trong chọn tạo giống mới nh: Mỹ, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Indonesia, Philippine, Malaysia, ấn Độ, Trung Quốc, Bagladesh,
Mianma, Thái Lan và Việt Nam. Một số giống lúa đột biến nổi tiếng đã đợc
biết đến nh: Reimei (Nhật Bản, 1966), Jagannath (ấn Độ, 1969), Calrose (Mỹ,
1976), RD-6 (Thái Lan, 1977), Basmati 615 (ấn Độ), Sheshu-802 (Trung
Quốc)
Theo tài liệu của FAO/IAEA đến 7/2000 trên thế giới có hơn 2225
giống cây trồng trong sản xuất đợc chọn tạo bằng đột biến gen. Trung Quốc là
nớc dẫn đầu về số lợng đột biến nhân tạo đợc công nhận, chiếm 27,2% tổng số

giống đột biến trên thế giới.
ở Việt Nam đột biến thực nghiệm đã đợc khởi xớng vào năm 1960 bởi
Lơng Đình Của. Tuy nhiên nó chỉ phát triển từ năm 1980 bởi Phan Phải và đội
nghiên cứu của ông. Sau đó nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu đột biến ở
nhiều loại cây trồng khác nhau nh: Lúa, ngô, đậu, táo, cà chua, da hấu, lạc
Nhiều dòng cây đột biến có giá trị cao đã đợc tạo ra và chọn lọc để sử dụng
trực tiếp trong sản xuất, hoặc gián tiếp cho việc lai tạo ra giống mới. Đến nay
có nhiều giống đột biến đã đợc công nhận là giống quốc gia nh: Giống lúa
DT10, DT11, DT13, DT33, A20, Xuân số 5, Tám thơm, CM1, CM6 ; Giống
đậu phộng V70;Giống đậu nành DT84, DT95; Giống bắp DT6, DT8; Giống
cà chua số 7 và 214, giống đào tiên, giống táo má hồng Các giống này có u

15


®iÓm lµ cho s¶n lîng cao, chÊt lîng tèt, cøng c©y, chèng chÞu s©u bÖnh vµ ®iÒu
kiÖn bÊt lîi cña m«i trêng kh¸.

16


1.4.2. Đột biến và các nhân tố gây đột biến
Đột biến (Mutation), bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mutatio, là những biến
đổi trong vật chất di truyền, nghĩa là những biến đổi trong cấu trúc gen, hoặc
các biến đổi trong cấu trúc và số lợng nhiễm sắc thể. Đột biến tạo nên vô số
các biến dị, làm tăng tính đa dạng trong sinh giới, là cơ sở của quá trình chọn
lọc.
Trên cơ sở nguyên nhân phát sinh đột biến, nguồn gốc và đặc điểm của
đột biến mà đột biến đợc chia làm nhiều loại khác nhau. Dựa vào thành phần
cấu trúc bị đột biến có thể chia đột biến thành bốn nhóm là đột biến gen, đột

biến cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến số lợng nhiễm sắc thể và đột biến tế bào
chất. Dựa vào nguyên nhân phát sinh đột biến các đột biến đợc chia thành hai
nhóm: đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo. Dựa vào hậu quả đột biến chia
thành: đột biến gây chết, đột biến giảm sống, đột biến làm xuất hiện làm xuất
hiện những đặc điểm mới nh đột biến chịu lạnh, mặn, hạn và đột biến trung
tính.
Trong tự nhiên cũng có đột biến nhng với tần số thấp khoảng 10 -6-10-8
cho mỗi gen hoặc locus. Trong khi đó đột biến nhân tạo gây ra bởi các tác
nhân gây đột biến vật lý và hoá học đã làm tăng tần số đột biến lên 10-100
lần. Về tác nhân gây ra đột biến có thể chia làm hai loại là: tác nhân vật lý và
tác nhân hoá học.
Tất cả nhân tố vật lý gây biến tính ADN, gây đứt đoạn hoặc làm hỏng
cấu trúc của ADN đều gây đột biến bao gồm: nhiệt độ; các loại tia UV, tia X,
tia beta (), tia alpha (), tia gamma () Riêng tia UV có năng l ợng thấp
không đủ gây ion hoá, khả năng xuyên sâu kém nên chỉ đợc sử dụng để gây
đột biến ở hạt phấn, tế bào trần, vi sinh vật.

17


Các nhân tố học gây đột biến chủ yếu do làm thay đổi cấu trúc gen và
cấu trúc nhiễm sắc thể. Các hoá chất gây đột biến có khả năng thẩm thấu cao
qua màng tế bào, màng nhân và đồng thời gây thay đổi trạng thái của ADN và
nhiễm sắc thể. Tác nhân hoá học gây đột biến có thể chia thành các nhóm sau.
Acid nitơ (HNO2) và dẫn xuất của nó; các chất alkyl hóa nh EMS, EI, NMU...;
các chất acridin nh proflavin; các chất đồng đẳng của base nitơ nh 5bromuracin, aminopurin...
1.4.3. Bức xạ ion hoá và cơ chế gây đột biến
1.4.3.1. Bức xạ ion hoá
Tia X: Có bản chất là sóng điện từ có bớc sóng dới 10 A0. Tia X có hai
loại là tia X cứng có bớc sóng từ 0,01-0,05 A0 và tia X mềm có bớc sóng từ 110 A0, đợc tạo nên từ các máy phát Rơnghen. Tia X không bị lệch bởi điện trờng và từ trờng, có khả năng xuyên sâu kém, dùng trong y học là chủ yếu.

Tia gamma: Là tia có bớc sóng ngắn nhất, dới 1 A0 nên hiệu quả xuyên
thấu hơn tia X. Tia gamma thờng xuất hiện trong quá trình phân rã hạt nhân
các đồng vị phóng xạ hoặc các phản ứng hạt nhân. Có hai nguồn phát tia
gamma là Co60 và Cs137. Tia gamma cũng không bị lệch bởi điện trờng và từ trờng, có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện để xử lý cây trồng.
Tia alpha: Là tia có bản chất hạt đợc hình thành từ hạt nhân của nguyên
tử He (helium). Hạt alpha có khả năng xuyên sâu 0,07 mm trong mô sinh vật.
Tia beta: Là chùm điện tử giải phóng ra từ nguyên tử của các đồng vị
phóng xạ P32 và S35 , tia beta ít đợc dùng trong gây đột biến nhân tạo .
Liều lợng phóng xạ đợc xác định bằng cách đo khả năng ion hoá của
phóng xạ trong không khí, đơn vị là r (Roentgen). Năng lợng hấp thụ đợc đo
bằng rad (1rad = 100 erg/g). Hai đơn vị r và rad đợc coi là tơng đơng nhau.
1R = 1 rad = 2,58.10-4 culông/ kílôgam không khí

18


1 GY (gray) = 100 rad
Tia phóng xạ ion hoá gây tổn thơng cấu trúc ADN, do bức xạ ion hoá
có thể gây đứt mạch đơn, đứt mạch kép hoặc thay thế các bazơ nitơ. Đối với
sinh vật nhân chuẩn bức xạ ion hoá làm đứt gãy nhiễm sắc thể, thờng gây
chết. Nhiều loại sinh vật trong tế bào có hệ thống tự sửa chữa đột biến, tuy
nhiên có thể dẫn đến đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn và mất đoạn.
1.4.3.2. Cơ chế tác động
Hiện nay có nhiều thuyết khác nhau giải thích cơ chế gây đột biến của
bức xạ ion hoá.
Thuyết bia: Thuyết bia cho rằng các tế bào, các cơ thể sinh vật có
những trung tâm nhạy cảm phóng xạ đợc coi là những đơn vị cảm ứng nh một
cái bia. Khi các lợng tử hay các hạt cơ bản va chạm vào đơn vị cảm ứng này sẽ
gây ra các biến đổi dẫn đến đột biến. Khi tăng liều lợng phóng xạ quá ngỡng,
hiệu ứng phóng xạ sẽ giảm do có sự va chạm tiếp theo với các nhân tố vật chất

đã chết.
Thuyết độc tố: Thuyết độc tố cho rằng tác động của tia bức xạ đối với tế
bào sinh vật tạo nên các hợp chất độc.
Thuyết Enzym: Thuyết enzym cho rằng tia bức xạ làm thay đổi tính
thấm của màng tế bào, làm cho các enzym trong lyzoxom bị giải phóng vào tế
bào chất gây rối loạn sự trao đổi chất của tế bào.
Thuyết cơ chế tác dụng gián tiếp: Bức xạ ion hóa tác dụng gián tiếp lên
phân tử nớc trong tế bào tạo nên các gốc tự do. Các gốc tự do có thể tác động
với các chất trong tế bào tạo thành peroxyt. Các peroxyt tác dụng lên phân tử
ADN làm mất gốc NH2 của gốc dị vòng chứa nitơ, làm mất nguyên tử hyđro
hoặc làm đứt liên kết giữa đờng pentoza và gốc dị vòng chứa nitơ, hoặc làm
đứt vòng pirimidin gây đứt mạch ADN, gây ra các đột biến gen.

19


Thuyết hiện đại: Thuyết hiện đại giải thích cơ chế tác dụng của tia
phóng xạ nên vật chất di truyền bằng nồng độ và trạng thái của các chất hữu
cơ trong tế bào. Khi tế bào có nồng độ các chất hữu cơ cao, sự va chạm của lợng tử vào các phân tử nhiều hơn dẫn đến hiệu quả trực tiếp lớn hơn. Nếu
nồng độ thấp, các lợng tử phóng xạ phân huỷ nớc tạo thành các gốc tự do,
hình thành các peroxyt vô cơ và hữu cơ làm biến đổi cấu trúc ADN gây ra đột
biến.
1.4.4. Phơng pháp đột biến nhân tạo ở cây trồng
Nguyên tắc cơ bản để gây tạo đột biến thành công là dựa vào đặc điểm
sinh trởng, phát triển của cây trồng để chọn phơng pháp và tác nhân gây đột
biến thích hợp. Đột biến có thể xuất hiện ở bất cứ tế bào nào của cơ thể. Tuy
nhiên, những cây sinh sản bằng hạt thì chỉ có những đột biến nào xuất hiện
trong tế bào của phôi hay từ những tế bào xôma thông qua hàng loạt lần phân
chia để hình thành các tế bào sinh dục thì mới đợc di truyền cho đời sau (Trần
Duy Quý) [15].

Đa số các đột biến là đột biến lặn. Do đó ở đời M1 không biểu hiện ra
bên ngoài trừ trờng hợp đột biến trội và trội không hoàn toàn. Tuy vậy không
phải bao giờ cũng phát hiện đợc đột biến trội và nửa trội vì có một số tính
trạng đợc qui định bởi sự tác động của đa gen, các gen riêng rẽ thì không đủ
để biểu hiện dấu hiệu đó nh tính trạng năng suất hạt, tính chống chịuNh ng
đó lại là những đột biến nhỏ rất có giá trị về phơng diện chọn giống.
Mặt khác đột biến thực nghiệm còn giúp ta khắc phục đợc hiện tợng
không lai đợc ở một số loài không có hoa hoặc có hoa, quả nhỏ nh lúa, cao lơng. Với đột biến phóng xạ, để thu nhận nhiều đột biến ta cần phải chiếu xạ ở
liều lợng đủ lớn để gây ra biến dị di truyền có lợi mà không gây chết nhiều
cũng nh tăng độ bất thụ. Do đó với mỗi loại cây trồng cần tìm ra ngỡng tới
hạn, là ngỡng làm giảm mạnh khả năng sống (chỉ còn 30-40% số cây sống sót

20


sau chiếu xạ), giảm độ hữu thụ và gây chết. Các cây khác nhau thì có liều tới
hạn rất khác nhau, xê dịch rất lớn từ 5-20 krad khi chiếu xạ ở hạt khô. Từ liều
tới hạn ta sẽ tìm ra liều lợng thích hợp nhất cho công tác chọn giống. Thờng
thì liều chiếu xạ thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần là đợc, tốt nhất là sử dụng liều
chiếu xạ chỉ làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trởng. Sau đây là liều
lợng chiếu xạ và liều lợng tới hạn ở một số cây trồng chính (bộ phận chiếu xạ
là hạt khô).
Bng 2. Liều tới hạn và liều chiếu xạ ở một số cây trồng chính
Cây trồng

Liều tới hạn (krad)

Liều chiếu xạ

Lúa mỳ

10-15

(krad)
5-10

Lúa nớc

30-35

15-20

Ngô

10-15

10-15

Đậu tơng

12-15

5-8

1.5. Một số chỉ thị phân tử sử dụng Trong chọn dòng
chịu hạn ở lúa

1.5.1. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase), đợc Kary Mullis & Cs phát
minh vào năm 1985. Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN với sự

tham gia của các thành phần chính bao gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi
(primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR. Phản ứng đợc thực
hiện trong máy chu trình nhiệt hay còn gọi là máy PCR.
Đoạn khuôn có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nhân gen qua PCR.
Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn hoặc ARN đợc tách chiết từ
đối tợng cần nghiên cứu. PCR chỉ cần một lợng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ

21


20-100 ng, phản ứng lại rất nhạy nên đòi hỏi ADN khuôn có độ nguyên vẹn
cao và không bị lẫn tạp.
Mồi PCR là những đoạn oligonucleotid mạch đơn kích thớc từ 6-70
bazơ, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự ở hai đầu mạch khuôn. Để đảm
bảo hiệu quả PCR, cần thiết kế các mồi xuôi và ngợc có trình tự không bổ
sung cho nhau, với hàm lợng G, C từ 40-75%, và phải đảm bảo Tm (nhiệt độ
nóng chảy) không chênh lệch nhau quá lớn. Hơn nữa khoảng cách giữa mồi
xuôi và mồi ngợc không nên quá 1kb.
Enzym DNA polymerase thờng sử dụng là Taq polymerase, một loại
enzym chịu nhiệt đợc chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus có khả năng
phát triển ở nhiệt độ cao (70-75 0C). Taq polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt
độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra chính xác và đặc hiệu. Nồng độ Taq tối
u cho phản ứng khoảng 0,5 UI/25l.
Nồng độ các loại nucleotid khoảng 20-200 M mỗi loại. Sự mất cân
bằng trong hỗn hợp dNTPs sẽ làm giảm độ chính xác của Taq polymerase.
Nồng độ các ion trong dung dich đệm, đặc biệt là ion Mg ++, có vai trò rất quan
trọng trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hởng đến hoạt độ của Taq polymerase,
nồng độ thích hợp là khoảng 0,5-5 mM.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn biến tính, phân tử ADN đợc biến tính ở

nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của ADN khuôn một ít, thờng là 94-950C
trong 30 giây đến 1 phút, nếu ADN khuôn có tỉ lệ G C cao, chuỗi GC liền
nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp. Giai đoạn gắn mồi, mồi bắt cặp
với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung, nhiệt độ gắn mồi khoảng 30 0C đến
650C tuỳ thuộc vào độ dài của mồi, thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn
tổng hợp, đợc tiến hành ở 720C là nhiệt độ tối u cho Taq polymerase hoạt
động, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 5 phút.

22


Kết thúc mỗi chu kỳ lợng ADN tăng lên gấp đôi và ADN đợc nhân lên
sẽ trở thành ADN khuôn cho những chu kỳ sau. Thông thờng đặt khoảng 3060 chu kỳ. Tuy nhiên số chu kỳ quá lớn sẽ làm tăng sự sai lệch trong quá trình
tổng hợp. Vì theo lý thuyết enzym Taq có thể tổng hợp nhầm nucleotid với tỷ
lệ 1/106 và tỷ lệ này sẽ tăng dần theo số chu kỳ. Đồng thời số chu kỳ tăng nh ng sản phẩm lại không tăng, do sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng,
xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, số các bản sao tạo ra quá nhiều
nên các bản sao không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Hồ Huỳnh Thuỳ
Dơng, 1998).
Nhờ tính đặc hiệu và nhanh chóng mà kỹ thuật PCR từ khi ra đời đã có
những ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong
sinh học phân tử và công nghệ gen. Nó đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các
chỉ thị phân tử khác dựa trên phản ứng PCR nh: RAPD, AFLP, SSR, STS
1.5.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng
Phơng pháp RAPD (RADNom Amplified Polymorphic DNAs) đợc
William & Cs đề xuất năm 1990, thực chất là quá trình nhân bản các đoạn
ADN bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi đợc thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi
này sẽ bắt cặp với ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào có trình tự bổ sung với nó.
Mồi ngẫu nhiên là các đoạn nucleotid từ 9-12 bases. Phơng pháp này tạo ra từ
1-10 đoạn từ một mồi đơn qua phản ứng PCR (Reiter et al, 1992) [38]. Cho sự
đa hình cao và có thể đợc xác định dễ dàng bằng nhuộm EtBr các băng trên

gel agarose.
Các đoạn nhân lên bởi RAPD có kích thớc từ nhỏ hơn 100 bp đến lớn
hơn 2 kb. Và chỉ thị RAPD đợc xem nh là yếu tố trội trong di truyền Mendel ở
một cơ thể lỡng bội vì nó không phân biệt đợc cây dị hợp tử với cây đồng hợp
tử trội.

23


u điểm của RAPD là chỉ cần một lợng ADN nhỏ từ 25-100 ng cho một
phản ứng. Các mồi ngẫu nhiên không đòi hỏi trình tự ADN trong cơ thể
nghiên cứu và bộ mồi có thể đợc sử dụng cho nhiều loài khác nhau. Mỗi mẫu
cung cấp số liệu của nhiều locus trong hệ gen. Vì vậy những đa hình hiếm
trong các cá thể có quan hệ gần gũi có thể đợc phát hiện nhanh chóng.
RAPD thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử
dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) và phân tích dòng gần đồng
gen (near isogenic line) là các dòng chỉ khác nhau ở một tính trạng.
Trong phản ứng RAPD đoạn mồi gắn với ADN khuôn ở nhiệt độ không
cao (30-400C) và các mồi ngẫu nhiên, ngắn nên khả năng tìm điểm gắn trên
phân tử ADN là tơng đối dễ dàng. Nhng do mồi ngắn nên dễ bị ảnh hởng bởi
các điều kiện gắn mồi, vì thế kết quả nhiều khi không đồng nhất. Và đôi khi
hai đoạn ADN có kích thớc nh nhau từ hai cá thể cùng loài có thể không đợc
tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen (Brown, 1996) [23].
1.5.3. Kỹ thuật SSR và ứng dụng
SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại
đơn giản, còn gọi là phơng pháp vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (Microsetllite). Bộ
gen của Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thớc dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài từng giống. Ví dụ ở lúa có khoảng gần
1000 lần lặp lại trình tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trình tự
GATA/CTAT. Nhiều loài cây một lá mầm nh ngô, lúa lặp lại đoạn CGG/GGC.
Các đoạn ADN thờng nằm gần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể, có

vai trò giữ tính ổn định của bộ nhiễm sắc thể qua quá trình phân bào [16].
Do sự sai khác về kích thớc các đoạn lặp lại, nên kỹ thuật SSR rất thích
hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. SSR là chỉ thị đồng
trội nên đuợc sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử trong quần thể F 2. Mồi

24


SSR thờng dài khoảng 18-20 bases. Mỗi mồi có từ 1-12 locus đợc tổ hợp trong
một phản ứng PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locus nên
tiết kiệm đợc đáng kể thời gian và hoá chất.
Hạn chế của SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc xây
dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Bao gồm việc tách dòng và
đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR. Tuy nhiên nhiều
thành công đạt đợc đã khiến giá thành của nó giảm đi (Brown, 1996). Sản
phẩm PCR sau đó đợc xác định chính xác bằng điện di trên gel acrylamide và
nhuộm bạc.
ở lúa các chỉ thị SSR đợc xác định là liên kết chặt với một số tính trạng
hình thái đã đợc sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn nh: RM104 liên kết
với tính trạng chiều cao cây; RM250, RM270 liên kết với độ dài rễ; RM156
liên kết với tính trạng số lợng rễ; RM263 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của
rễ trên thân; RM221, RM242, RM228 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ
sâu trên thân (Nguyễn Đức Thành, 2001) [18]. Đặc biệt là các locus RM221
trên NST số 2, RM242, RM288 trên NST số 9 có ảnh hởng lớn đến khả năng
chịu hạn của các dòng lúa chọn lọc và có thể sử dụng nh một chỉ tiêu trong
chọn dòng chịu hạn (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [9]. Các locus kiểm soát rễ
dài, rễ dày nh RM29 trên NST số 1;RM234, RM248 trên NST số 7 cũng đợc
xem là những chỉ thị chuẩn trong chọn lọc các cá thể chịu hạn (Shen & Cs,
1999) [37].
1.5.4. Kỹ thuật STS và ứng dụng

Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) tức điểm trình tự đợc đánh dấu,
do Olson & Cs đề xuất năm 1989. STS có thể xem nh là một kỹ thuật thay thế
RFLP và RAPD. Nguyên lý của STS là: Xác định trình tự các nucleotid ở hai
đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong RFLP hay sản phẩm
RAPD. Sau đó dựa vào trình tự đã biết thiết kế mồi PCR có chiều dài 18-20

25