Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (vigna radiata (l ) wilczek) phục vụ cho chuyển gene (LV00409)

1

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh
học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn
tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà,
cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh
học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn PSG.TS Đinh Thị Kim Nhung, TS. Điêu Mai Hoa và
các thầy cô giáo trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến
thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian học và
làm đề tài luận văn.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.

Tác giả

Hoàng Thị Thúy


2

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa
được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả

Hoàng Thị Thúy

năm 2010


3

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU

1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. CÂY ĐẬU XANH

3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây đậu xanh

3

1.1.2. Đặc điểm sinh hoá của cây đậu xanh

4

1.1.3. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

6

1.2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

7

1.2.1. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

7

1.2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

9

1.2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

11

1.2.4. Hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây

18

1.2.5. Những tồn tại của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và phương hướng 20
giải quyết
1.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI
SINH ĐẬU XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

21

1.3.1. Một số thành tựu về nuôi cấy mô, tế bào thực vật trong và ngoài nước

21

1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh

23

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

25

2.1. VẬT LIỆU

25


4
2.1.1. Vật liệu thực vật

25

2.1.2. Hoá chất và thiết bị

25

2.2. PHƯƠNG PHÁP

26

2.2.1. Khử trùng hạt, tạo cây con nuôi in vitro

27

2.2.2. Tái sinh cây đậu xanh thông qua mô sẹo

27

2.2.3. Tạo đa chồi cây đậu xanh

29

2.2.4. Môi trường kéo dài chồi

30

2.2.5. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh

31

2.2.6. Phương pháp ra cây

31

2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

33

3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH THÔNG
QUA MÔ SẸO

33

3.1.1. Tạo mẫu đậu xanh sạch in vitro

33

3.1.2. Cảm ứng tạo mô sẹo đậu xanh

35

3.2. TẠO ĐA CHỒI IN VITRO

40

3.2.1. Tạo đa chồi từ lá mầm

40

3.2.2. Tạo đa chồi từ chồi ngọn

42

3.2.3. Tạo đa chồi từ đốt thân

44

3.3. MÔI TRƯỜNG KÉO DÀI CHỒI

45

3.4. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG
TẠO RỄ

47

3.5. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN RA RỄ TỚI SỨC
SỐNG CỦA CÂY

49

3.6. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GIÁ THỂ TỚI SỨC SỐNG
CỦA CÂY

51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

55

PHỤ LỤC

60


5
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Danh mục các bảng

Trang

2.1 Đặc điểm của giống đậu xanh nghiên cứu

25

2.2 Nồng độ 2,4D trong các công thức môi trường tạo mô sẹo

28

2.3

Môi trường tạo đa chồi

30

2.4 Môi trường kéo dài chồi

31

2.5 Công thức môi trường ra rễ cây đậu xanh

31

3.1

34

Kết quả tạo vật liệu vô trùng sau 4 ngày nuôi cấy

3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá sau
4 tuần nuôi cấy

36

3.3

38

Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ thân cây
sau 4 tuần nuôi cấy

3.4 Ảnh hưởng của các chất KTST đến khả năng tạo đa chồi từ nốt lá
mầm

41

3.5

44

Ảnh hưởng của các chất KTST đến khả năng tạo đa chồi ở
đốt thân cây đậu xanh

3.6 Ảnh hưởng của GA3 tới khả năng kéo dài chồi

45

3.7 Ảnh hưởng của IBA và NAA tới khả năng hình thành rễ

47

3.8

50

Ảnh hưởng của thời gian ra rễ tới tỷ lệ sống của cây (%)

3.9 Ảnh hưởng của giá thể tới sức sống của cây đậu xanh

51


6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Trang

2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

26

3.1 Cây mầm đậu xanh trên môi trường CT3

35

3.2 Tạo mô sẹo từ mảnh lá trên môi trường H3

37

3.3 Mô sẹo từ thân mầm trên môi trường H3

38

3.4 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ thân cây

38

3.5 Mô sẹo từ mảnh lá trên môi trường tái sinh
3.6 Mô sẹo từ thân cây trên môi trường tái sinh 4 tuần

40
40

3.7 Tạo đa chồi từ nốt lá mầm trên môi trường T5
3.8 Hệ số tạo chồi từ nốt lá mầm

41
41

3.9 Ảnh hưởng của chất KTST đến khả năng tạo đa chồi từ chồi ngọn
3.10 Tạo đa chồi trên môi trường T5
3.11 Tạo đa chồi trên môi trường T8

42
43
43

3.12 Tạo đa chồi từ đốt thân trên môi trường T5

45

3.13 Hệ số tạo chồi từ đốt thân

45

3.14 Ảnh hưởng của GA3 tới khả năng kéo dài chồi
3.15 Kéo dài chồi đậu xanh từ nốt lá mầm trên môi trường K2

46
46

3.16 Tạo rễ trên môi trường R1
3.17 Tạo cây hoàn chỉnh

48
48

3.18 Tạo rễ trên môi trường R4 (12 ngày)

49

3.19 Tạo rễ trên môi trường R4 (12 ngày)

49

3.20 Tạo rễ trên môi trường R4 (17 ngày)
3.21 Tạo rễ trên môi trường R1 (17 ngày)

49
49

3.22 Ảnh hưởng của thời gian ra rễ tới sức sống của cây
3.23 Cây đậu xanh tái sinh trồng trên trấu hun
3.24 Cây tái sinh trồng trên cát

50
50
52

3.25 Cây tái sinh trồng trên cát + trấu hun

52

3.26 Cây tái sinh trồng trên trấu hun

52

3.27 Cây đậu xanh tái sinh ra hoa và kết quả

52


7
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 - D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BAP

6-benzylaminopurine

CS

Cộng sự

CTMT

Công thức môi trường

GA3

Gibberellin acid

Kinetin

6-furfurylaminopurine

KTST

Kích thích sinh trưởng

MS

Môi trường MS

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là cây họ đậu ngắn ngày có
giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao. Trong hệ thống sản xuất cây lương thực và
cây thực phẩm của nước ta hiện nay, cây đậu xanh có vị trí quan trọng trong

cơ cấu luân canh, xen canh và gối vụ. Đặc biệt ở các tỉnh Bắc Trung bộ, Đông
Nam bộ và Tây Nguyên, cây đậu xanh đã trở thành cây trồng chính trong sản
xuất vụ Hè.
Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh ở nước ta đang có
chiều hướng gia tăng, nhờ khai thác được một số ưu điểm quan trọng của đậu
xanh. Đó là khả năng cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá. Ngoài ra đậu
xanh còn dùng để chữa bệnh, theo sách Nam dược thần hiệu của đại danh y


8
Tuệ Tĩnh thì đậu xanh có vị ngọt, tính hàn, không độc, bổ nguyên khí, thanh
nhiệt... Thân cây đậu xanh dùng làm phân hữu cơ góp phần cải tạo đất, tăng
độ phì trong điều kiện xen canh, luân canh. Khả năng cải tạo và bồi dưỡng
đất nhờ sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần với hệ rễ [7].
Tuy nhiên, năng suất đậu xanh của nước ta còn thấp, do bộ giống đậu
xanh còn nghèo nàn, đồng thời các biện pháp kỹ thuật cũng chưa được nông
dân áp dụng và đầu tư. Chính vì vậy những nghiên cứu chọn tạo giống đậu
xanh có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi,
thời gian chín tập trung… là những vấn đề có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng.
Trong công tác chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu xanh
nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm
[7], [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc. Hiện
nay, một trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống đậu
xanh là sử dụng công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục
vụ chuyển gene nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu
xanh [21], [22], [24], [33], [34], [35], [38] … Đến nay các nhà khoa học đã
khẳng định rằng mức độ thành công của chuyển gene vào cây trồng phụ thuộc
rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái sinh tế bào thành cây in vitro sau
chuyển gene. Mặc dù vậy, ở Việt Nam việc xây dựng hệ thống tái sinh cây
đậu xanh còn là vấn đề mới cần được tiếp tục nghiên cứu. Chính vì vậy chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh
(Vigna radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Xây dựng hệ thống tái sinh cây đậu xanh phục vụ cho chuyển gene.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt đậu xanh.
- Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh thông qua mô sẹo.


9
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (KTST) tới khả năng
tạo đa chồi từ nốt lá mầm, chồi ngọn, đốt thân, khả năng kéo dài chồi.
- Xác định ảnh hưởng của IBA và NAA tới khả năng ra rễ của chồi đậu xanh.
- Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển của đậu xanh nuôi cấy
mô trong giai đoạn vườn ươm.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Hai giống đậu xanh ĐX11 và V123
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây đậu xanh (Vigna
radiata (L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gene.
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
6. Giả thuyết khoa học
Xây dựng được quy trình nuôi cấy in vitro cây đậu xanh phục vụ
chuyển gene và những nghiên cứu khác.

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU XANH
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek

Ngành
Lớp
Bộ
Họ
Chi
Loài

Magnoliopyta
Magnoliopsida
Fabales
Fabaceae
Vigna
V. radiata


10
Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ
là: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron,
Sigmoidotrotopis. Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc
hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là
nhóm đậu châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất
cho Vigna. Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của Ceratotropic
đã được thuần hoá là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), đậu gạo (Vigna
Umbellata (thumb)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd)), đậu ván (Vigna
aconiti folia (Jacp)), Vigna trilobata (L) Wilczek.
Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, cao khoảng 40-70cm, thân cây yếu,
có lớp lông mịn màu nâu sáng. Đường kính thân trung bình chỉ từ 8-12mm và
tăng trưởng với tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây. Cây đậu
xanh ít phân cành và thường phân cành muộn, trung bình có 1-5 cành. Toàn
bộ thân chia thành 7-15 đốt. Thân có thể có màu xanh hoặc màu tím phụ

thuộc vào từng giống.
Lá kép mọc cách, lá chét có 3 thuỳ với nhiều hình dạng như ovan, thuôn
dài, lưỡi mác. Cây đậu xanh có 7-8 lá trên thân chính, khi cây có lá thứ 5 thì
nụ hoa hình thành. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên đến các lá giữa
thân rồi lại giảm dần ở phía ngọn. Chỉ số diện tích lá có ảnh hưởng lớn đến
hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch. Số lá và hình dạng lá thay đổi
tuỳ giống, đất trồng và thời vụ [11].
Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trên trục hoa. Đậu
xanh là loại cây sinh trưởng vô hạn, hoa có màu tím hoặc vàng nhạt với công
thức hoa mẫu 5. Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên quả chín rải rác không
thuận lợi cho việc thu hái.
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 810cm, đường kính từ 4-6mm, có hai gân nổi rõ theo hai bên cạnh quả. Quả


11
chín có màu vàng, nâu hoặc đen, trên vỏ quả thường bao phủ một lớp lông dài
khoảng 0,3-0,4mm. Mỗi cây có từ 8-34 quả, mỗi quả có từ 8-15 hạt.
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi
cạnh, ovan, tròn, thoi, tam giác… Màu vỏ hạt có màu xanh lục, xanh mỡ
(xanh sáng), xanh tối (nâu), vàng rơm… Ruột hạt có màu trắng, vàng nhạt
khối lượng 1000 hạt dao động từ 25-70g.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu
khoảng 20-30cm, có khi sâu tới 70-100cm. Đặc biệt do rễ cây đậu xanh có vi
khuẩn cố định đạm Rhizobium sống cộng sinh nên cây đậu xanh còn có tác
dụng trong cải tạo và bồi dưỡng đất [7].
1.1.2. Đặc điểm sinh hoá của cây đậu xanh
- Protein dự trữ trong hạt:
Hàm lượng protein dự trữ trong hạt đậu xanh trung bình khoảng 24%.
Kiểu gene, điều kiện canh tác ảnh hưởng đến hàm lượng protein. Chức năng
của protein dự trữ là cung cấp nguồn amino acid và nitơ cho quá trình nảy

mầm của hạt. Protein dự trữ trong hạt của cây họ đậu chủ yếu là globulin
(60%), albumin (12%), glutein (21%), prolamin(1%).
- Lipid:
Hạt đậu xanh có hàm lượng lipid thấp hơn so với cây họ đậu khác.
Hàm lượng lipid thay đổi tuỳ thuộc vào giống và bộ gene. Hàm lượng lipid
của đậu xanh trung bình có khoảng 2 - 3%. Lipid trung tính chiếm phần
chính. Ngoài ra trong đậu xanh còn có glucolipid, phospholipid…
- Một số enzyme chủ yếu trong cây đậu xanh
+ Amylase được tìm thấy trong hạt cây một lá mầm và hai lá mầm,
được chia thành hai loại: α-amylase và β-amylase. Cơ chất của chúng là tinh
bột và oligosaccarid.


12
α-amylase thuộc nhóm hydrolase có trong nước bọt, hạt hoà thảo nảy
mầm, tuỵ tạng, trong nấm mốc, vi khuẩn. α-amylase phân giải các liên kết
1,4-glycosid ở giữa chuỗi mạch polysaccarid, tạo thành các dextri phân tử
thấp. Do đó dưới tác dụng của enzyme này làm dung dịch tinh bột nhanh
chóng bắt màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh. Ion canxi có tác
dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzyme. α-amylase tương đối
bền với nhiệt hơn amylase khác nhưng lại kém bền với acid. Trình tự của
gene qui định sinh tổng hợp enzyme α-amylase ở đậu xanh đã được phân lập
và polypeptide tương ứng gồm 421 amino acid và giống 65% về trình tự gene
này so với lúa mì [20]. β-amylase được tìm thấy trong thực vật bậc cao và
một số loài vi khuẩn. β-amylase phân giải liên kết 1,4-glycosid tạo thành
maltose. Nó có khả năng phân giải hoàn toàn amylose và amylopectin thành
maltose. β-amylase không có khả năng phân giải liên kết 1,6 - glycosid.
+ Protease:
Protease là enzyme phân giải liên kết peptid giữa các amino acid của
protein. Ngoài ra, chúng còn tham gia quá trình xử lý phân tử protein và hoạt

động của các enzyme khác. Protease cũng tham gia vào phân giải các protein
lạ hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện không thuận lợi như hạn, lạnh, mặn…
- Đường:
Ở thực vật đường tập trung nhiều ở thành tế bào thực vật, mô nâng đỡ
và mô dự trữ. Thực vật có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời để
tổng hợp đường từ CO2 và nước. Đường có nhiều vai trò quan trọng trong cơ
thể sống như: cung cấp năng lượng cho cơ thể, cấu trúc và tạo hình, bảo vệ
góp phần bảo vệ tương tác đặc hiệu của tế bào… Đường có liên quan đến tính
chống chịu của thực vật [17], [42].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam


13
Theo kết quả điều tra của trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả
châu Á (AVRDC), hàng năm trên thế giới có trên 23 nước sản xuất đậu xanh.
Cây đậu xanh là cây đậu đỗ quan trọng đứng hàng thứ ba sau đậu nành và lạc.
Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bố chủ yếu ở các vùng
nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở châu Á và rất phổ biến
ở nước ta. Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể
thích nghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt. Khu vực Đông và Nam
châu Á, cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan,
Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc, Thái Lan, Philippin, Myanmar,
Indonexia; hiện nay cũng được trồng nhiều tại một số quốc gia ở vùng ôn đới,
ở châu Úc, lục địa châu Mỹ. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu
Á đã có tập đoàn giống đậu xanh lớn nhất thế giới với hơn 5000 mẫu giống,
trong đó có những giống cho năng suất 18-25 tạ/ha và thâm canh có thể đạt
gần 40 tạ/ha. Mặt khác, giá trị sinh học của đậu xanh rất quan trọng, phân
đạm mà cơ thể cây đậu xanh hấp thụ và giữ lại được là 40,66% nên có tác
dụng rất tốt trong cải tạo, bồi dưỡng đất vì sau khi trồng đậu xanh đất được
tơi xốp và tăng được một lượng đạm khoảng 30-70 kg/ha. Tuy nhiên, năng

suất của cây đậu xanh rất thấp, khoảng 6 - 8 tạ/ha vì chưa được đầu tư đúng
mức, nên gần đây nhiều nước đã chọn được giống cho năng suất bình quân 10
- 12 tạ/ha với các ưu điểm là hạt to, màu đẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín
tập trung, chống chịu một số sâu bệnh hại chính. Ngày nay, các nhà chọn
giống đang nghiên cứu tạo ra các giống đậu xanh có thể cải thiện năng suất và
tính kháng bệnh [7].
Ở Việt Nam, đậu xanh đã được trồng từ lâu đời, khắp nơi trong cả
nước, nhưng bị xem là cây trồng phụ tận dụng đất đai, lao động nên năng suất
rất khiêm tốn. Đậu xanh chiếm diện tích khoảng 40 nghìn ha/năm, năng suất
trung bình 6 - 8 tạ/ha. Hiện nay, các nhà chọn giống đậu xanh đã đạt được


14
những kết quả đáng ghi nhận với nhiều giống mới như: ĐX044, ĐX06,
ĐX92-1, V87-13, HL89-E3, V91-15… là những giống ngắn ngày, chín tập
trung cho năng suất khi thâm canh đạt 15 - 17 tạ/ha. Từ năm 1983, diện tích,
năng suất và sản lượng tăng nhưng chậm và không liên tục. Năng suất đậu
xanh thời kỳ 1981 - 1985 là 5,5 tạ/ha, 1986 - 1991 là 5,9 tạ/ha. Năm 1999 là
năm có năng suất cao nhất đạt 8,2 tạ/ha nhờ sự chuyển đổi giống mới. Năng
suất đậu xanh ở các tỉnh phía Nam thường cao hơn các tỉnh phía Bắc, một số
vùng ở An Giang, Đồng Tháp, Hậu Giang đã đạt gần 20 tạ/ha trong vụ Đông
Xuân vì có nhiều điều kiện thích hợp cho canh tác đậu xanh [11].
1.2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua một lịch sử phát triển lâu dài và
được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau:
- Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider
và Butschli (người mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào) vào thực
nghiệm nuôi cấy mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công.

- Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance
thành công trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh.
- Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
hoormon thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự phát
triển tăng trưởng và phân chia tế bào thực vật.
- Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô
sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng, Nobetcourt nuôi cấy củ
cà rốt và nhận được sự phân bào tạo ra khối tế bào phân chia.
- Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy
phôi non ở cây cà rốt Patura.


15
- Năm 1955, Miller và cộng sự phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợp
kinetin là 1 cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóa
chồi ở mô nuôi cấy.
- Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra được chồi từ mảnh mô thân cây
thuốc lá đồng thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất
auxin/cytokinin, nồng độ auxin/nồng độ cytokinin < 1 có xu hướng tạo ra
chồi. Ngược lại khi nồng độ auxin/ nồng độ cytokinin >1 mô có xu hướng tạo
rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi
và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
- Năm 1958, Keinert và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế
bào tượng tầng tách từ cây cà rốt được nuôi cấy một dạng huyền phù.
- Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng
kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loài địa lan.
- Năm 1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào
thực vật - môi trường MS.
- Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy thể đơn bội ở
cà độc dược từ bao phấn.

- Năm 1967- 1968, lần lượt Nichkoi Nakato và cộng sự tạo được cây
đơn bội từ bao phấn thuốc lá.
- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma
giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá
Nicotiana glauca và N. langsdorfi.
- Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cà chua và khoai tây.
Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đã có những bước tiến
vượt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống cây trồng
như: đột biến tế bào soma, cứu phôi trong lai xa, dung hợp tế bào trần, tạo
dòng kháng thể, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn trên nhiều đối tượng cây trồng.


16
Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào, đây là giai
đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,
nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý
luận di truyền ở thực vật bậc cao [1], [12].
1.2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế nào
Năm 1902, Haberlandt đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tế bào thực
vật. Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là
mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả
năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu
rễ một cây hoà thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế
bào được chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất nhiều công trình
nghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay
từ một phần của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực
vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật [1], [10], [13].

17
- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Biệt hoá là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi
thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hoá về cấu trúc
và chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào
này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá
trình đó gọi là quá trình phản biệt hoá (dedifferentiation).
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng biệt hoá, phản biệt
hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy
ra quá trình biệt hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào
thần kinh động vật. Người ta đã chứng minh rằng: những tế bào càng gần
trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng
cao bấy nhiêu [3].
Sự phân hóa và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế
hoạt động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số
gene nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho
một tính trạng mới. Ngược lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động.
Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn
trong cấu trúc hệ gene của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ
thể thực vật được hài hoà. Khi tách riêng từng tế bào, hoặc làm giảm kích
thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gene của tế bào [3].
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát
sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân
hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình
thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất kích
thích sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng của

18
hai nhóm chất kích thích sinh trưởng này (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) của
mô nuôi cấy khác nhau tùy từng mục đích nghiên cứu. Trong môi trường nuôi
cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin thấp thì mô nuôi cấy phát sinh theo hướng
tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo mô sẹo [3], [13].
1.2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
1.2.3.1. Môi trường nuôi cấy
Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch
sử phát triển nuôi cấy mô - tế bào. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng
khoáng và mô tế bào thực vật còn rất hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất
kích thích sinh trưởng hầu như chưa khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt
đã không thành công.
Đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng
và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm những
thành phần chính sau đây [13].
- Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô
-tế bào thực vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng: là nhóm
đa lượng và nhóm vi lượng.
+ Các nguyên tố khoáng đa lượng:
Là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, bao
gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức
năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế
bào. Môi trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trường
nhiều kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.


19

+ Các nguyên tố vi lượng:
Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ dưới
30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Mn, Bo… Tuy nhiên chỉ cần một lượng nhỏ
trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự
sinh trưởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào
bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu
suất tái sinh thấp. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi
lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.
- Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là
điều kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng
lượng chủ yếu là saccharose và glucose là nguồn cacbon tốt nhất. Ở một số
mô thì có thể dùng mantose, fructose và galactose
- Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tự tổng hợp
được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng
và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin cần
thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-enzyme xúc tác các
phản ứng sinh hoá trong tế bào. Các vitamin thường được sử dụng như: B1
(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic acid), B5 (Nicotinic acid) với
nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó
có vai trò quan trọng sinh tổng hợp thành tế bào thực vật.
- Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết
quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi
cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản phân hoá và sinh trưởng của tế bào,


20

đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất kích thích
sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì
vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể
để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp.
Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất chính là
auxin, cytokinin và gibberellin.
- Auxin:
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác
dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ.
Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4D. Các chất này cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình
thành rễ. NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện. Chất này có tác
dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng
đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn
auxin tự nhiên IAA. NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và
tạo rễ. Kết quả nghiên cứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức
độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế: Cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân
tử enzyme và kích thích enzyme hoạt động. Sarkissian đã phát hiện tác dụng
của auxin kích thích hoạt tính của ATPase; Cơ chế thứ hai: Auxin tác động
vào gene và các enzyme phân giải axit nucleic; Cơ chế thứ ba: Auxin tác động
thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. Dùng phương pháp đánh dấu
phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động
như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài
ra, do đó tế bào lớn lên và dẫn tới sinh trưởng. Trong tế bào, NAA có tác
dụng lên sự tổng hợp axit nucleic. Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô


21
non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi, từ những vùng này auxin

được chuyển xuống các phần phía dưới của cây.
- Cytokinin:
Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, BAP. Kinetin được Skoog
phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất nucleic acid. Kinetin thực chất là một
dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có
hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân
chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế
sự hoá già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi
chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính
của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào
thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu
mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN. Những
nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích
thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoormon sinh trưởng nội
sinh. Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác động
tương hỗ giữa các hoormon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của
auxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình
thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ
auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp
cho quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi
cho phát triển mô sẹo (callus). Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá
trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác
động tổng hợp của cả hai chất kích thích. Skoog và Miller (1957) đã khẳng
định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin
điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra


22
một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển

[1], [13].
- Gibberellin:
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người Nhật
Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở cây mạ do nấm Gibberella Fujikuroi
gây ra. Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được
gọi là gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá
vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại
bình thường. Về sau, các nghiên cứu khám phá ra là trong cơ thể thực vật
cũng có các chất giống như gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất
này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3, A4,... Do gibberellin tồn tại trong thực
vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác
với các chất kích thích sinh trưởng khác. Trong cây, gibberellin được tổng
hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong
cây và có nhiều trong phloem và xylem.
- Ethylene:
Ethylene là chất kích thích sinh trưởng dạng khí. Ethylene có rất nhiều
tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai
trò của ethylene đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được
ứng dụng nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét tác dụng của ethylene
lên sự kéo dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích
nảy mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vận chuyển ngang và
xuống của auxin.
- Các chất phụ gia hữu cơ:
Các chất phụ gia được đưa vào môi trường môi trường nuôi cấy nhằm
kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai
tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước dừa chứa các axit


23
amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol và các chất có hoạt tính auxin, các

gluoxit của cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì
trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các chất kích thích tố
có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy.
- Chất giá thể (thạch - agar):
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường nuôi
cấy. Hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động 0,6 - 0,1% theo khối
lượng. Nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuyếch tán của các
chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô gặp khó khăn. Đa số nuôi cấy phôi
được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào từng loại cây mà
sử dụng cho phù hợp [13].
- Giá trị pH của môi trường
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại
môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải
chỉnh độ pH của môi trường với mức ổn định ban đầu. Giá trị pH của môi
trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi
từ 5,0 - 6,0. Khi pH thấp (môi trường axit) sẽ hoạt hoá các enzyme hydrolase,
dẫn tới kìm hãm sự sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hoá của tế bào
trong mô nuôi cấy [1], [13].
1.2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế
bào và quá trình trao đổi chất trong các mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến
hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây
mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng ở 25 - 270C.
Ánh sáng: có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng.


24
Cường độ ánh sáng từ 1000-2500lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy

nhiều loại mô. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm
lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ. Ánh sáng tham gia vào sự phát sinh
phát triển của phôi soma. Cường độ ánh sáng cao gây nên sự sinh trưởng của
mô sẹo, ánh sáng ở cường độ trung bình kích thích sự tạo chồi, ngoài ra với
cường độ ánh sáng thấp chồi sẽ gia tăng chiều cao và có màu xanh nhạt.
Vấn đề quang phổ của ánh sáng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và
thấy rằng khi nuôi cấy cây quỳ thiên trúc ở ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân
chồi, trong khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế. Đối với cây thuốc lá thì
ngược lại, ánh sáng xanh kích thích sự biến hoá chồi, ánh sáng trắng kìm hãm
tạo rễ phụ nhưng hoạt hoá tạo chồi phụ. Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro
phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất lượng bình nuôi cấy [13].
1.2.3.3. Vật liệu nuôi cấy
Về nguyên tắc, mọi tế bào của một cơ thể thực vật đều còn lưu giữ
được tính toàn năng, có nghĩa là vẫn có khả năng nuôi cấy thành công. Tuy
nhiên trong thực tiễn các loại tế bào và các loại mô khác nhau thì có biểu
hiện rất khác nhau về triển vọng nuôi cấy thành công. Một nguyên tắc cơ
bản được tổng kết là càng gần trạng thái tế bào phôi bao nhiêu, khả năng
nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Như vậy tế bào và mô của phôi
non là có triển vọng nhất, sau đó đến tế bào của các đỉnh sinh trưởng ở
trạng thái hoạt động (chồi đỉnh ngọn, đầu rễ) hay ở trạng thái ngủ nghỉ
(chồi nách). Cũng rất gần phôi là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế
bào hạt phấn ở giai đoạn non. Các tế bào của mô tượng tầng (cambium)
cũng là nguồn mẫu vật nuôi cấy rất lý tưởng [2].


25
1.2.4. Hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây
1.2.4.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro
Xây dựng hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh đạt hiệu suất
cao là tiền đề quan trọng cho thí nghiệm chuyển gene. Đối với mỗi loài thực

vật, nhất thiết phải nghiên cứu tối ưu hóa kỹ thuật nuôi cấy thích hợp. Sau đây
là những hệ thống nuôi cấy có thể được sử dụng để biến nạp gene:
Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối mô thực vật gồm những tế bào chưa
phân hoá, có khả năng phân chia liên tục và có tính biến động di truyền cao.
Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo tạo ra bằng cách nuôi cấy các cơ quan của
thực vật (lá, hoa, quả, thân…) trong môi trường và điều kiện nuôi cấy thích
hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy
chuyển định kỳ, song việc cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến
khả năng tái sinh cây và làm tăng tính biến động di truyền của mô. Những cây
tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú có ý nghĩa quan
trọng trong việc tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình chọn giống.
Nhiều tác giả đã thu được những giống cây trồng mới bằng con đường nuôi
cấy mô sẹo [1], [25], [31], [43].
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật
nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng. Các tế bào
này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc khác nhau. Việc thu được cây
tái sinh từ nuôi cấy huyền phù tế bào đã được công bố ở một số đối tượng
như: lúa, thuốc lá [15].
Nuôi cấy tế bào trần: Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ
mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều
kiện biểu hiện rõ ràng hơn [2], [12].
Ngoài ra, hệ thống tái sinh cây thông qua đa chồi từ mảnh lá hoặc đoạn
thân cũng được sử dụng để chuyển gene.