Nghiên cứu quy trình xác định diquat, paraquat trong thực phẩm bằng kỹ thuât HPLC

Nghiên cứu quy trình xác định diquat,
paraquat trong thực phẩm bằng kỹ
thuât HPLC
Cao Công Khánh*, Nguyễn Tường Vy**
*Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thựcphẩm quốc gia
**Trường Đợi học Dược Hà Nội
SUMMARY
Food safety is a concern o f society today. Diquat and paraquat herbicides are chemicals widely used in agriculture worldwide.
Many countries have promulgated standards, MRL o f diquat, paraquat in food. To help control food quality, we study the process
o f defining diquat, paraquat in food by HPLC Subjects o f the study sample is some kind o f food (rice, corn, soybeans, potatoes)
and some vegetables (spinach, spinach, broccoli, cabbage). Investigation o f chromatographic conditions to determine diquat,
paraquat in food. Conduct evaluation and repeat the correct method. The results obtained show that our method o f achieving
the requirements o f the AOAC.
The HPLC method was proposed to determination diquat, paraquat in food with the conditions as follows:
- Column:PolymerX5uRP-l 100A(150mmx4,6mm;5pm).
- Mobile phase: Mix 10,3ml diethylamin, 3,0g sodium pentansulfonat, U,2g sodium natri perchlorat, l,36g kali dihydro phosphat
per liter H p , adjusted pH=2,0 by acid percloric.
- Injection volume: 50p i; flow rate: 1ml/min.
- Detector PDA: X= 257nm (for paraquat) andX= 308nm (for diquat)
Ti/kh6a:A0AC, diquat, HPLC, paraquat, polymerX.

Đặt vấn đề
An toàn vệ sinh thực phẩm hiện đang là mối quan
tâm của xã hội hiện nay. diquat (DQ) và paraquat
(PQ) là những hóa chất diệt cỏ được sử dụng rộng
rãi trên thế giới trong nông nghiệp [6], [7]. Đây là các
chất tan tốt trong nước, rất độc (đặc biệt là với phổi),
có tỷ lệ tử vong cao [2]. Nhiểu nước đã ban hành các

paraquat trên hệ thống HPLC.
-Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng.

Hóa chất, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu

tiêu chuẩn, giới hạn cho phép của diquat, paraquat

- Một số loại lương thực: gạo, ngô, đậu tương.
- Một số loại rau: rau muống, rau dền, cải xanh,
cải b ắp ,...

trong thực phẩm, đồng thời đã đưa ra các phương

Các loại đối tượng nghiên cứu này được lấy ngẫu

pháp để xác định hai chất diệt cỏ trên. Tại Việt Nam,

nhiên từ các chợ ở Hà Nội.

Bộ Y tế cũng đưa ra giới hạn cho phép của hai chất

Dụng cụ, trang thiết bị

trên trong một số loại thực phẩm nhưng chưa ban

- Cột sắc ký: PolymerX 5u RP-1 100A (150mm X

hành phương pháp thống nhất để xác định chúng

4,6mm;5|am) và tiền cột C18.

[1]. Để góp phẩn kiểm soát chất lượng thực phẩm,

- Hệ thống HPLC Shimazu với detector DAD.

chúng tôi nghiên cứu quy trình xác định diquat,

- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg.

paraquat trong thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC với

- Máy đo pH, máy nghiền mẫu, máy ly tâm, bể

các mục tiêu:
- Khảo sát các điểu kiện phân tích diquat,

cách thủy.
- Bộ chiết pha rắn và cột chiết pha rắn SI-1


(phenomenex).
- Các dụng cụ chính xác: bình định mức,
autopipet, ống nghiệm ,...

Hóa chất, chất chuẩn
- Chuẩn diquat dibromua, paraquat diclorua (Dr
Ehrentorfer) có độ tinh khiết >99,0%.
- Các hóa chất: Diethylamin, natri pentasulfonat,
natri perclorat, kali dihydro phosphat, acid perloric,

ể.

Tốc độ dòng: 1ml/phút. Thể tích tiêm m ẫũ

50 mI.
Các điều kiện sắc ký trên có sự khác biệt so với
các điều kiện trong AOAC 992.17 [3] đã giúp tách
hai chất diquat, paraquat tốt hơn, thu được sắc đồ
phân tích như hình 1 .
Phương pháp xử lý mẫu
Theo AOAC 992.17 [3] và một số tài liệu khác [4]
[5], diquat và paraquat được chiết ra khỏi nền mẫu

natri hydroxỵd, acid hydrocloric đạt yêu cầu dùng

bằng dung dịch acid hydrocloric 2M. Sau đó, mẫu

cho HPLC.

được điểu chinh pH = 9-10 và làm sạch qua cột SPE
silica rổi định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Xử lý kết quả
- Sử dụng các phẩn mềm được cài đặt sẵn trong
hệ thống HPLC.
- Phương pháp tính toán thống kê có sự hỗ trợ

Thẩm định phương pháp
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn:
Chúng tôi đả tiến hành xây dựng đường chuẩn
như sau: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp
diquat, paraquat có nổng độtừ0,05fig/ml tới 30|jg/

của phần mểm Microsoft Excel.

ml trong dung dịch pha động. Tiến hành chạy sắc

Kết quả và bàn luận

Hinh 1. Sác đỗ hõn hợp chuổn diquũt (Ầ=3ũ8nm) vò paraquat (Ằ=257nm}

Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chúng tòi đã tham khảo các nghiên cứu [3], [4],
[5], tiến hành khảo sát và lựa chọn được các điểu kiện

ký với các điểu kiện đả lựa chọn ở trên. Kết quả thu
được như sau:
Bòng l Sự phụ thuộc diện tích p k vào nóng độ áiquũt, paraquat

sắc ký như sau:
- Pha động:

10,3ml diethylamin, 3g natri

pentasulíonat, 12,2g natri perclorat, 1,36g kali

Nổng
độ
(|ig/ml)

Diên tích pic
(mAU*s)

Diquat

Paraquat

Nóng
độ
(ịjg/ml)

Diện tích pic(m AU *s)
Diquat

dihydro phosphat pha trong 1L nước, chỉnh pH=2
với acid percloric.
- Cột tách: PolymerX 5u RP-1 100A (150mm X
4,6mm;5nnn) và tiền cột C18
- Detector DAD: với bước sóng 257nm cho
paraquat, 308 cho diquat.

Para­
quat

0,05

15148

17474

2,0

589554

677290

0,1

29199

33399

5,0

1434396

1677284

0,2

61667

67735

10,0

2700191

3258491

0,5

146811

168703

20,0

5633287

6307266

1,0

294768

341114

30,0

8060946

9681029


Kết quả thu được như bảng 2.
Do LOQ = 3,33 X LOD [3], nên giới hạn định lượng
của diquat, paraquat trong dung môi pha động là
0,03ụg/ml, trong nển mẫu là 0,045ụg/ml.
Xác định độ lặp lại và độ thu hồi:
- Sử dụng phương pháp thêm chuẩn: thêm một

10

15

20

25

30

35

lượng chính xác diquat, paraquat chuẩn vào trong
mẫu thử sao cho nồng độ vẫn nằm trong khoảng
tuyến tính.
- Sử dụng nền mẫu trắng, thêm chuẩn ở 3 mức
nồng độ khác nhau 200, 500 và lOOOng. Mỗi mức
nống độ làm lặp lại 6 lẩn.
Sáng2. Giới họn phát hiện cùa diquat và poroquaĩ
N én m ẫ u
Mẫu trắng

L O D (|ig /n il)
D iq u a t

P a ra q u a t

0,015

0,015

Phương pháp có độ lặp lại từ 4,4 - 6,6% tại nổng
độ từ 200-1000 ng và nằm trong giới hạn cho phép
Khoảng tuyến tính của diquat và paraquat tương
đối rộng, nồng độ từ 0,05|ag/ml tới 30|jg/ml, với hệ
số tương quan tuyến tính >0,999. Trong phân tích
thực tế, tùy theo nồng độ của diquat và paraquat
trong mẫu thực để lập đường chuẩn thích hợp.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ)
€)ể xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn
0,05|jg/ml rồi pha loãng trong dịch chiết mẫu trắng cho
tới khi thu được chiểu cao chất phân tích gấp 3 lẩn tín hiệu
đường nền mẫu trắng. Mẫu ứắng ở đây là mẫu ngô không
có chất phân tích, được chuẩn bị giống như với mẫu thử.

của AOAC (Bảng 3).
Độ thu hồi của phương pháp tại 3 mức nồng độ
từ 200-1000 ng đều trên 70% (Bảng 4), có thể áp
dụng phương pháp để xác định diquat, paraquat
trong các loại thực phẩm.
Phân tích mẫu thực tế:
Sau khi tiến hành khảo sát phương pháp, chúng tôi
tiến hành phân tích mẫu thực tế gồm một sổ loại ngũ
cốc: gạo, ngô, khoai, lạc, đậu tương và một số loại rau
xanh: rau muống, rau dền, rau cải xanh,.... Các mẫu
được lấy ngẫu nhiên từ các chợ ở Hà Nội và được phân
tích theo quỵ trình nhưtrên. Kết quả thu được (Bảng 5).

Báng ỉ . Két quà độ lợp lợi của phương pháp
Thêm chuẩn 200ng

s
(m A U *s)

TB
SD
R SD (% )

T h ê m c h u ẩ n SO O ng

T h ê m c h u ẩ n lO O O n g

D iq u a t

P a ra q u a t

D iq u a t

P a ra q u a t

D iq u a t

P a ra q u a t

40210

42556

10U Ũ4

121656

243382

238428

42358

43517

113037

121685

246435

233669

44089

45025

111041

123637

232082

263834

45157

45354

105579

117595

242651

253951

42155

47263

119852

138075

212644

265805

40936

42014

107469

126719

213348

265365

42484

44288

109680

124895

231757

253508

1866

1964

6509

7109

15320

14280

4 ,4

4 ,4

5 ,9

5 ,7

6 ,6

5 ,6


Bảng 4. Két quá độ thu hôi cùa phương pháp
Lương
thêm(ng)

rim thấy (ng)
Diquat

Paraquat

Diquat

Paraquat

133,5

127,5

66,7

70,7

140,8

130,3

70,4

72,4

146,7

134,8

73,4

75,0

150,4

135,7

75,2

75,5

140,1

141,3

70,1

78,8

136,0

125,9

68,0

69,8

340,9

359,0

68,2

71,8

381,6

359,1

76,3

71,8

374,8

364,8

75,0

73,0

356,2

347,1

71,2

69,4

404,8

407,1

81,0

81,4

362,6

373,9

72,5

74,8

825,7

700,8

82,6

70,1

836,1

686,9

83,6

68,7

787,2

775,1

78,7

77,5

823,2

746,2

82,3

74,6

721,0

780,9

72,1

78,1

723,4

779,6

72,3

78,0

200 ng

500 ng

1000 ng

Mẫu

Dộlặplại-RSD(%)

Rtb(%)

Độ thu hối R (%)
Diquat

Paraquat

Diquat

Paraquat

70,6

73,7

4,5

4,5

74,0

73,7

6,0

5,6

78,6

74,5

6,6

5,6

Thêm vào (ng)

rim thấy (ng)

R(%)

0

KPH

-

200

141

70,5

0

KPH

-

200

139

69,5

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

ChẫtPT
Diquat

Ngô
Paraquat

Khoai

Lạc

Đậu tương


BA I N G H I E N c u u

^
Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Gạo

0

KPH

-

100

76,2

76,2

0

KPH

-

200

73,1

73,1

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

0

KPH

-

Paraquat

0

KPH

-

Diquat

Ldi Xdnn
Paraquat

Rau dén

Rau muống

Cải bắp

Cấn tây

Đã kiểm tra và phân tích 10 mẫu thực phẩm ở

phát hiện thấp (15 ppb), có sự tương quan chặt chẽ

Hà Nội, chưa phát hiện mẫu nào có chứa dư lượng
thuốc diệt cỏ diquat, paraquat.

giữa nồng độ và diện tích píc (> 0,999), độ thu hồi và
độ lặp lại cao đáp ứng yêu cẩu của AOAC. Điểm khác
biệt của để tài này so với phương pháp của AOAC là

Kết luận

pha động đã tách được hai chất diquat và paraquat
tốt hơn. Phương pháp của chúng tôi có thể sử dụng

Sau khi tiến hành thẩm định phương pháp phân

để phân tích diquat, paraquat trong nhiều loại thực
phẩm.

tích, chúng tôi thu được kết quả như sau: giới hạn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm.
2. Lê Hổng Hà, Tinh hình ngộ độc thuốc diệt cỏ paraquat (Gramoxone) ở một số tinh phía Nam - Biện pháp phòng ngừa và điều trị, Bệnh
Viện Chợ Rẫy.
3. AOAC Official method 992.17, Diquat and paraquat residues ìn potatoes, Liquid chromatographic method (1995).
4. J.w. Munch and WJ. Bashe (1997), "Determination of diquat and paraquat in drinking water by liquid-solid extraction and high
performance liquid chromatoghraphy with ultraviolet detection", U S Environmental Protection Agency, Method 549.2, Revision 1.0.
5. Takeaki Nagata, Keiko Kudo, Kojiro Kimura and Tohru Imamura (1993), "Simultaneous determination of paraquat and diquat in
human tissues by high performance liquid chromatography", Journal of Chromatography,\/o\.6^7, pp 119-123.
6. Diquat, World health organization, Food and agriculture
7. Paraquat, World health organization, Food and agriculture, Data sheets on pesticides No. 4 Rev. 1,