Xây dựng quy trình xác định tạp đối quang của lamivudin bằng điện di mao quản có sử dụng chất chọn lọc đối quang

Xây dựng quy trình xác định tạp đối
quang của lamivudin bằng điện dì mao
quản có sử dụng chất chọn lọc đối quang
Nguyễn Thị Thao*, Thái Nguyễn Hùng Thu*,
Lê Đình Chi**
*Trường Đại học DượcHà Nội
**Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
SUMMARY
A simple, selective cydodextrin-based Πm ethod has been developed for the determ ination o f enantiom eric im purity oflam ivudine.
This m ethod was carried o u t in a fused-silica capillary (effective length 60 cm, inner diameter 50 ịum) w ith a 30 m M solution o f
tris(hydroxymethyl) aminomethane, adjusted to pH 2.5, containing 0.5% iw /v) o f carboxym ethyl-^-cydodextrin per m ililitre as
electrolyte. The m ethod was validated in terms o f specificity, linerity, accuracy, precision, lim it o f quantification (LOQ) and lim it o f
detection (LOD).
Từ khóa: capillary electrophoresis, cyclodextrin, enantiom eric impurity, lamivudin.

Đặt Vấn đề
Lamivudin là m ột hợp chất có hoạt tính kháng
virus hiện đang được sử dụng rộng rãi trong điểu trị
HIV/AIDS và các bệnh nhiễm virus khác. Hoạt chất
này là m ột đổng phân đối quang tinh khiết nên m ột
trong những chỉ tiêu chất lượng cần lưu tâm là kiểm
soát giới hạn tạp đối quang của lamivudin. Cho tới
nay, Dược điển Việt Nam IV[1] và USP 32 [2] đều đã
quỵ định kiểm tra tạp chất đối quang trong nguyên
liệu lamivudin bằng sắc ký lỏng với cột hoạt quang
gắn p-cyclodextrin với giới hạn cho phép là 0,3%.
Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có nghiên cứu nào
th iết lập phương pháp xác định tạp đối quang của
lamivudin trong chế phẩm thuốc. Do đó, chúng
tôi nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao
quản với chất chọn lọc hoạt quang carboxymethỵlp-cyclodextrin (CMCD), m ột chất chọn lọc hoạt

quang đã được ứng dụng thành công trong việc
tách đồng phân đối quang của nhiểu hợp chất có
hoạt tính dược lý [3, 4] để xác định tạp đối quang
của lamivudin trong m ột số chê' phẩm thuốc chứa
lamivudin.

Đối tượng và phưomg pháp nghiên cứu
Nguyên vật liệu
- Chất đối chiếu Lamivudin (Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương), SKS: VVS.0209146, hàm lượng
99,42 % theo nguyên trạng.
- Chuẩn USP Lamivudin Resolution M ixture A
(RMA) Lô P0D024, chứa 98,9 % lamivudin và 1,1 %

122 Nghiên Cứu duọc Thống tlnthuõc' Sỗ 4/2011

đồng phân đổi quang của lamivudin theo nguyên
trạng.
- Viên nén Nevilas (Hetero Drugs Ltd, Ấn Độ), lô
AI 00452, hạn dùng 07/2012, có 150mg lamivudin,
30 mg stavudin, 200 mg nevirapin trong 1 viên
- Viên nén Stavudin & Lamivudin (Strides Arcolab
Limited, Ấn Độ), lô 7209028, hạn dùng 09/2011, có
150 mg lamivudin, 30 mg stavudin trong 1 viên.
- Viên nén Lam ivudin/Zidovudin (Matrix
Laboratory Limited, Ấn Độ), lô 1025182, hạn dùng
11/2011, có 150 mg Lamivudin, 300mg zidovudin
trong 1 viên.
- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric
85% (Merck), natri hydroxyd (Merck), carboxymethylp-cỵclodextrin (Sigma-Aldrich), tris(hỵdroxymethyl)

aminomethan (Merck).
Thiết bị
- Máy điện di mao quản Hewlett PackardSECE
(Mỹ) được trang bị detector PDA
- Máy đo pH Metrohm 691 (Đức)
- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga (Đức)
- Cân phân tích M ettler Toledo AB204S có độ
chính xác tới 0 , 1 mg
- Dụng cụ thủy tinh chính xác loại A (bình định
mức, pipet...), màng lọc 0 , 2 |am
Phương pháp nghiên cứu
- Dựa vào các tính chất của lamivudin và tạp
đổng phân đối quang của lamivudin và thay đổi điểu
kiện thực nghiệm để chọn thông sổ điện di có thể
tách các đối tượng nghiên cứu và thẩm định phương


-ẩ
pháp xác định tạp đối quang của lamivudin.
- Tính toán và xử lý thống kê kết quả bằng
Microsoft Excel.

Thực nghiệm và kết quả
Xây dựng phương pháp xác định tạp đối quang
của lamivudin bàng CE
Qua khảo sát các điều kiện vể: nồng độ CMCD, pH
dung dịch điện ly nền, loại dung dịch điện lỵ nền sử
dụng, các điểu kiện xử lý, cân bằng mao quản, điện
thế chạy điện di, bước sóng của d ete cto r... các điều
kiện điện di được chọn và chuẩn bị như sau:

- Mao quản silica nung chảy (chiểu dài hữu ích 60
cm, đường kính trong 50 |am).
-Đ iện th ế :+ 25 kv.
- Nhiệt độ mao quản: 25°c.
- Áp suất, thời gian tiêm mẫu: 50 mbar X 3 giây
- Detector PDA đặt ở bước sóng 270 nm.
- Dung dịch điện di: Lựa chọn dung dịch TRIS 30
mM làm dung dịch điện ly nền và CMCD làm chất
chọn lọc đổi quang, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ các
điểu kiện khác nhau của dung dịch điện di với nồng
độ CMCD dao động từ 0,3 - 0,75% (kl/tt) và pH dung
dịch điện ly nền thay đổi từ 2,5 - 4,5. Kết quả khảo sát
cho thấy dung dịch TRIS 30 mM điểu chỉnh đến pH
2,5 bằng acid phosphoric 85% chứa CMCD ở nống
độ 0,5 % (kl/tt) là điều kiện tối ưu để tách lamivudin
và đồng phân đối quang của lamivudin.
- Quy trình rửa mao quản: Mao quản mới trước
khi sử dụng được hoạt hóa bằng dung dịch NaOH
0,1 M trong 60 phút, sau đó rửa bằng nước trao đổi
ion trong 10 phút. Trong quá trình phân tích trước
mỗi lẩn chạy điện di, rửa mao quản theo thứtự: nước
trao đổi ion trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M
trong 1 phút, nước trao đổi ion trong 2 phút, dung
dịch điện di trong 2 phút. Khi kết thúc ngày làm việc,
rửa mao quản theo thứ tự: nước trao đổi ion trong 2
phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nước trao
đổi ion trong 5 phút. Bảo quản mao quản bằng cách
làm đầy mao quản bằng nước trao đổi ion.
- Chuẩn bị các dung dịch;
+ Dung dịch chuẩn USP Lamivudin Resolution

M ixture A (RMA - chứa 1,1% tạp đổi quang của
lamivudin) được chuẩn bị trong nước trao đổi ion
có nóng độ tạp đổi quang của lamivudin chính xác
khoảng 2,75 |jg/m l (tương ứng với nồng độ tổng của
RMA khoảng 0,25 m g/ml). Lọc qua màng lọc 0,2 Ịitn.
+ Dung dịch chuẩn lamivudin: được chuẩn bị
trong nước trao đổi ion, có nồng độ lamivudin chính
xác khoảng 0,25 mg/m l.
+ Dung dịch thử: hòa tan bột viên đâ nghiển mịn

(với chê' phẩm dạng viên) hoặc pha loãng chế phẩm
(với chê phẩm dạng dung dịch) trong nước trao đổi
ion để thu được dung dịch có nồng độ lamivudin
chính xác khoảng 0,25 m g/m l. Lọc qua màng lọc 0,2
|jm.

Thẩm định phương pháp xác định tạp đối
quang của lamivudin
Đ ôđảchiêu

\ỉ

Hình 1. Két quá khảo sứ độ độc hiệu
ũìchuănRMA,
bìíĩiẵu viên nén Hevks,
c) ĩĩìỗu viên nén Nevỉlos có thêm lỉMA với nóng đậ top đối quang lò l,67ụg/ml


Thêm RMA vào chế phẩm Nevilas (đã được kiểm
tra trước là không có tạp đổi quang của lamivudin)

để có nồng độ tạp đối quang của lamivudin thêm
vào ở mức xấp xỉ l,67ng/m l. Kết quả thực nghiệm
cho thấy, khi phân tích bằng quỵ trình chúng tôi thiết
lập, pic tạp đổi quang của lamivudin không trùng với
pic nào của nển mẫu chế phẩm (Hình 1b) và được
tách riêng khỏi lamivudin trên chuẩn RMA (Hình
la) cũng như trên nền mẫu có thêm chuẩn (Hình
1c). Như vậy, quy trình đã xây dựng đảm bảo độ đặc
hiệu khi xác định tạp đối quang của lamivudin trong
chê' phẩm thuốc chứa lamivudin, kể cả chế phẩm đa
thành phần.
Độ tuyến tính
Kết quả xác định diện tích pic ở các nổng độ trong
khoảng nống độ của tạp đối quang của lamivudin từ
1,67|jg/ml đến 8,36 ụg/m l được trình bày như trong
Bảng 1.

sau 6 lẩn phân tích có độ lặp lại khá tố t (RSD = 5,36
%) và tỷ lệ tìm lại đạt được 100,4% (dao động trong
khoảng 92,6 - 107,3 %) ở nống độ tương đương giới
hạn định lượng. Như vậy, quy trình đã xây dựng có
độ đúng, độ lặp lại phù hợp cho việc phân tích tạp
đối quang của lamivudin trong các chế phẩm có
hoạt chất này.
Độ chính xác trung gian của phương pháp được
xác định qua so sánh kết quả 6 lẩn phân tích đánh
giá độ lặp lại với 3 lán phân tích độc lập được thực
hiện khác ngày trên cùng mẫu nền chế phẩm. Qua
9 lần phân tích thực nghiệm, phương pháp cũng thể
hiện độ chính xác trung gian tương đối tố t với RSD

là 5,29%.
Bảng 2. Két quổ đánh giá độ lặp lợi rà độ đúng trên đóngphân đói quang cũũlũíĩìmền

TT

Bàng 1. Ouơnhệ giữa diện tíchpic vò nóng độ tạp đỗi quang cùũlũmivudin
Nóng độ c ([ig/ml)
Diện tích picS
(mV.s)

1,67

2,79

4,18

5,57

: 2,485

5,035

7,898 ỉ 10,658

8,36
16,156

Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương
quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng
độ tạp đổi quang của lamivudin với hệ số tương

quan r là 0,9997. Phương trình hồi quỵ tuyến tính: s

= 2,03 c - 0,72.
Độ lặp lại, độ đúng
Độ đúng và độ lặp lại của quy trình tiến hành kết
hợp đánh giá trên mẫu tự tạo bằng cách thêm chính
xác tạp đối quang của lamivudin (dưới dạng chuẩn
RMA) vào nến viên nén Nevilas (đã được kiểm tra
trước là không có tạp đối quang của lamivudin).
Mẫu tự tạo được chuẩn bị như sau; cân m ột lượng
chính xác bột viên đã nghiền mịn sao cho nống độ
lamivudin trong nển mẫu đạt khoảng 0,25 m g/m l.
Thêm chính xác m ột lượng RMA sao cho nồng độ
đồng phân đổi quang của lamivudin trong dung dịch
thu được đạt khoảng 1,67ng/ml. Cho vào bình định
mức 2 0 ml, thêm 15 ml nước trao đổi ion vào bình,
lắc siêu âm 5 phút, thêm nước trao đổi ion đến vạch,
lắc đểu, lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,2 um. Sở dĩ
chúng tôi lựa chọn khảo sát độ đúng ở mức nồng độ
1,67|jg/nnl của đóng phân đối quang của lamivudin
vì kết quả thực nghiệm cho thấy đây cũng là giới hạn
định lượng của quy trình với hợp chất này nên đánh
giá độ đúng tại đây sẽ có ý nghĩa nhất do đổng phân
đối quang của lamivudin là m ột tạp chất.
Kết quả tại Bảng 2 cho thấy, nống độ tạp đổi
quang của lamivudin xác định được trong mẫu tự tạo

124 Nghiên Cứu dược Thòng tin thuớc Sỗ 4/201 ì

2

3
4
5
6
7
8
9

Lượng bột
viên nến
mẫu thử
(mg)
22,1
21,7
20,9
215
23,6
21,4
23,1
21.4
223
Trunq bình

Diện tích pic
đóng phân
đỗi quang cùa
lamivudln
(mV.s)
2,419
2,916

2,708
2,519

2,709
2,824
2,633
2,542

im

Nóng độ tạp
đói quang của
lamivudin tìm tháy
trong mẫu tự tạo
(liq/ml)
1,55
1.79
1,69
1.60
1,59
1,75
1.75
1,69
1,84

"^

RSD(%)

^

V I
5,29

Tỷ lệ
tìm
lai

(%)
92.6

107J__
101,1
95,6
101,2
104,5

(**)
(*•)
{**)
100,4
5,36

Gtìictìú: (**) két quáphân tích độclộp khóc ngòỵ

Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ) của phương pháp được xác định bằng cách
pha loãng dẩn dung dịch chuẩn RMA ở nhiều mức
độ khác nhau, so sánh đáp ứng pic đổng phân đối

quang của lamivudin với dao động của đường nền.
Với nồng độ đổng phân đối quang của lamivudin
khoảng 1,67|jg/ml, đáp ứng pic thu được trên điện
di đổ đểu cao hơn 1 0 lẩn so với dao động đường
nền. Tương tự, ở nóng độ đồng phân đối quang
của lamivudin 0,51|jg/nnl, đáp ứng pic trên điện di
đỗ đểu cao hơn 3 lẩn so với dao động đường nền.
Như vậy, LOD và LOQ của phương pháp lẩn lượt là
0,51|jg/ml và 1,67|ag/ml, tính trên nồng độ tạp đối
quang của lamivudin trong dung dịch tiêm vào hệ
thống điện di. Với nống độ lamivudin trong dung
dịch thử khoảng 0,25 m g/m l, giới hạn phát hiện này
tương đương với tỷ lệ tạp đống phân đối quang 0 ,2 %.
Trong các dược điển hiện mới quy định giới hạn tạp
đổng phân đối quang trong nguyên liệu lamivudin
là 0,3 % [1,2], như vậy quy trình chúng tôi thiết lập


ề
có giới hạn phát hiện thấp hơn, hoàn toàn đáp ứng
được yêu cầu trong dược điển.
ứng dụng kiểm tra tạp đối quang của lamivudin
trên một số chế phẩm
Phương pháp đã được áp dụng để kiểm tra tạp
đối quang của lamivudin trong 3 chế phẩm viên
nén là Lamivudin/Zidovudin, Stavudin & Lamivudin
và Nevilas. Sau khi chuẩn bị mẫu và tiến hành phân
tích như quy trình đã xây dựng, điện di đồ của cả
3 mẫu đểu không xuất hiện pic tạp đối quang của
lamivudin (Hình 2). Kết quả này cho phép kết luận

lượng tạp đối quang của lamivudin trong 3 chế

phẩm được kiểm tra đều dưới giới hạn phát hiện của
quy trình (0 ,2 %).

Kết luận
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật điện di mao
quản đã được ứng dụng thành công để xác định
tạp đối quang của lam ivudin. Kết quả thẩm định
cho thấy phương pháp đã xây dựng hoàn toàn phù
hợp để áp dụng định lượng đổng phân đối quang
của lam ivudin cũng như định tính phân biệt giữa
lam ivudỉn và đối quang của nó trong m ột số dạng
chê' phẩm.

75

10

1Ỉ5

tí

17Í

»

Fìe InlotMbon

líAtliMXBBlD

Hình ỉ. Điện di đỗcùa mẫu Lomivudin/lidovudine (ũ), mẫu Stovudine& Lũmivudin (b), mẫu Nevilas (c) rà chuẩn RMA (d)

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dược điển Việt Nam IV (2009), 346 - 348.
2. USP 32 (2009), 2747 - 2748.
3. M.Wind, P.Hoffmann, H.Wagner, W.Thormann (2000), "Chiral capillary electrophoresis as a predictor for separation o f drug
enantiomers in continuous flow zone electrophoresis", Journal o f Chromatography A, 895,51 - 65.
4. A. van Eeckhaud, M.R. Detaevernier, Y.Michotte (2002), "Development o f a validated capillary electrophoresis method for
enantiomeric im purity testing o f dexchlorpheniramine maleate", Journal o f Chromatography A, 958,291 - 297.