Phân tích đồng phân đối quang của ofloxacin bằng phương pháp điện di mao quản

Các mẫu viên nén qui ước sau 45 phút thử GPDC
in vitro và in vivo đểu giải phóng gần như hoàn toàn
dược chất (trên 90 %). Kết quả so sánh khả năng
GPDC in vitro của viên 200 mg ACV GPKD 24 giờ và
12 giờ với mẫu viên nhỏ tương ứng (40 mg) và khả
năng GPDC in vivo trên thỏ cho thấy có sự tương
đổng giữa mô hình đánh giá GPDC in vitro và in vivo
trên động vật thí nghiệm (chỉ số f2 đểu thuộc khoảng
50 - 100). Như vậy, kết quả nghiên cứu đả cho phép
kết luận mô hinh đánh giá GPDC có tính khả thi, tin
cậy và có thể áp dụng trong các nghiên cứu tương
tự. Viên nén ACV KDSH đặt phụ khoa bào chế có khả
năng KDSH tốt, GPDC kéo dài 24 giờ.

Kết luận
Nghiên cứu đả đạt được một số kết quả chính
sau:
Đả xây dựng được công thức bào chê' viên nén
acyclovir 200 mg KDSH đặt phụ khoa GPKD 24 giờ
bằng phương pháp dập thẳng.
Bước đẩu đã xây dựng mô hình đánh giá giải
phóng in vivo viên nén bào chế trên thỏ. Kết quả
nghiên cứu đã chứng tỏ viên nén bào chế có khả
náng KDSH tốt và kiểm soát GPDC kéo dài 24 giờ.

TÂI LIỆU THAM KHẢO
1.
Bộ môn Hóa dược (2004), Hóa dược, Trường ĐH Dươc Hà Nội,tr, 326-328.
2.
Bộ Y tế (2009), Dươc thư quốc gia việt nam,tr. 102-104.
3.

Mai Thu Đường (2004), "Herpes sinh dục - một số vấn đề vể quản lý và điếu tri", Bệnh viện Da liễu thành phố Hổ chí Minh.
4.
Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự (2010), Nghiên cứu bào chế viên nén acyclovir kết dính sinh họcđặt phụ khoa
giải phóng kéo dài, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, trường đại học Dược Hà Nôi.
5.
Kast C.E., Valenta c., et al. (2002), "Design and ỉn vitro evaluation of a novel bioadhesive vaginal drug delivery system for
clotrimazole", J. Controll. ReL, 81,3, pp. 347 - 354.
6.
Sweetman S.C., et al. (2009), Martindale 36, Pharmaceutical Press, pp. 862-854,911.
7.
Wang L.,Tang X. (2008), "A novel ketoconazole bioadhesive effervescent tablet for vaginal delivery: Design, in vitro and in vivo
evaluation", Int. J. Pharm., 350,1-2, pp. 181-187,

Phân tích đồng phân đối quang của
ofloxacin bằng phương pháp điện di
mao quản
Tống Thị Thanh Vượng*, Lê Đình Chi**
*Trường Đại học Dược Hà Hội
**Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
T ừ kh ó a : capillary electrophoresis, cyclodextrìn, enantioseparation, ofloxacin.
SUM M ARY
A simple, selective cyclodextrin-based CE method has been developed for the determination o f enantiomer o f ofloxacin, This method
was carried out in a fused-silica capillary (effective length 30 cm, inner diameter 50 ụm) with a 75 mM solution oforthophosphoric acid,
adjusted to pH 3.5, containing 4.5 mg ofcarboxymethyl^li-cycloclextrin per mililitre as electrolyte. The m ethod was validated in term
of specificity, linerity, accuracy and precision.


Đặt vấn để
Ofloxacin là một hợp chất có hoạt tính kháng
khuẩn thuộc nhóm dẫn xuất fluoroquinolon hiện

đang đượcsửdụng song hành cả dưới dạng hỗn hợp
racemic (ofloxacin) và dạng đổng phân tả tuyển đơn
thuẩn (levofloxacin). Cho tới nay, Dược điển Việt Nam
IV và các Dược điển nước ngoài (Anh, Mỹ...) vẫn chưa
có phương pháp chính thống để phân tích các đống
phân đối quang của ofloxacin. Do đó, chúng tôi đã
sử dụng phương pháp điện di mao quản (Capillary
electrophoresis-CE) với chất chọn lọc hoạt quang
carboxymethyl-p-cyclodextrin (CMCD), một hướng
nghiên cứu đã được sử dụng nhiều trong phân
tích đổng phân đối quang [1], [2] để xây dựng quy
trình tách hai đóng phân đối quang của ofloxacin,
từ đó cho phép phân biệt một cách đặc hiệu dạng
ofloxacin racemic và levofloxacin tả tuyển.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Nguyên vật liệu
- Các chất đối chiếu: Ofloxacin (Chuẩn của Viện
Kiểm nghiệm thuốc trung ương), levofloxacin
(Chuẩn làm việc).
- Mẫu thử:
+ Dung dịch nhỏ mắt Oflovid, chứa 0,3 %
ofloxacin, nhà sản xuất Santen Pharmaceutical Co,
Ltd.
+ Viên nén Ofloxacin STADA, chứa 200 mg
ofloxacin, nhà sản xuất Công ty Liên doanh TNHH
STADA Việt Nam.
+Viên nén Levotamaxe,chứa 100 mg levofloxacin,
nhà sản xuất Công ty TNHH Dược phẩm DTM
- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid

orthophosphoric, natri hydroxyd, carboxymethyl-pcyclodextrin (CMCD).
Thiết bị
- Máy điện di mao quản Hewlett Packard3ECE,
detector PDA
- Máy đo pH Metrohm (Đức)
- Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga (Đức)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S có độ
chính xác tói 0,1 mg
- Dụng cụ thủy tinh chính xác loại A (bình định

mức, pipet...), màng lọc 0,2 |jm
Phương pháp nghiên cứu
- Dựa vào cấu tạo, tính chất hóa lý của các đổng
phân đối quang của ofloxacin và bằng nghiên cứu
thực nghiệm để xây dựng, thẩm định phương pháp
phân tích các đổng phân đỗi quang của ofloxacin.
- Xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê có sử
dụng phẩn mềm Microsoft Excel.

Thực nghiệm và kết quả
Xây dựng phương pháp phân tích đổng phân
đối quang của ofloxacin bằng CE
Qua tiến hành khảo sát các điểu kiện về: nóng độ
CMCD, pH dung dịch điện ly nền, loại dung dịch điện
ly nền sử dụng, các điểu kiện xử lý, cân bằng mao
quản, điểu kiện thiết bị (điện thế chạy điện di, bước
sóng của detector), chúng tôi đã thiết lập được quy
trình điện di như sau:
- Mao quản silic nung chảy (Chiểu dài hữu ích 30
cm, đường kính trong 50 ịjm).

-Điện thế: +15 kv.
- Nhiệt độ mao quản; 25°c.
- Áp suất, thời gian tiêm mẫu: 50 mbar X 3 giây
- Detector PDA đặt ở bước sóng 290 nm.
- Dung dịch điện di: Dung dịch acid
orthophosphoric 75 mM điều chỉnh đến pH 3,5 bằng
NaOH 1M chứa CMCD ở nồng độ 4,5 mg/ml.
- Quy trình rửa mao quản:
+ Mao quản mới: trước khi sử dụng, mao quản
mới được hoạt hóa bằng dung dịch natri hydroxyd
0,1 M trong 60 phút, sau đó rửa bằng nước trao đổi
ion trong 10 phút.
+ Trong quá trình phân tích: trước mỗi lẩn chạy
điện di, rửa mao quản theo thứ tự: nước trao đổi
ion trong 1 phút, dung dịch natri hỵdroxyd trong 1
phút, nước trao đổi ion trong 2 phút, dung dịch điện
di trong 2 phút. Khi kết thúc ngày làm việc, rửa mao
quản theo thứ tự: nước trao đổi ion trong 2 phút,
dung dịch natri hydroxyd trong 2 phút, nước trao
đổi ion trong 5 phút. Bảo quản mao quản trong nước
trao đổi ion.
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 75
mg chuẩn ofloxacin hoặc 37,5 mg chuẩn levofioxacin
vào bình định mức 50 ml, thêm 5 ml acetonitril, lắc


siêu âm hòa tan hoàn toàn, thêm nước trao đổi ion
vừa đủ thể tích, lắc đểu.
-Dung dịch chuẩn: Để định lượng hoạt chất trong
chế phẩm, pha loãng chính xác dung dịch chuẩn gốc

trong nước trao đổi ion để thu được dung dịch chuẩn
có nổng độ khoảng 150 |jg/ml với ofloxacin hoặc 75
ng/ml với levofloxacin. Lọc qua màng lọc 0,2 |jm.
- Dung dịch thử:
+ Chế phẩm dạng viên: Cân 20 viên thuốc, xác
định khối lượng trung bình của một viên, nghiền
thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương
ứng với khoảng 150 mg ofloxacin hoặc 75 mg
levofloxacin vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml
acetonitril, lắc siêu âm cho tan hết, thêm nước trao
đổi ion vừa đủ thể tích, lắc đểu. Lọc qua giấy lọc, pha
loãng chính xác dịch lọc bằng nước trao đổi ion để
thu được dung dịch có nồng độ khoảng 150 |jg/ml
với ofloxacin hoậc 75 |ag/ml với levofloxacin. Lọc qua
màng lọc 0,2 ụm.
+ Chế phẩm dạng dung dịch nước pha loãng
chính xác chế phẩm bằng nước trao đổi ion để thu
được dung dịch có nồng độ khoảng 150 ng/ml với
ofloxacin hoặc 75 |jg/ml với levoHoxacin. Lọc qua
màng iọc 0,2 |jm.
Thẩm định phương pháp phán tích đồng phân
đối quang của ofloxacin
Đô đác hiêu
Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp,
chúng tôi tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn
ofloxacin racemic, chuẩn levofloxacin, mẫu viên nén
Ofloxacin STADA (chứa ofloxacin racemic) và mẫu
viên nén Levotamax (chứa levofloxacin), ghi lại điện
di đổ. Điện di đổ của mẫu Ofloxacin STADA cho hai
pic tương ứng với hai pic trên điện di đổ của chuẩn

ofloxacin racemic (Hình 1 và 2). Tương tự, điện di đổ
của mẫu Levotamax chỉ cho duy nhất một pic tương
ứng với pic trên điện di đổ của chuẩn levofloxacin
(Hình 3 và 4). Đổng thời, khi so sánh giữa điện di đổ
của chuẩn ofloxacin racemic và chuẩn levofloxacin,
chúng tôi nhận thấy pic levofloxacin di chuyển tới
detector trước, còn dextrofloxacin là đổng phân tới
detector muộn hơn. Nhưvậy, phương pháp phân tích
cho phép tách riêng hai đổng phân đối quang của
ofloxacin và phân biệt đặc hiệu hai dạng ofloxacin
racemic và levofloxacin.

V 'w -

Hìntì 1.Điện di đố chuẩn ofioxQdn

Hmh 2.ĐÌỆÍÌ ă đỗ m u Ofloxodn STADA

Hinh Ỉ.ĐIêìì á đỗ chuáíì levofloxQcIn

Hìỉìíì 4.Điện dì đô ỉĩìáu Im tũ ỉiìũ

Đô tuvến tính
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn ofloxacin racemic
(có thành phẩn gồm 48,83% levofloxacin và 51,17%
dextrofloxacin) gổm 5 dung dịch có nổng độ
levofloxacin từ 24,42 |jg/ml đến 122,08 |ag/ml và
nổng độ dextrofloxacin từ 25,59 fag/ml đến 127,93
|jg/ml. Các dung dịch chuẩn được đưa vào hệ thống

điện di để phân tích theo các điểu kiện ở mục 1. Kết
quả thu được (Bảng 1 và 2) cho thấy trong khoảng
nống độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt
chẻ giữa nồng độ của cả hai đóng phân đối quang
của ofloxacin và diện tích pic trên điện di đổ, với
hệ số tương quan r = 0,9959 trong trường hợp của
levofloxacin, và r = 0,9971 với dextrofloxacin
Bâĩiũ l Quan hệ giữa diện tích pic và íìôĩìq độ levoßoxücin.
Nốngđộlevoíloxacin
(|jg/ml)
Diện tích pic(mAU.s)

24,16

48,32

72,48

96,64 ; 120,81

29,73

42,83

60,07

76,59

98,86

Phương trình hổi (Ịuyĩuyén M : ỵ = 0 ,7 1 1 9 x+ 10,012
Hèsỗtươíìg(ỊUOíì:r = 0,9959
Bảng 1. Ouũn tìệ giữũ diêĩi tích pic và nóng đỗ àxtrofloxQcin.
Nóng độ
dextrofloxacin
(|jg/ml)

76,76

25,59 ' 51,17
3 »

102,34

68,94

1 5 .*

81,77
;

i

127,93
102,19

Lượng
5 !,

Đô lăp lai
Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng
tôi tiến hành phân tích độc lập 6 lấn trên mẫu viên
nén Ofloxacin STADA sử dụng các điểu kiện điện di
ở m ụ c l.
Bảng ]. Kết quà đánh giá độ lộp lợi

Lượng
cánthử
(gam)

Dextrofloxodn

Hàm
lượng
(mg/
viên)

Diện
tkhpk
(ĩìiAU.s)

Diện
tíchpic
(mAU.s)

Hàm
lượng
(mg/
viên)

Tổng
hàm
lượng
(mg/
viên)

ị
0,2020 i

62,24

100,84 ị

64,14

103,93

204,77

0,2050

62,54

100,93

64,36

103,88

204,81

0,2110

63,09

98,92

65,99

103,48

202,40

0,2011

61,29

100,88

63,07

103,82

204,70

i

0,1985

60,59

100,98

62,38

103,98

204,96

0,2042

61,62

100,93

63,21

103,54

204,46

103,77

204,35

0,20

0,47

100,58

TB
RSD%

^

0,81

i

Kết quả đánh giá thực nghiệm (Bảng 3) cho
thấy khi định lượng levoAoxacin và dextroíloxacin,

24

Báng 4.Két quà đánh gỉá độ đúng vă levofloxQcin

:

Phương trình hỗi quỵ tuỵén tính: y = Q 6 M x + 20Ạ19
H êsổtương(jUũĩì:r=0,9971

Lmíìoxacin

phương pháp đã xây dựng cho độ lặp lại rất tốt
(RSD lán lượt là 0,81% và 0,20% cho levofloxacin và
dextrofloxacin).
Đô đúnạ
Để đánh giá độ đúng của quy trình phân tích,

chúng tôi chuẩn bị nển mẫu thử từ mẫu viên nén
Ofloxacin STADA sao cho nổng độ của mỗi đổng
phân đổi quang của ofloxacin trong nển mẩu vào
khoảng 60 |ag/ml. Sau đó, chúng tôi thêm chính xác
chuẩn ofloxacin racemic vào nển mẫu để nồng độ
của mổi đổng phân thêm vào nển mẩu chế phẩm
khoảng 15 pg/ml. Mẫu tự tạo có thêm chuẩn như
trên được chuẩn bị và phân tích 6 lẩn độc lập. Độ
đúng của phương pháp được thể hiện qua tỷ lệ (%)
giữa nóng độ của mỗi đổng phân tìm lại được trong
mẩu tự tạo so với nổng độ thêm vào ban đẩu (Bảng
4 và 5).

iMghlén CỨU dược Th ố n g tín th u ố c

: Diện
. (iomin ; *

Tổng
nồng độ
levofloxadn
trongmâu
thêmchuẩn
(¡jg/ml)

Hông độ
levofloxocin
tìmlợi
được
(ụg/m!)

Tỷlệ
tìm
loi

(%)

0,1724

14,50

63,36

74,91

14,27

98,4

0,1773

14,50

i 65,17

77,43

14,68

101,3

0,1761

14,50

65,02

77,22

14,99

103,4

0,1707

14,50

62,81

74,15

14,23

98,1

0,1735

14,50

63,91

75,68

14,56

100,4

0,1742

14,50

63,85

75,59

' 14,18

97,8

Báng 5. Kết quà đánh giá độ đúng vđ dextrofloxocin

Diện
tlch

Tổngnồng
đậdexừoíloxơán

ĩỷlệ
tìm
loi

(%)

(ụg/ml)

Nống độ
dextrofloxacin
tìmlại
được
iụqlmị)

p ic
(itìAu.s)

trong m àu
thêm chuẩn
71,89

15,10

99,4

66,09

74,26

15,07

99,2

15,20

65,74 1

73,72

15,12

99,5

0,1707

15,20

64,22

71,38

15,42

1 101,5

0,1735

15,20

65,17 :

72,84

15,51

! 102,1

0,1742

15,20

65,32 ^

73,07

15,40

101,4

Lượng
côn
mẫu
nển (g)

Nồng độ
dextrofloxadn
thêmrào
(ụg/mí)

0,1724

15,20

64,55 Ị

0,1773

15,20

0,1761

i


Với tỷ lệ tìm lại dao động từ 97,8% đến 103,4%,
phương pháp phân tích đả xây dựng cho độ đúng
tốt khi định lượng cả hai đổng phân đối quang của
ofloxacin.
Áp dụng phương pháp đá xây dựng, thẩm định
trên chế phẩm
Sau khi thẩm định, phương pháp phân tích đã
được áp dụng định tính, định lượng ofloxacin và
levofloxacin trên một số chế phẩm (Bảng 6). vể mặt
định tính, dạng hoạt chất tìm thấy trong chê' phẩm
(ofloxacin racemic hoặc levofloxacin) hoàn toàn
phù hợp với dạng hoạt chất nhà sản xuất công bố.
vể mặt định lượng, hàm lượng hoạt chất xác định
được cũng rất phù hợp so với hàm lượng công bố (từ
93,6% đến 101,4% so với hàm lượng công bổ, xem
Bảng 6).

Báng 6. Két quá định lượng ofioxam trong mộtsốchẽphẩĩĩì
Hàm lượng
Hàm lượng

Tổng hàm
Sũ với
Chế phẩm
levofloxadextrolượng
công bố
cin
floxacin
ofloxacin
(%)
Oflovid®
0,15%
0,15%
0,30%
101,4
0,3%
Ofloxacin
99,85 mg/
102,70 mg/ 202,55 mg/
101,3
STADA
viên
viên
viên
Levota102,93 mg/
102,93 mg/
93,6
maxe
viên
viên

Kết luận
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật điện di mao quản,
một kỹ thuật phân tích còn chưa được ứng dụng
nhiểu trong kiểm nghiệm thuốc, đã được ứng dụng
thành công để phân tích các đổng phân đối quang
của ofloxacin. Kết quả thẩm định cho thấy phương
pháp đã xây dựng hoàn toàn phù hợp để áp dụng
định lượng hai đồng phân đối quang của ofloxacin
cũng như định tính phân biệt giữa dạng ofloxacin
racemic và dạng levofloxacin trong nhiểu dạng chê'
phẩm thuốc (viên, thuốc nhỏ mắt).

TÀI LIỆU THAM KHÀO
1. Wei Wang, Jiande Lu, Xiaoyun Fu and Yaozu Chen (2001), Carboxylmethyl- p- Cyclodextrin for chiral separation of basic drugs by
capillary electrophoresis, Analytical Letters, 34, pp. 569- 578.
2. Xue Yan Shi, Rui Fang Fan, Yue Qin Zhang, Jun Ling Gu, Ruo Nong Fu (2000), Synthesis and Characterization of Water- Soluble
Carboxymethyl- Cyclodextrin Polymer as Capillary Electrophoresis chiral Selector, Chinese Chemical Letters, 11(1), pp. 69-70.