Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin 3
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin 5
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 6
1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 7
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 16
Hình 2.2. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC 19
Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều
cao pic sắc ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đó chỉ đúng
trong một khoảng nhất định. Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng
tuyến tính của chất phân tích. 48
Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau. 48
Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp 51
Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích 55
MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người
ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe
β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú
y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được
dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi
khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn
gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh
nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng
sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận,
1
đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người
bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.
Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các
kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ
yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp
HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích

ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng
lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể,
tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl,
cho độ tin cậy cao.
Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một
hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông
dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì vậy
chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng
sinh học bằng phương pháp điện di mao quản”
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25]
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin,
cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn
nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và
Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm
Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA)
xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.
2
Cấu trúc và phân loại:
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-
Lactam
N
S
CH
3

CH
3
N
H
O
CO
R
COOM
2
3
4
1
56
7
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-
dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,
5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với
M là gốc cation thường là: K, Na, H.
Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác
nhau.
Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Tên kháng sinh R Hoạt tính
Nhóm penicillin tự
nhiên
Penicillin
G (PENG)
Benzathin
CH

2
-
Benzyl
Gồm các Penicillin tự
nhiên và dẫn chất.Phổ
hẹp: vi khuẩn gram(+).
Không kháng β-
lactamase
3
Nhóm penicillin kháng penicilliiase
Oxacillin
(OXA)
N
C-
O
CH
3
6-[(5-methyl-3-phenyl-
1,2-oxazole-4-carbonyl)amino]
Là các Penicillin bán
tổng hợp. Phổ hẹp như
nhóm I. Kháng
penicilliiase, không tác
động vào vòng β –
Lactam được.
Cloxacillin
(CLO)
Cl
N
O

C-
CH
3
6-{[3-(2-chlorophenyl )-
5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino}
Nhóm penicillin phổ rộng
Ampicillin
(AMP)
CH-
NH2NH2
6-([(2R)-2-amino-2-
phenylacetyl]amino)
Phổ rộng, tác dụng cả
khuẩn gram (+) và (-).
Không kháng β-
lactamase và
penicilliiase
Amoxicilli
n (AMO)
CH-
NH2NH2
HO
6-{[(2R)-2-amino-2-(4-
hydroxyphenyl)-acetyl]amino}
* Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1
dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R
N
H
O

CO
R1
N
S
R3
R2
COOM
1
2
3
4
5
6
7
8
Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
4
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia-
1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các
cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.
Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các
cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên
gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I
(CEP) và thế hệ III (CEF)
Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin
Thế hệ Kháng sinh R1 R2 R3
I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng
mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+),
yếu nhất trên gram (-). Không bền và

dễ bị β-lactamase phá hủy
Cephalexin
(CEP)
CH-
NH
2
H -CH
3
III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram
(-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác
dụng kém penicillin và
cephalosporin thế hệ I. Bền với β-
lactamase
Cefixim
(CEF)
S
N
N
NH
2
HOOCCH
2
O
H -CH=CH
2
Tính chất:
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước,
dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân
cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –
COOH và –NH

2
.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ
thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).
5
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK
a
= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân
tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở
vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
Tên kháng sinh pK
a1
Tên kháng sinh pK
a1
Tên kháng sinh pK
a1
PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7
AMP 2.7 CEP 2.6 CEF 2.75
OXA 2.72
Tác dụng:
Cơ chế:
Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng
lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự
phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu
diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm
hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng.
Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo
phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng
không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng
methicillin).
Độc tính:
Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng,
mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ..
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị
ứng với thành phần của thuốc.
6
1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế
khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi
trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh
nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu
biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát
triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ
định và không đúng cách.
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu
người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales
[6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi
60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị
được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng
và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của
A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa
kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi
trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện
giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24
giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan

trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70
ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm
1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh
nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).
Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai
cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em.
7
Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều
trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết
giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn
Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc
của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn
E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở
Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm
trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là
42%
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng
sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên
môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the
Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn
của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát
Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc
gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng
chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ
nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy
đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành
tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc
không có hoạt chất……

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo
vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí
về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam
1.3.1. Phương pháp quang học
8
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học
của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này
đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt
trong dược phẩm.
Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo
phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường
hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá
cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-
lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu
2+
thủy phân và tạo phức với
AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được
4.10
-7
M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và
tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…
Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng
phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh
với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng
được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện

của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l
Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số
β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5
mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm
chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1
mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các
phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và
9
trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc
xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy
phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.
1.3.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng
không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế
phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat
0.1M pH=5.2.
1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là
trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo
được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác
nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ
lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi

rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng
khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích
dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân
tích chất trong các đối tượng phức tạp.
Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V,
PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột
Inertsil ODS2

(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C
2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55), dùng
nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100
μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam
trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2.1 mm×50
10
mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril
(ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút
A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 45
0
C; thời gian 20 phút. Áp
dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của
phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 –
15 ng/l với nước thải sau xử lý.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với
ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng
cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động:
ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt
giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức
phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] nên chỉ áp
dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng
thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.
Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng
sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại
khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha
động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector UV-VIS đo
ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l,
hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để
phân tích các β-lactam.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực
phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi
hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều
chất nhiễu cần loại trừ.
1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
11
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả
tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để
tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao
quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40
mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt
độ 20
0

C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO,
AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của
trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối
thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu hồi trên 96%.
Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện
quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l,
khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương
đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ
cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis
– CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8. Phương pháp này tách
được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C,
cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF,
ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 –
1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l;
khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên
cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25,
+4 và -18
0
C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại
nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV –
DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật
12