Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống vi sinh vật răng miệng của cây nút áo

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THựC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VI SINH VẬT RĂNG MIỆNG
CỦA CÂY NÚT ÁO
Vũ Lẽ Thu
HDKH: TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Vũ Vân Anh
Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: đặc điểm thực vật, Nút áo, Spilanthes oleraceae, Spilanthes acmela,
Spilaníhes grandiflora, Streptococcus mutans, thành phần hóa học, tác dụng sinh học.
Tóm tắt
Ba mẫu Nút áo được thu hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa đã được
phân tích đặc điểm hình thái và so sánh với khoá phân loại, từ đó giám định tên
khoa học của các mẫu là Spilanthes oleraceae L., Spilanthes acmela L.Murr.,
Spilanthes grandiflora Turcz. Dịch chiết cồn 9(f của các bộ phận trên mặt đất
bao gồm lả, thân và cụm hoa của 2 loài Spỉlanthes oleraceae L., Spilanthes
acmela L.Murr. được thử tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans và cho
kết quả dịch chiết hoa của loài Spilanthes oleraceae L. có khả năng ức chế vi
khuẩn mạnh nhất (71,16 Vo). Thực hiện nghiên cứu thành phần hỏa học trong
cụm hoa của loài có hoạt tỉnh sinh học mạnh nhất trên. Xác định các thành phân
hóa học các chất cỏ trong tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ liên
hợp, kết quả thành phần lớn nhất trong tinh dầu là Limonene (30,71%). Chiết
xuất và phân lập các chất từ dịch chiết cồn 9CP của cụm hoa, qua quả trình chiết
phân đoạn và chạy cột sắc kí phân lập được một chất là ß-sitosterol.
Đặt vấn đề
Nút áo là tên gọi chung một số loài thuộc chi Spiỉanthes của họ Cúc. Cây
Nút áo từ lâu đã được các thầy lang, các nhà khoa học, thực vật học nghiên cứu
rất nhiều và cho thấy tác dụng hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh như: đau răng,
viêm miệng, đau họng, bại lưỡi, sốt rét, viêm phế quản, hen suyễn, các bệnh
ngoài da, phong thấp, đau xương, bệnh scorbut...Tuy nhiên, công dụng phổ biến
nhất của cây Nút áo là chữa đau nhức răng, sâu răng [5], Với nhiều tác dụng như
vậy, Nút áo được xem là một dược liệu rất đáng để khai thác, đặc biệt là hưcmg
đến việc điều trị các bệnh liên quan tới nhiễm khuẩn răng miệng. Tuy nhiên, về

thực vật, ữong khi số lượng loài ứong chi Spilanthes khá lớn và phân bố hầu như
rộng khắp trong cả nước nhưng vẫn chưa có nghiên cứu nào thực hiện việc so
sánh đặc điểm hình thái của các loài để tránh nhầm lẫn khi giám định tên khoa
học các loài đó. ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về hóa học, thực vật cũng như
hoạt tính sinh học của cây Nút áo còn hạn chế. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành
đề tài ‘‘Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng chổng vi sinh vật răng miệng


của cây Nút áo ” nhằm góp phần giúp cho việc khai thác và sử dụng nguồn dược
liệu này có hiệu quả hơn.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Mau tươi Nút áo gồm toàn cây mang hoa được thu hái tại huyện Yên
Định, tỉnh Thanh Hóa tò tháng 7 năm 2011 đến tháng 2 năni 2013 (ký hiệu là V,
L, T) dùng để nghiên cửu đặc điểm tìiực vật. Tiêu bản mẫu khô được lưu giữ tại
Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật với mã số tiêu bản lần lượt là HNIP/17857/13,
HNIP/17858/13, HNIP/17859/13.
Mau tươi gồm các bộ phận txên mặt đất (thân, lá, hoa) của 2 loài V và L
dùng để làm nguyên liệu thử hoạt tính sinh học.
Cụm hoa loài V tươi phơi cho se rồi sấy khô ở 60°c, bảo quản trong túi
nilon kín, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu về thực vật: mô tả, phân tích và so sánh hình thái.
Thử hoạt tính sinh học: Khuếch tán đường ngang trên đĩa thạch đục lỗ.
Nghiên cứu thành phần hóa học: cất tinh dầu bằng phương pháp cất kéo
hơi nước; định tính và định lượng các thành phần trong tinh dầu bằng phưoTig
pháp sắc kí khí khối phổ liên hợp; chiết xuất các thành phần trong mẫu bằng
phương pháp ngâm lạnh với cồn 90°; định tính các thành phần trong dịch chiết
bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng (SKLM), phân lập các thành phần từ
dịch chiết phân đoạn bằng phương pháp sắc kí cột.

Kết quả
Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Tiến hành mô tả, phân tích và so sánh điểm hình thái của các mẫu nhận
thấy chúng đều là dạng cây cỏ, nhưng có sự khác biệt về hình dạng cũng như
kích thước thân, lá và hoa.
Mau L: Cây cỏ, sống hàng năm, cao khoảng 30-60 cm, mọc đÚTig, có Ichi
mọc bò lan trên mặt đất, phân thành nhiều cành. Lá mọc đối, phiến xoan tam giác
hoặc hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 3-7 cm, rộng 1-3 cm, gốc hơi thuôn, đầu
nhọn, mép có răng cưa to hay hơi lượn sóng, gân chính 3, cuống dài 1,5-2 cm
(hình 1.1). Cụm hoa đầu mọc ở ngọn thân hay ở nách lá, cuống cụm hoa dài
khoảng 12 cm, cụm hoa hình nón nhọn, cao 9-11 mm, đường kính 5-7 mm. Tổng
bao có lá bắc hình bầu dục nhọn đầu. Hoa hình lưỡi nhỏ ở bên ngoài, hoa hình
ống ở giữa. Đài là 2 răng cứng. Tràng hoa màu vàng, tràng hoa hình lưỡi dài 5-6
mm, tràng hoa hình ống dài 3-4 mm, cao 4-6 mm. Bộ nhị 5, chỉ nhị rời. Bao phấn


có phần phụ hình tam giác, hơi có tai ở gốc, bầu gần bầu dục, có lông. Bộ nhụy
có 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới 1 ô (hình 1.3, 1.4).
Mau V: Cây cỏ, sống hàng năm, cao Ichoảng 20-50 cm . Thân nằm, rồi
đứng, màu tía. Lá mọc đối, phiến lá hình tam giác, rộng 3-5 cm, dài 5-6 cm mép
lá răng cưa. Gân lá gồm có 3 gân chính tò gốc và 5 cặp gân phụ. Cuống lá dài 11,5 cm (hình 1.1). Cụm hoa đầu đơn độc ở ngọn nhánh, cuống cụm hoa tương đối
ngắn 1,5-2 cm, đế cụm hoa có hình nón nhọn cao 5-7 mm, đường kính mặt cắt
ngang cụm hoa khoảng 5-7 mm. Tổng bao lá bắc có 2 hàng lá. Hoa hình lưỡi
nhỏ ở bên ngoài, hoa hình ống ở giữa. Hoa có màu vàng, hoa cái hình lưỡi nhỏ
dài 5 - 6 mm, hoa lưỡng tính hình ống dài 4 - 5 mm. Bộ nhị 5, chỉ nhị rời và đính
vào ống tràng. Bao phấn dính lại với nhau thành một ổng, mở bằng khe nứt dọc
vào phía trong. Bộ nhụy có 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới (hình 1.3, 1.4).
Mau T: Cây cỏ, cao đến 1 m. Thân màu xanh, mọc đứng hoặc bò lan. Lá
có phiến thon, rộng 1 -1 ,5 cm, dài 3 - 5 cm, chót nhọn, mép có răng, gân phụ 5
cặp với 1 cặp to, cuống dài 2 - 5 cm (hình 1.1). Cụm hoa đầu, mọc đầu cành, ữên

cuống cụm hoa dài 5 - 10 cm. Cụm hoa cao 8 - 9 mm, đường kính 4 - 5 mm. Đế
cụm hoa hình nón nhọn, cao 4 - 6 mm. Tổng bao lá bắc với 3 hàng lá, cao 2,5 - 3
mm, không lông hoặc có lông, hoa hình lưỡi nhỏ bên ngoài là hoa cái dài 3 - 4
mm, hoa hình ống ở giữa là hoa lưỡng tính, dài 2 - 3 mm. Bộ nhị 5, chỉ nhị rời và
đừih vào ống tràng. Bao phấn đính gốc, dính lại với nhau thành một ống, mở
bằng khe nứt dọc vào phía trong. Bộ nhụy có 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới
1 ô (hình 1.3, 1.4).

L
V
Hình 1.1. Ảnh hình thái các mẫu Nút áo


L

V
T
L
V
T
Hình 1.2. Ảnh hình thái lá các mẫu Nút áo

Hình 1.3. Hình thái cụm hoa các mẫu Nút áo
ỉ. Cụm hoa có cuống, 2. Cụm hoa phóng to, 3. Cụm hoa cắt dọc, 4. Cụm hoa cắt ngang

L
T
HQnh 1.4. Hmh thái hoa các mâu Spiỉanthes spp V, L, T chụp qua kính lúp soi nổi
V: 1. Hoa lưỡi nhỏ, 2. Hoa hình ống, 3. Đ ế hoa, 4. Đ ế hoa cẳt dọc
S.Nhị hoa, 6. Đ ế hoa cắt ngang, 7. Bầu hoa cắt ngang, 8. Đ ài hoa

L: Hoa lưỡi nhỏ, 2. Hoa hĩnh ổng, 3. Đài hoa, 4. Đ ể hoa, 5. N h ị, 6. Nhụy
T: 1. Hoa lưỡi nhó, 2. Hoa hình ông, 3. Đê hoa, 4. Nhụy, 5. Nhị (ô vuông nền có ìdch thước 1x1 mm)


Đối chiếu những đặc điểm mô tả được với các khóa phân loại thực vật hiện
có [ 1 -5 ], mẫu dùng nghiên cứu được giám định tên khoa học là:
- Mầu V: Spilanthes oleracea L., họ Cúc (Asteraceae).
- Mau L: Spiỉanthes acmella L. Muư., họ Cúc (Asteraceae)
- Mầu T: Spiỉanthes grandiflora Turcz., họ Cúc (Asteraceae)
Đề tài cũng tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu cơ quan sinh dưỡng của
các mẫu nghiên cứu và nhận thấy chúng có đặc điểm khá tưcmg đồng. Một số bộ
phận có các đặc điểm phân biệt giữa các mẫu nghiên cứu. Có thể kể đến như:
phần mô mềm vỏ của mẫu V và T có khoảng không gian giữa các tế bào khá lớn,
mẫu L các tế bào xếp xít nhau hơn; phía bên ngoài thân mẫu L có lông che chở; ở
bên trong, mô mềm vỏ là những tế bào khá thưa thớt, không thấy có sợi libe như
mẫu V và T mà chỉ có mô mềm libe bắt màu đỏ.
Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết cảcphần trên mặt đất
Do loài Spỉlanthes grandiflora Turcz. (T) không phải là loài phổ biến nên
số lượng mẫu thu hái được nhỏ. Vì thế, đề tài này chỉ tiến hành thử hoạt tính sinh
học của 2 loài Spiỉanthes oleracea L. (V) và Spilanthes acmella L. Muư. (L).
Các mẫu lá và thân ở các nồng độ khác nhau không có tác dụng trên
chủng Streptococcus mutans. Các mẫu hoa có tác dụng khá tốt trên chủng vi
khuẩn gây sâu răng này. Cụ thể kết quả thu được cho thấy tất cả các mẫu hoa của
hai loài thử đều có tác dụng trên chủng Streptococcus muíans. Trong đó, mẫu VH
với tỉ lệ 1 : 2 thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đưòng kính vòng vô
khuẩn truiig bình là 7,28 mm. Mầu LH với tỉ lệ 1:3 ức chế chủng Streptococcus
mutans kém nhất với đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 6,21 mm. Mau VH
ở tỉ lệ 1:2 đã thể hiện hoạt tính mạnh hơn mẫu LH ở tỉ lệ 1:3. Điều đó chứng tỏ
hoa của loài V là có hoạt tính mạnh nhất trong hai loài.
Vì vậy mẫu VH (1:2) được đưa vào thí nghiệm tiếp theo so sánh với tác

dụng của Gentamyin. Cuối cùng xác định được hoạt lực của mẫu thử so với
kháng sinh là R = 71,16%.
Qua quá ứình thử hoạt tính sinh học nhận thấy hoa của mẫu V (VH) có
hoạt tính sinh học mạnh nhất trong 2 mẫu thực nghiệm. Do đó tiếp tục thực hiện
nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu này.
Nghiên cứu thành phần hóa học
Nghiên cứu thành phần hỏa học của tinh dầu cụm hoa Nút áo
Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu chứa trong cụm hoa, ban đầu
thực hiên chưng cất và xác định được hàm lưọTig tinh dầu là 0,1%. Qua quá trình
chạy sắc kí khí khối phổ tinh dầu cất từ cụm hoa, xác định được các thành phần
hóa học của tinh dầu bao gồm hơn 20 chất khác nhau là: L-cc-Pinene, Sabinene,


/3-Myrcene, Pseudolimonene, p-Cymene, dl-Limonene, trans-a-Ocimene, trans-i3Ocimene, 'T^Terpinene, Alloocimene, Trans-Caryophyllen, Gemiacrene D, (-)Caryophyllene oxide... Trong đó, Limonene có hàm lượng cao nhất với tỉ lệ là
30,71%.
Chiết xuất và xác định một số thành phần chính trong cụm hoa
Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh thu được dịch chiết
cồn 90° cụm hoa Nút áo. cất thu hồi dung môi rồi đem cô đến khối lượng không
đổi thu được 201,73 g cắn M. Hòa tan cắn M trong khoảng 80 ml nước, đun nóng
nhẹ. Chiết phân bố lần lượt với các dung môi chloroform, ethyl acetat thu được 3
phân đoạn dịch chiết, cất quay thu hồi dung môi các dịch chiết, cô cách thủy đến
cắn có khối lượng không đổi lần lượt là cắn A (trong CHCI3), cắn B (trong
EtOAc) và cắn c (trong nước).
Định tính các cắn ừên bằng phương pháp hóa học, kết quả thu được cho
thấy: trong cắn A có flavonoid, coummarin, tannin, sterol; trong cắn B: có
coumarin và tannin; trong cắn C: có tanin. Định tính bằng phưong pháp sắc kí
lóp mỏng (SKLM) nhận thấy các cắn A, B, c đều có khả năng tách với hệ dung
môi CHCI3 - MeOH (9:1). Riêng với cắn A có thể khai triển tiếp với sắc kí cột để
phân lập chất bằng hệ dung môi trên.
Phân lập các chất bằng phương pháp sắc kí cột

Lần 1: chạy cột sắc kí lớn với hệ dung môi CHClaiMeOH. Kiểm tra bằng
SKLM các phân đoạn hứng được bằng hệ dung môi n-Hexan - EtOAc (3:1) để
đánh giá khả năng tách. Xem xét khả năng tách cũng như khối lượng của các cắn
phân đoạn, nhận thấy phân đoạn gộp A20 (m = 0,38 g) có thể triển khai tiếp với
hệ dung môi n-Hexan-EtOAc.
Lần 2: chạy sắc kí cột nhỡ với hệ dung môi n-Hexan:EtOAc. Thực hiện
chấm SKLM lại các phân đoạn đã gộp với hệ dung môi khai triển là: n-Hexan:
EtOAc (6:2, acid hóa bởi 2 giọt acid formic). Xem xét khả năng tách nhận thấy
phân đoạn A20.4 có khả năng tốt nhất. Thực hiện chấm SKLM phân đoạn này
với các hệ dung môi khác nhau nhận thấy đối với hệ CH2CI2 - EtOAc (3:1) thì
phân đoạn A20.4 tách tưcmg đối tốt.
Lần 3: chạy cột sắc kí nhỏ với hệ dung môi EtOAc:CH2Cl2, thu được 7
phân đoạn A20.4.1, A20.4.2, A20.4.3, A20.4.4, A20.4.5, A20.4.6, A20.4.7. Thực
hiện chấm lại SKLM các phân đoạn trên với hệ 3 dung môi n-Hexan - EtOAc
(1:1), CHCI3 - MeOH (9:1), CH2CI2 - EtOAc - HCOOH (1:1:0,015) nhận thấy
phân đoạn A20.4.6 vết lên rõ nhất và chỉ có 1 vết.
Qua phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định được chất
A20.4.6 phân lập được là p-sitosteroỉ. Công thức hóa học của chất này như sau;


Bàn luận
Khi tiến hành so sánh hình thái của 3 mẫu thu hái được với đặc điểm của
một số loài được mô tả trong các tài liệu tra cứu chuyên dụng, nhận thấy phần
lớn các đặc điểm đều tương đồng với tài liệu. Đồng thời, khi so sánh 3 mẫu với
nhau cũng thấy hình thái của chúng khác nhau khá rõ rệt (như về hình dạng, kích
thước lá, cụm hoa, màu sắc thân...). Vì vậy, có thể đánh giá rằng kết quả giám
định tên khoa học có tính chính xác tương đối cao.
Limonene chứa trong tinh dầu cụm hoa Nút áo cũng như /3-sitosterol theo
nhiều nghiên cứu cho thấy chúng đều có tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus
muían [6 , 7], Điều này mở ra hướng đi mới cho việc khai thác tinh dầu cụm hoa

Nút áo cũng như các thành phần chứa trong dịch chiết cụm hoa nhằm phát triển
các sản phẩm điều trị bệnh răng miệng. Trên thực tế có thể tiến hành phần lập
thêm nhiều thành phần từ cây Nút áo bằng phương pháp sắc kí cột. Tuy nhiên, do
thời gian thực hiện đề tài tương đối ngắn nên kết quả thu được chưa triệt để.
Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy nồng độ dịch chiết càng đậm đặc
thì tác dụng kháng khuẩn càng tốt. Với nồng độ 1;2 trên dịch VH có hoạt lực so
với Gentamycin là 71,16%. Đây là một kết quả rất khả quan để định hướng phát
triển loài Spiỉanthes oleracea L. cho tác dụng chống sâu răng.
Kết luận
Đã mô tả được đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của 3 mẫu
nghiên cứu là Spilanthes oleracea L., Spilanthes acmella L .. Murr và Spilanthes
grandiflora Turcz., họ Cúc Asteraceae, đồng thời tiến hành phân tích vi phẫu cơ
quan sinh dưỡng của các mẫu.
Đã xác định được hàm lượng tinh dầu trong hoa Nút áo là 0,1% (g/ml)
(tính theo trọng lượng khô) và xác định thành phần hóa học tinh dầu hoa Nút áo,
trong đó thành phần Limonene là lớn nhất với tỉ lệ 30,71%.


Đã phân lập được chất lỡ-sitosterol từ phân đoạn Choroform của dịch
chiết hoa Nút áo {Spilanthes oleracea L.).
Đánh giá được hoạt tính sinh học của dịch chiết các bộ phận trên mặt đất
của các mẫu nghiên cứu thông qua việc thử khả năng ức chế vi khuẩn gây sâu
răng Streptoccocus mutans và xác định được dịch chiết hoa Spilanthes olemcea
L. có hoạt tính mạnh nhất với hoạt lực là 71,16% so với Gentamycin.
Tài liệu tham khảo
1. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.
562-563.
2. Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây cỏ Việt Nam, quyển 3, NXB Trẻ, tr. 230, 276.
3. Võ Văn Chi (2003), Từ điển Thực vật Thông dụng, tập 2, NXB Khoa học và
Kĩ thuật, tr. 2318-2319.

4. Võ Vãn Chi (1997), Từ điển cây thuốc, NXB Y học.
5. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật ỉàm thuốc ở Việt Nam, tập I, tr.
569-331.
6 . Jung EK (2009), Chemical Composition and Antimircobacterial Activity of
the Essential Oil of Chrysanthenum indicum Against Oral Bacterial, Journal
o f Bacteriology and Virology, Vol. 39, No. 2, pp. 61-69.
7. Natiya Joycharat, Sonesay Thammavong, Surasak Limsuwan, Sirilux
Homlaead,
Supayang
Piyawan
Voravuthikunchai,
Boon-ek
Yingyongnarongkul, Sukanya Dej-adisai, Sanan Subhadhirasakul (2013),
Antibacterial substances from Albizia myriophylla wood against cariogenic
Streptococcus mutans, Archives ofPharmacal Research.