Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong tiêu chuẩn hóa dược liệu đinh lăng (radix polysciasis)

ỨNG DỤNG SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG TIÊU CHUẨN
HÓA DƯỢC LIỆU ĐINH LẢNG ( RADIXPOLYSCIASIS)
Chừ Thi Thanh Huyền', Vũ Ngọc Ánh Trịnh Thị Nhung '
HDKH: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh', ThS. Nguyễn Huy Văn^
ThS. Lâm Thị Bích Hồng^, TS. Hà Vân Oanh'
'Trường Đại học Dược Hà Nội
^Công ty Cổ phần Traphaco
Từ khóa: acid oleanolic, đinh lăng, HPLC, pic đảnh dấu.
Tóm tắt
Phương pháp HPLCpha đảo detector u v ở bước sóng 208 nm; cột Inertsil
ODS (250 X 4,6 mm; 5 ịtm), pha động acetonitril: dung dịch HịP 04 0,1% (70 :
30). Định tính đinh lăng dựa trên cụm 6 pic trong đó pic acid oleanoỉic lả “pic
đảnh dấu ” có thời gian lưu khoảng 28 phút. Các chất được tách từ dược liệu
đinh lãng có thời gian lưu tương đổi lần lượt là 0,61; 0,65; 0,72; 0,75; 1,00 và
1,08. Đồng thời tiến hành định lượng acid oleanolic trong dược liệu dựa vào
đường chuẩn acid oleanolic xây dựng trong ngày phân tích với khoảng nồng độ 5
- 40 ug/ml có r > 0,999. Hàm lượng acid oỉeanolic trong các mẫu nghiên cứu
nằm trong khoảng 0,011 mg/g đến 0,15 mg/g.
Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cây đinh lăng có tên khoa học là Polyscias
/ruticosa (L.) Harm., họ Nhân sâm (Araliaceae) đã và đang trở thành một trong
những nguyên liệu chính sản xuất nhóm các sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não.
Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới về nghiên cứu thuốc từ dược liệu,
ngoài các yếu tố như hiệu quả lâm sàng, độ an toàn, nghiên cứu về cơ chế tác
dụng, cần phải có các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phưong
pháp đánh giá chất lượng dược liệu một cách khoa học và đầy đủ. Tiêu chuẩn hóa
sản phẩm với các tiêu chí rõ ràng, kiểm soát được các thành phần hoạt chất cụ thể
(định tính, định lượng) là một trong những điều kiện tiên quyết để sản phẩm có
thể hội nhập vào thị trường thế giới. Nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất
lượng của nguyên liệu đầu vào trong sản xuất của dược liệu đinh lăng, chúng tôi
đã bước đầu xây dựng dấu vân tay cho dược liệu này dựa trên việc định tính acid

oleanolic và năm chất có mặt trong đinh lăng, đồng thời định lượng acid
oleanolic trong dược liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
- Chất đối chiếu: Acid oleanolic, Tokyo Chemical Industry Company, hàm
lượng 98,8%, độ ẩm 2,3%.


- Dung môi, hóa chât: Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN), acid phosphoric
đặc loại HPLC của Merck, Đức. Acid hydrocloric đặc, cloroform loại tinh khiết
phân tích, Trung Quốc.
- Thiết bị phân tích: Hệ thống máy HPLC detector UV-DAD của Agilent
Technologies 1260 Infinitive, Mỹ. Cân phân tích Mettler Toledo AB 204, Thụy
Sỹ (d = 0,1 mg). Các thiết bị và dụng cụ khác phù hợp yêu cầu nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu
Dược liệu đinh làng được thu hái từ các vùng khlác nhau của ba tỉnh Hòa
Bình (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu) và Đắk Nông (3 mẫu) do Công ty Traphaco
cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu
- Xử lý mẫu; Qua tham khảo tài liệu [1, 5, 7, 8] và tiến hành khảo sát, chúng tôi
đã lựa chọn được qui trình xử lý mẫu [4] như sau: Cân chính xác khoảng 2,5 g
bột dược liệu (dược liệu khô, nghiền nhỏ, rây qua rây cỡ 1400), thêm 40 ml
MeOH vào đun sôi hồi lưu trong 3 giờ, lọc lấy dịch, thêm 40 ml dung dịch acid
hydrochloric 1/2, đun sôi hồi lưu trong 3 giờ. Làm lạnh, lọc lấy cắn, rửa cắn bằng
nước đến hết acid và sấy ở 60“c khoảng 15 phút. Thêm vào cắn 25 ml cloro form,
khuấy kỹ, làm nóng trên cách thủy 10 phút, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách
thủy đến cạn. Hòa tan và pha loãng cắn bằng MeOH trong vừa đủ 10,00 ml, lọc
qua màng lọc 0,45 ịim được dung dịch tiêm sắc ký.
- Điều kiện sắc ký: Qua tham khảo tài liệu [1, 7, 8] và tiến hành khảo sát thực tế,
điều kiện sắc ký được lựa chọn là:

Cột: Inertsil ODS (250 X 4,6 ram; 5/im), bảo vệ cột Inertsil ODS
(10 X 4,6 mm; 5 Ịim), nhiệt độ cột 40°c
^ Pha động: MeCN : dung dịch H3PO 4 0,1% (70 : 30 tưtt)
^ Detector u v với X= 208 nm
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Thể tích tiêm; 10
- Định tính; Dựa vào việc so sánh thời gian lưu của pic ứng với acid oleanolic
trên sắc ký đồ (SKĐ) của mẫu thừ với mẫu chuẩn acid oleanolic làm song song
khi phân tích bằng HPLC. Đồng thời, lựa chọn một số pic đặc trung trong SKĐ
mẫu thử sử dụng pic acid oleanolic là “pic đánh dấu” để đưa ra kết luận dương
tính khi xác định sự có mặt của đinh lăng.
- Định lượng; Tiến hành xử lý mẫu thừ và tiến hành sắc ký. Tính nồng độ acid
oleanolic dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích với khoảng
nồng độ acid oleanolic 5 - 4 0 ng/ml có hệ số tưofng quan hồi quy r > 0,999. Hàm
lượng (mg/g) acid oleanolic trong dược liệu tính theo chế phẩm khô (mẫu thử


được xác định độ ẩm bằng cân phưoTig pháp sấy ở nhiệt độ cao) được tính theo
công thức sau:
C
mx(lOO-a)
Trong đó:
C; nồng độ acid oleanolic của dung dịch phân tích (ịig/ml)
m: khối lượng bột dược liệu (g)
a ; độ ẩm của bột dược liệu hoặc cao khô dược liệu (%)
Kết quả
Định tính acid oleanolic trong dược liệu đỉnh lăng
Tiến hành xử lý mẫu và phân tích các mẫu dược liệu theo điều kiện trên, kết
quả cho thấy tất cả các mẫu thử đều cho một pic có thời gian lưu khoảng 28 phút,
tương ứng với pic acid oleanolic và tách riêng khỏi các pic khác trên sắc ký đồ.

Hơn nữa, để khẳng định chắc chắn sự có mặt của acid oleanolic trong đinh lăng,
tiến hành phân tích ừên hệ thống LC - MS/MS Thermo Scientific (Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương) mẫu thử là phân đoạn chứa acid oleanolic (từ khoảng
26 - 30 phút). Kết quả cho thấy trên phổ đồ của mẫu thử xuất hiện ion mẹ (ban
đầu) có m/z là 455,5 ứng với phân tử acid oleanolic (M = 456,7) và ion tạo thành
(con) có m/z là 406,8 tương tự như phổ đồ của mẫu chuẩn acid oleanolic. Hình 1
là sắc ký đồ khi phân tích đinh lăng bằng HPLC.

(a) ì

i

[

_ ____ jAJV
ị Ể

^

__ is
I

(b)
....

---

Ị

”T

toi' í ,

(c)

Hình 1. Sắc ký đồ một số mẫu đinh lăng và acid oleanolic chuẩn
a) Mầu thử 1
b) Mau thử 2
c) acid oleanolic chuẩn
Mặt khác, ừong SKĐ của tất cả các mẫu đinh lăng ngoài pic acid oleanolic
đều có 5 pic nữa có thời gian lưu ổn định so với thời gian lưu của pic acid


oleanolic do đó chúng tôi đã lựa chọn một cụm bao gồm 6 pic (trong đó pic acid
oleanolic là “pic đánh dấu”) dùng để định tính dược liệu đinh lăng. Các pic này
có thời gian lưu tương đối lần lượt là 0,61; 0,65; 0,72; 0,75; 1,00 - acid oleanolic
và 1,08. Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả định tính và định lượng acid oleanolic trong một số mẫu
Kêt quả định tính
Ký
hiệu
mẫu

Số
tuổi

Thòi gian lưu tirong đôi của các pic so
vói pic acid oleanolic

Kết quả định lirọng

0,61

0,65

0,72

0,75

1,00

1,08

Khôi
lưọTig

Độ ẩm
(%)

Hàm
luọng
(mg/g)

NI

3

+

+

+

+

+

+

(g)
25,352

6,58

0,0585

N2

3

+

+

+

+

+

+

25,348

7,31

0,0711

N3

3

+

+

+

+

+

+

25,200

9,93

0,1190

N4

3

+

+

+

+

+

+

25,322

3,41

0,0504

N5

5

+

+

+

+

+

+

25,627

3,26

0,0671

N6

4

+

+

+

+

+

+

25,680

2,47

0,0759

N7

3

+

+

+

+

+

+

25,279

5,44

0,1316

N8

3

+

+

+

+

+

+

25,489

6,60

0,1255

N9

4

+

+

+

+

+

+

25,583

9,05

0,1518

NIO

5

+

+

+

+

+

+

26,356

8,53

0,0947

N ll

6

+

+

+

+

+

+

25,318

6,56

0,0916

N12

6

+

+

+

+

+

+

25,676

6,75

0,0837

H13

3

+

+

+

+

+

+

25,495

4,96

0,1329

H14

3

+

+

+

+

+

+

25,330

4,78

0,1026

H15

3

+

+

+

+

+

+

25,359

5,23

0,1395

H16

3

+

+

+

+

+

+

25,397

4,63

0,1175

D17

0,8

+

+

+

+

+

+

25,769

6,49

0,0125

D18

0,8

+

+

+

+

+

+

25,326

5,13

0,0113

D19

0,8

+

+

+

+

+

+

25,498

3,85

0,0238

Định lượng acid oleanolic trong đinh lăng
- Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu.
- Trong cùng ngày phân tích các mẫu dược liệu, xây dựng đường chuẩn acid
oleanolic trong khoảng 5 - 4 0 )ag/ml, thiết lập phưong trình hồi quy biểu diễn mối
tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic chuẩn. Yêu cầu đường
hồi quy phải có dạng đường thẳng với hệ số tương quan r > 0,999.


- Tính nồng độ acid oleanolic trong dung dịch sắc ký dựa vào diện tích pic của

acid oleanolic trong các SKĐ ở phần định tính theo phưong trình hồi quy. Từ đó
xác định được hàm lượng (mg/g) acid oleanolic trong dược liệu tính theo chế
phẩm khô. Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Kết quả ở bảng 1 cho thấy:
- Hàm lượng acid oleanolic trong các mẫu dược liệu ngay ở cùng một địa
phương, cùng tuổi có sự khác nhau.
- Với các mẫu đinh lăng có độ tuổi khác nhau (3, 4, 5, 6 tuổi) ở Nam Định,
hàm lượng acid oleanolic không có sự khác biệt rõ rệt.
- Hàm lượng acid oleanolic trong dược liệu ở Đắk Nông thấp hơn hẳn hai
địa phương Hòa Bình và Nam Định.
Bàn luận
Chuyên luận “Đinh lăng” ở Dược điển Việt Nam IV [2] chưa đề cập tới chỉ
tiêu định lượng, còn chỉ tiêu định tính dùng phản ứng hóa học để xác định sự có
mặt của saponin và tinh bột. Do đó, kết quả của nghiên cứu góp phần cung cấp
quy trình phân tích mới định tính, định lượng các hoạt chất trong đinh lăng nhằm
góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu này.
Định tính dược liệu dựa vào thời gian lưu tưong đối có sử dụng pic đánh
dấu khi phân tích bằng HPLC chưa nhiều, nhưng phương pháp này lại được sử
dụng rất nhiều khi thực hiện phân tích bằng sắc ký lóp mỏng, sắc ký khí do đó
cần nghiên cứu đưa ứng dụng này vào thực tế kiểm nghiệm. Nghiên cứu này đã
phát triển phương pháp HPLC để tách, định tính cụm 6 chất trong đinh lăng dùng
acid oleanolic làm chất đánh dấu. Các chất trong đinh lăng cho pic có giá trị thời
gian lưu tương đối so với pic acid oleanolic lần lượt là: 0,61; 0,65; 0,72; 0,75;
1,00 và 1,08.
Định lượng dựa vào phương pháp chúng tôi đã thẩm định [4], tính hàm
lưọng acid oleanolic trong mẫu thử dựa vào đường chuẩn acid oleanolic xây
dựng trong cùng ngày phân tích nên kết quả thu được là đáng tin cậy. Hàm lưọng
acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng dao động trong khoảng từ 0,011 mg/g
đến 0,15 mg/g. Có sự khác nhau về hàm lượng acid oleanolic giữa các mẫu đinh
lăng được trồng ở các địa phưcmg khác nhau, cũng như tuổi khác nhau. Tuy

nhiên, có thể thấy đinh lăng có số tuổi nhỏ hơn 1 tuổi thì có hàm lượng acid
oleanolic thấp hơn nhiều so với đinh lăng từ 3 tuổi trở lên. Sự khác biệt về hàm
lượng acid oleanolic có thể còn liên quan đến sự khác biệt về giống, thời gian thu
hái, nơi canh tác, quy trình canh tác, khí hậu, thổ nhưỡng,... do đó cần có các
nghiên cứu trên quy mô rộng hơn với sự nghiên cứu đồng bộ về các yếu tố tác
động đến hàm lượng acid oleanolic.


Trong nước đã có các dược liệu được tiêu chuẩn hóa bằng định lượng hoạt
chất trong các nghiên cứu và dược điển. Các nghiên cứu có thể kể đến là “Nghiên
cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công
tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược” [1] hay “Nghiên
cứu thiết lập 10 chất chuẩn chiết tìr dược liệu” [3] của Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ưong. Một số chuyên luận của Dược điển Việt Nam IV như là chuyên luận
“Chè dây” định lượng bằng phương pháp HPLC - u v sử dụng dung chất đối
chiếu là dihydromyricetin, chuyên luận “Thổ hoàng liên” và chuyên luận “Vàng
đắng” định lượng bằng phương pháp HPLC - u v sử dụng chất đối chiếu là
berberin. Do đó, nghiên cứu này sẽ đóng góp nâng cao tiêu chuấn chât lượng của
dược liệu sản xuất trong nước.
So với các nghiên cứu trước đây về định lượng đinh lăng ở Việt Nam chủ
yếu sử dụng phương pháp cân để định lượng saponin toàn phân, đây là lần đẩu
tiên đã xây dựng được một phưcmg pháp định lượng một sapogenin đã được biết
đến là có mặt trong đinh lăng (acid oleanolic) bằng phương pháp hiện đại HPLC. Phương pháp HPLC định lượng acid oleanolic sử dụng trong nghiên cứu
này đã được thẩm định theo các chỉ tiêu về thẩm định phương pháp phân tích
trong các thuốc và nguyên liệu làm thuốc bằng phương pháp HPLC gồm: Tính
chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ
ổn định của dung dịch chuẩn. Với điều kiện sắc ký không quá phức tạp, có thể
triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm của Việt Nam, chất phân tích acid oleanolic
đã tách hoàn toàn ra khỏi các tạp trong mẫu dược liệu vóả thời gian triến khai sắc
ký khoảng 35 phút. So với nghiên cứu của Huahong Wang [7], phương pháp sử

dụng trong nghiên cứu có khoảng nồng độ tuyến tính trong phạm vi các mức
nồng độ cao hơn (5 - 40 Ịig/mì) với mục tiêu định lượng được tất cả các mẫu thử;
so với nghiên cứu của Yong-Xing Zhao [8] phương pháp được nghiên cứu có
khoảng nồng độ tuyến tính hẹp hơn song có hệ số tưoíng quan tuyến tính r tưomg
đương tất cả các nghiên cứu này. Phương pháp tiến hành trong nghiên cửu có độ
đúng tốt (phần trăm tìm lại từ 96,4% đến 104,6%). Độ lặp lại thể hiện bằng trị số
RSD % (4,06 và 4,11%) có giá trị tương đồng với các nghiên cứu của các tác giả
Huahong Wang [7] (RSD = ^83%).
Kết luận
Nghiên cứu đã tiến hành định tính, định lượng được 19 mẫu dược liệu đinh
lăng sử dụng phương pháp hiện đại là HPLC kết họfp với HPLC-MS có sử dụng
chất đối chiếu. Tuy nhiên, nghiên cứu mới chỉ được tiến hành trên một số lượng
dược liệu không nhiều chưa đủ đại diện cho tuổi thu hái, vùng trồng, thời điểm
thu hái, điều kiện canh tác, thổ nhưõng, khí hậu,... do đó nên tiếp tục ứng dụng


phưong pháp này để định lượng acid oleanolic trên nhiều mẫu đinh lăng hơn nữa
để cỏ thể đưa ra một khoảng hàm lượng quy định nhằm góp phần tiêu chuẩn hỏa
nguồn nguyên liệu đầu vào. Ngoài ra, nên tiếp tục phát triển phương pháp này để
định tính, định lượng đinh lăng trong các chế phẩm thuốc chứa đinh lăng.
Tài liệu tham khảo
1. Bộ Y tế (2009), Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ - Nghiên cứu phát
triển bộ dữ liệu chuẩn của một so dược liệu thường dùng phục vụ công tác
kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược, Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2009), Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ - Nghiên cứu phát
triển bộ dữ liệu chuẩn của một sổ dược liệu thường dùng phục vụ công tác
kiểm tra giảm sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược, Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ưong, Hà Nội.
3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr. 764-765, Phụ

lục 5, PL 119-121, PL127-129.
4. Bộ Y tế, Bộ Khoa học và Công nghệ (2010), Báo cáo kết quả nghiên cứu đề
tài nhánh thuộc đề tài nhà nước KC.IO.16/06-10 - Nghiên cứu thiết lập 10
chat chuẩn chiết từ dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Hà Nội.
5. Chử Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Kiều Anh, Trịnh Thị Nhung, Nguyễn Huy
Văn, Lâm Thị Bích Hồng (2012), Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong
cao khô đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí Dược học, 438
(52), tr. 34-38.
6. Võ Xuân Minh (1992), Nghiên cứu về saponin đinh lăng và dạng bào chế từ
đinh lăng, Luận án PTS Khoa học Y Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà
Nội.
7. Song Min Song, Taijun - Hang (2006), Determination of oleanolic acid in
human plasma and study of its pharmacokinetics in Chinese healthy male
volunteers by HPLC tandem mass spectrometry. Journal o f Pharmaceutical
and Biomedical Analysis, 40 (1), pp. 190-196.
8. Huahong Wang, Zhezhi Wang, Wubao Guo (2008), Comparative
determination of ursolic acid and oleanolic acid of Macrocarpium officinalis
(Sieb. et Zucc.) Nakai by RP - HPLC, Industrial crops and products, 28, pp.
328-332.
9. Yong-Xing Zhao, Hai-Jing Hua, Lin-Liu (2009), Development and validation
of an HPLC method for determination of oleanolic acid content and partition
of oleanolic acid in submicron emulsions, Pharmazie, 64(8), pp. 491- 494.