Nghiên cứu bào chế liposone amphotericin b bằng phương pháp pha loãng ethanol

NGHIÊN CỨU BÀO CHÉ LIPOSOME AMPHOTERICIN B
BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL
Pham Thuv Ngoe*
HDKH: ThS. Nguyễn Văn Lâm^, ThS. Nguyễn Tuấn Quang^
'A4K64, Trường Đại học Dược Hà Nội
^Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội
^ Học viện Quân y Hà Nội
Từ khoá: liposome Amphoterỉcin B, pha loãng ethanol
Tóm tắt
Khảo sát bào chế lỉposome Amphotericỉn B (AmB) bằng phương pháp pha
loãng ethanol (tiêm ethanol). Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC),
cholesterol, Amphotericỉn B được hoà tan trong hỗn hợp dung môi ethanol và N,Ndỉmethylacetamid (DMA) ở 60°c rồi tiêm nhanh dung dịch này vào pha nước ở các
tỷ lệ thể tích khác nhau để tạo lỉposome, sau đó đánh giá về kích thước tiểu phân, độ
đồng nhất, cấu trúc hình thải và hiệu suất gẳn dược chất vào liposome. Kết quả cho
thấy phương pháp tạo các liposome có kích thước nhỏ (khoảng 200 nm), đồng nhất
(PDI khoảng 0,1) mà không cần có thêm biện pháp làm giảm kích thước tiểu phân
hay đồng nhất hoá, hiệu suất gắn dược chất vào liposome lên tới 70Yo với hỗn dịch
AmB 50mg/ỉ0ml, chụp TEM thấy liposome có cẩu trúc đa khoang đa lớp nhưng sổ
khoang và số lớp không nhiều (dưới 3).
Đặt vấn đề
Liposome với lịch sử gần 50 năm (từ năm 1965) đã có rất nhiều công trình
nghiên cứu về các phương pháp bào chế và ưu nhược điểm của chúng. Một trong
những phương pháp khá đơn giản để bào chế liposome là pha loãng ethanol (tiêm
ethanol)-lần đầu tiên được công bố bởi hai nhà khoa học Batzri and Kom. ở phương
pháp này, dung dịch phospholipid (có hoặc không dược chất) trong ethanol được
tiêm nhanh vào dung dịch đệm đang được khuấy trộn. Ethanol nhanh chóng pha
loãng vào trong nước, phân tử phospholipid sẽ tập hợp lại thành lóp kép, rồi tự đóng
thành các liposome. Các lớp kép có xu hướng lớn lên về kích thước, rồi mới tự đóng
thành liposome hoặc thậm chí bao ngoài các tiểu phân khác, nên liposome nguyên
thuỷ có kích thước khá to, có nhiều hiện tượng đa khoang đa lớp. Khi có sự phân tán
mạnh ở môi trưÒTig hydrat hoá, cản trở sự lớn lên về kích thước lớp kép

phospholipid, tạo nên các tiểu phân nhỏ và ít đa khoang đa lớp hơn. Do đó, ưu điểm
nổi bật của pha loãng alcol là tạo được liposome có kích thước nhỏ và độ đồng nhất


cao ngay sau khi bào chế. Phương pháp này đã và đang được ứng dụng khá rộng rãi,
trong bào chế liposome trắng hay lipsome hoá các dược chất thân dầu tan trong
ethanol. Công nghệ bào chế cũng ngày được cải tiến với công nghệ tiêm cắt dòng
(crossflow injection).
ở Việt Nam, Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội là nơi thực hiện
nhiều nghiên cứu nhất về liposome. Các nghiên cứu trước đã bào chế liposome
AmB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo, hydrat hoá màng film [1]. Tuy nhiên,
phương pháp bốc hơi pha đảo có nhược điểm là quy trình bào chế phức tạp, trải qua
nhiều giai đoạn, có sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ trong chế phẩm. Còn trong
phương pháp hydrat hoá màng film, quá trình hydrat kéo dài và không bóc tách
được hoàn toàn lớp màng film trên thành bình. Kết quả của hai phương pháp đều
cho liposome AmB tạo ra có kích thước to (trên 1000 nm), chỉ sổ đa phân tán PDI
cao. Có lẽ bởi độ tan rất hạn chế của AmB ữong hầu hết dung môi, đặc biệt là
ethanol mà phương pháp tiêm ethanol chưa được khảo sát. Đây cũng là khó khăn
chung với các nghiên cứu trước, khi sản phẩm bào chế chỉ có hàm lượng lý thuyết
lOmgAmB/lOml. Bởi vậy cải thiện độ tan cho AmB không chỉ giúp ứng dụng
phương pháp, mà còn tăng hàm lượng chế phẩm.
Sau khi khảo sát các ưu điểm và hạn chế, nghiên cứu quyết định bào chế liposome
AmB bàng phương pháp tiêm ethanol (pha loãng ethanol) gồm hai mục tiêu:
- Đưa ra quy trình bào chế liposome AmB 50mg/10ml bằng phương pháp
pha loãng ethanol.
- Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Amphotericin B (AmB) Trung Quốc, tiêu chuẩn USP. Hydrogenated soybean
phosphatidylcholine (HSPC) của Lipoid, cholesterol của Sigma-Aldrich, ethanol

(Trung Quốc), đường sucrose (Trung Quốc), dinatrisuccinat hexahydrat (Trung
Quốc).
Thiết bị
Máy đồng nhất hoá ưnidrive X I000, thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros®
Filter Moducles, màng polysulfone, kích thước lỗ 10 kD, diện tích lọc 20 cm^, hệ
thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvem-Anh), hệ thống
máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Aligent.


Phương pháp bào chế liposome Am B
Hoà tan phospholipid HSPC, cholestertol (2.5:1) vào 5 ml ethanol ở 50°c ,
điều chỉnh pH bằng acid HCl 2.5N đến pH 1-3. 50 mg AMB được hoà tan trong 3
ml đồng dùng môi DMA:EtOH (1:2, v/v) rồi trộn với dung dịch phospholipid. Đun
cách thuỷ ở 50°c đến khi thu được pha ethanol màu vàng da cam trong suốt.
Pha nước: đệm dinatri succinat 9 mM pH 5-6 + sucrose 7.5%
Phối hợp pha ethanol với pha nước: Tiêm chính xác pha ethanol vào pha
nước (60°C) với tỷ lệ 5; 6,7; 8; 10; 20% ethanol/nước (v/v) tương ứng. Khuấy tốc độ
cao ở 3900 vòng/phút trong 10 phút. Lọc tiếp tuyến để cô đặc dung dịch về thể tích
10 ml. Tiếp tục lọc rửa tiếp tuyến bằng 100 ml dd pha nước để thu được hỗn dịch
chứa 50 mg AmB.
Hiệu suất nạp thuốc
Định lượng AmB trong dịch thải sau lọc tiếp tuyến của công thức liposome
AmB 8% ethanol/nước bằng phương pháp HPLC [5]. Cột sắc kí: Eclipse XDB C18, 5 |im, 4,6x150 mm. Pha động gồm các đồng dung môi của đệm natri acetat
5mM pH 6.0; acetonitrihmethanol với tỷ lệ pha A là 48:20:32; pha B là 25:5:70
tương ứng. Chương trình chạy: 2,5 phút đầu chạy bằng 100% A. Phút thứ 2,5 đến
3,5; chuyển dần sang B. Phút 3,5-8: chạy bằng 100% B. Tốc độ dòng là 1,8 ml/phút.
Hiệu suất gắn dược chất vào liposome được tính theo công thức
khối lương AmB cân - khối lương AmB đinh lương
Hiệu su ất gẵn(H ) = ---------- ^---------- — —---------^-------------------------------khối lượng AmB cân
Đo kích thước tiểu phãn và độ đồng nhất

Sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer ZS90. Pha
loãng hệ phân tán liposome 100 lần bằng nước cất rồi tiến hành đo kích thước tiểu
phân. Đánh giá kết quả thông qua đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, Z a v e r a g e ,
chỉ số đa phân tán (PDI).
Nghiên cứu hình thái cấu trúc tiểu phân
Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật
nhuộm soi âm bản.
Kết quả
Ảnh hưởng của tỷ lệ ph a ethanol/nước tới kích thước tiểu phân
Đánh giá đặc tính phân bố KTTP của liposome tạo bởi quy trình bào chế ở
các tỉ lệ ethanol/nước khác nhau, kết quả được cho bởi Bảng 7. Ta thấy các mẫu đều
tạo được liposome với kích thước nhỏ

(Z a v era g e

< 300 nm) và tương đối đồng đều


(PDI < 0,3). Tuy nhiên khi đánh giá theo phân bố thể tích, có sự khác biệt rõ ràng
giữa các công thức trên 10% ethanol và dưới 10% ethanol. Hình la cho thấy sự
chiếm thể tích của các tiểu phân thể tích to (>1000 nm) lớn hơn nhiều so với thể tích
các tiểu phân nhỏ. Với các công thức dưới 10% ethanol, sự phân bố thể tích tập
trung ở các tiểu phân nhỏ (hình Ib), các chế phẩm tương đối đồng nhất (PDI khoảng
0,12). Do vậy, nên sử dụng lượng ethanol nhỏ hơn 10%, đặc biệt với nồng độ 8%
ethanol, tiểu phân đạt được kích thước 204 nm, PDI 0.125 tương đối nhỏ và đồng
nhất. Điều này cũng phù hợp với tài liệu tham khảo [4].
Bảng 1. Phân bố kích thước theo thể tích tương ứng
với từng tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha đệm
Tỷ lệ

^average (d.nm)

PDI

20%

176.0

0.208

10%

157.8

0.222

8%

204.3

0.125

6.7%

282.2

0.120

5%

243.1

0.129
Stze Disfribution Sy Intensity

& ze OiStñbL'tíon by Volume

S ize fd-nm)

R ecord 2 3: !ip 4 ;5 0 s a u LTT 1
— o—
R ecord 2 7 : Itp 4-'iO n gay 3/1 1Ị
R ecofd 30: iip &Ỉ40 n qay 3-1 1_______________________________________
Ị

R ecord 20: t:p4/50 1
R ecord 28: lip 4.^60 n g ay 3/1 1

R bco ' 2 26: itp 3.-60 n gay 3-’1 1;

(a)
^
(b)
Hình 1. Phân bố thể tích các công thức tỷ lệ ethanol trên 10% (a) và
Phân bố thể tích các công thức tỷ lệ ethanol dưới 10% (b)


Khả năng gắn dược chất vào liposome
Tiến hành định lượng với mẫu tốt nhất là 8% tỷ lệ pha ethanol/nước, xác định
lượng Amphotericin B trong dịch thải 15,14 mg, tức hiệu suất liposome hoá đạt

69.72%.
Nghiên cứu hình thái cẩu trúc tiểu phân liposome
Từ hình 2, cho thấy các tiểu phân có hình cầu và kích thước khá nhỏ (Idioảng
200 nm). vẫn có một số ít tiểu phân kích thước trên 200 nm nhưng Idiông có tiểu
phân nào kích thước trên 500 nm. Liposome được tạo ra dù vẫn còn có cấu trúc đa
khoang, đa lớp nhưng số khoang số lớp không nhiều (dưới 3 khoang/lóp trong 1
liposome).

L i p o s o m e A m p o f e n c i n B.001
P r i n t Ma g ;

39800x0

10 0

51 nưa

nm

L i p o s o m e A m p o f e n c i n B-0T2
Pr i n t Mag:

4:25:15 p 0 1 / 0 8 / 1 4

HV^eO.OkV

T E M M o d e : Iin^g.ing

D i r e c t Mag: 2 0 0 0 0 X

I 0 6 0 0 x (d bl rara

500

nra

A :32:13 p 0 1 / 0 8 / 1 4

HV-^SO.OkV

TEM Mode:Imaging

D i r e c t Mag: 5 0 0 0 X

(a)

^
(b)
Hình 2. Ảnh chụp TEM của chế phẩm liposome 8 % ethanol
Bàn luận
Cải thiện độ tan của AmphotericinB
Amphotericin là một chất tương đối trơ về mặt hoá lý, có tính chất lưỡng thân
và lưỡng tính, khó tan trong hầu hết các dung môi nói chung và các alcol nói riêng.
Thực nghiệm cho thấy độ tan của AmB trong các dung môi (ethanol, methanol,
isobutanol) và các đồng dung môi của các alcol đều rất hạn chế (dưới 1 mg/ml). Lợi
dụng công thức liposome có chứa phospholipid, tiến hành cải thiện độ tan của AmB
nhờ tạo phức AmB-phospholipid đã acid hoá [2]. Thực nghiệm cũng cho thấy công
thức 50 mg AmB, 213 mg HSPC tan tốt trong 8 ml EtOH (pH 1-3) ở 60°c. Trong
quy trình bào chế còn có sử dụng hỗn họp dung môi DMA:EtOH (1:2, v/v) để bão

hoà AmB, giúp AmB phân bố vào pha lỏng để có thể tiến hành phản ứng với
phospholipid [3].
Ảnh hưởng của quy trĩnh bào chế tới kích thước tiểu phân
Phương pháp tiêm ethanol khá đơn giản nhưng cho hiệu quả cao, giúp tạo ra
các liposome có kích thước nhỏ, tương đối đồng nhất [4]. Đặc biệt với AmB khi
liposome hoá, sự liên kết của cholesterol và AmB làm cho lóp lipid này trở nên cứng
nhắc, mất tính linh hoạt, gây khó khăn trong làm giảm kích thước tiểu phân [1].
Thực nghiệm cho thấy, khi giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp đẩy qua
màng (extrusion) với các KT lỗ xốp 400, 200, 100 nm thì sự thay đổi kích thước của
liposome AmB rất ít (thường vượt 50% kích thước so với lỗ lọc). Bào chế bằng tiêm
ethanol giúp bỏ qua được quy trình giảm kích thước không mẩy hiệu quả.
Trong phương pháp tiêm ethanol, cách thức phối hợp pha ethanol vào pha
nước ảnh hưởng nhiều tới chất lượng liposome. Nhiệt độ pha nước luôn được giữ ở
trên nhiệt độ chuyển pha của phospholipid (53°c với HSPC), đảm bảo cho lớp kép
phospholipid được linh hoạt, thuận lợi cho việc đóng vòng. Khi dung dịch
phospholipid trong ethanol được tiêm vào pha nước, ethanol nhanh chóng bị pha
loãng và phospholipid tập họp lại thành lóp kép, rồi tự kết hợp thành liposome. Thể
tích 2 pha ethanol/nước là 1 trong những yếu tố ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân.
Khi tăng tỷ lệ ethanol/nước (trên 10%), mật độ phospholipid cao nên có xu hướng
kết tụ lại tạo các tiểu phân kích thước lớn. Thậm chí các lớp kép phospholipid tạo
thành có thể đóng vòng cả các liposome đã tạo thành để tạo liposome kích thước
lớn, đa lớp. Tỷ lệ ethanol cao cũng làm cho sự pha loãng ethanol giảm, làm các phân
tử phospholipid không hoàn toàn tách và hydrat hoá được.
Phương pháp xác định hiệu suất gắn dược chất vào liposome
Trong phương pháp định lượng AmB, điều quan trọng nhất là chất lượng dịch
thải. Lọc tiếp tuyến lần 1 giúp giảm thể tích về 10 ml, lọc tiếp tuyến lần 2 giúp loại
alcol và loại AmB tự do trong chế phẩm. Với kích thước lỗ 10 kD, có sai số với
những tiểu phân AmB kích thước lớn hơn. Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào
trên thế giới công bố về sự tách hoàn toàn AmB tự do ra khỏi chế phẩm liposome.

Kết quả nạp thuốc 70% với chế phẩm liposome 50 mg AmB/lOml cũng khá khả
quan, so với các nghiên cứu cũ: phương pháp hydrat hoá fĩlm 85% với công thức 10
mgAmB/10 ml; phương pháp bốc hơi pha đảo 75% với công thức lOmgAmB/10 ml.


Kết luận
Nghiên cứu đã hoàn thành được mục tiêu đề ra. Đã đưa ra được quy trình bào
chế, tạo ra được các liposome Amphotericin có kích thước nhỏ ( Z a v e r a g e khoảng 200
nm), phân bố kích thước đồng nhất (PDI khoảng 0.1), hiệu suất liposome hóa khá
cao (70%). (Trong giai đoạn tiếp theo sẽ tiếp tục tiến hành nghiên cứu để lựa chọn
được các thông số kỹ thuật tối ưu cho quy trình bào chế và đánh giá tính ổn định của
quy trình bào chế cũng như khả năng triển khai ở quy mô lớn hơn).
Tài ỉiệu tham khảo
1. Đào Thị Thuỳ Dung (2013), luận văn “ Nghiên cửu bào chế - liposome
Amphotericin B”, Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Adler-Moore, Jill, Chiang, Su-Ming, Profítt, Richard Thomas (1989), Improved
amphotericin B liposome preparation, California (US).
3. c. Michael Dicken, Thomas M. Rossi, Natarajan Rajagopalan, Louis J. Ravin
and Laưy A. Stemson (1988), A study of the chemical stability o f amphotericin B
in N,N-dimethylacetamide, Department of Pharmaceutical
Research
and
Technologies, Division o f Research and Development, Smith Kline and French
Laboratories, King of Prussia, PA 19406.
4. Miquel Pons, Merce Foradada and Joan Estelrich (1992), Liposomes obtained
by the ethanol injection method, Unitat de Fisicoqu[mica, Facultat de Fann-cia,
Universität ~te Barcelona, 08028 Barcelona (Spain).
5. Niranjan M. Deshpandea,b,*, Manish G. Gangradeb, Maharudra B. Kekarea,
Vikas V. Vaidyac (2009), Determination of free and liposomal Amphotericin B in
human plasma by liquid chromatography-mass spectroscopy with solid phase

extraction and protein precipitation techniques, India.