Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin b sử dụng tá dược distearoyl phosphatidyglycerol và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ THÙY LINH
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG
TÁ DƯỢC DISTEAROYL
PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ
PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH
HYDROGEN HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2014




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG
TÁ DƯỢC DISTEAROYL
PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ
PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH

HYDROGEN HÓA

Người hướng dẫn:
TS. Trần thị Hải Yến
Nơi thực hiện:
Bộ môn bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2014



LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
TS. Trần Thị Hải Yến
Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ
bảo và định hướng của cô cho đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ
môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ và tạo điều
kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.
Nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy
bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động
viên, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên:
Mai Thị Thùy Linh

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 3
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 4
1.1.8. Liều dùng 4
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5
1.2. Liposome 5
1.2.1. Khái niệm 5
1.2.2. Thành phần của liposome amphotericin B 6
1.2.3. Ưu nhược điểm 8
1.2.4. Độ ổn định 10
1.3. Bào chế liposome 11
1.3.1. Bào chế liposome thô bằng phương pháp hydrat hóa film 11
1.3.2. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 11
1.3.3. Đông khô liposome 14
1.4. Một số nghiên cứu về liposome AMB 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 18
2.2. Nội dung nghiên cứu 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
2.3.1. Phương pháp xác định độ tan của AMB trong methanol tại các pH khác
nhau 19
2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB 20
2.3.3. Phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP liposome 22
2.3.4. Đông khô liposome 22
2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB. 23
2.4. Điều kiện thí nghiệm 26
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 27
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng AMB bằng phương pháp quang phổ hấp
thụ UV-VIS 27
3.1.1. Quét phổ dung dịch chuẩn AMB trong methanol 27
3.1.2. Khảo sát độ đặc hiệu 27
3.1.3. Đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa nồng độ AMB trong methanol
và mật độ quang 28
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại 29
3.2. Khảo sát độ tan của AMB trong methanol ở các pH khác nhau. 30
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến
đặc tính của liposome AMB. 30
3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất trong công thức 30
3.3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid. 34
3.3.3. So sánh các phương pháp làm giảm KTTP liposome 35
3.3.4. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa đến các đặc tính của liposome 37



3.4. Nghiên cứu đông khô liposome 39

3.4.1. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô đến các đặc
tính của liposome AMB. 39
3.4.2. Đông khô liposome 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT: 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC







DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
ABCD
Amphotericin B colloidal dispersion
2
ABLC
Amphotericin B lipid complex
3
AMB
Amphotericin B
4
BHA
Butylated hydroxyanisole
5

BHT
Butylated hydroxytoluen
6
Chol
Cholesterol
7
DC
Dược chất
8
DĐVN
Dược điển Việt Nam
9
DSPG
Distearoylphosphatidylglycerol
10
EDTA
Ethylendiamin tetraacetic acid
11
HPLC
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid
chromatography)
12
HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogennated
soy phosphatidylcholine)
13
KTTP
Kích thước tiểu phân
14
L-AMB

Liposome amphotericin B
15
NSX
Nhà xản xuất
16
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
17
PTFE
Polytetraflouroethylene
18
TKHH
Tinh khiết hóa học
19
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
20
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình






DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang

Bảng 1.1.
Độ tan của amphotericin B trong các dung môi khác nhau
3
Bảng 1.2.
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
5
Bảng 2.1.
Nguyên liệu
18
Bảng 3.1.
Mật độ quang của các dung dịch chuẩn trong methanol
28
Bảng 3.2.
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp quang phổ
hấp thụ UV-VIS
29
Bảng 3.3.
Độ tan (mg/ml) của AMB trong methanol ở các pH khác
nhau
30
Bảng 3.4.
Thành phần các công thức bảo chế liposome AMB thay
đổi tỉ lệ dược chất
31
Bảng 3.5.
Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến các đặc tính của
liposome AMB.
31
Bảng 3.6.
Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến độ ổn định của

liposome.
32
Bảng 3.7.
Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid tới đặc tính của
liposome
34
Bảng 3.8.
Ảnh hưởng của phương pháp làm nhỏ KTTP đến các đặc
tính của liposome.
36
Bảng 3.9.
Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến pH của
hỗn dịch liposome
37
Bảng 3.10.
Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến đặc tính
của liposome.
38
Bảng 3.11.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô
tới đặc tính của liposome AMB.
40
Bảng 3.12.
Các đặc tính của liposome sau khi phân tán trở lại từ mẫu
đông khô.
41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1.
Cấu trúc của liposome
6
Hình 1.2.
Cấu trúc liposome AMB
6
Hình 1.3.
Phân tử HSPC và DSPG.
6
Hình 1.4.
Thiết bị đùn ép mini extruder (a) và thiết bị đùn ép dưới áp
suất cao (b).
14
Hình 1.5.
Sơ đồ quá trình đông khô
15
Hình 2.1.
Sơ đồ quy trình bào chế liposome AMB bằng phương
pháp hydrat hóa màng film.
21
Hình 3.1.
Phổ hấp thụ UV-VIS của AMB
27
Hình 3.2.

Đường chuẩn của amphotericin B trong methanol và
phương trình hồi quy thực nghiệm
28
Hình 3.3.
Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến các đặc tính của
liposome AMB.
32
Hình 3.4.
Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid đến đặc tính của
liposome.
34
Hình 3.5.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa đến các đặc tính của
liposome.
38
Hình 3.6.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô
tới đặc tính của liposome AMB.
40
Hình 3.7.
Sản phẩm đông khô sử dụng tá dược lactose, sucrose,
mannitol
42



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm nấm là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong ở những bệnh
nhân ung thư và các bệnh nhân suy giảm miễn dịch khác. Hiện nay, sử dụng đầu tay
trong điều trị nhiễm nấm chủ yếu giới hạn trong hai nhóm thuốc: các thuốc kháng
sinh polyene (amphotericin B, nystatin) và các imidazoles (ketaconazole,
miconazole). Trong đó, Amphotericin B đã được sử dụng phổ biến trong điều trị được
hơn 40 năm nay do phổ tác dụng rộng và ít bị kháng thuốc. Tuy nhiên, hạn chế của
dược chất này là hầu như không tan trong nước nên sinh khả dụng thấp và nhiều tác
dụng không mong muốn, đặc biệt là gây độc cho thận. Vì vậy, nghiên cứu một hệ
mang thuốc giúp giảm độc tính trên thận và tăng hiệu quả điều trị của thuốc là vấn đề
cấp thiết.
Nhiều hệ mang thuốc chứa amphotericin B đã được nghiên cứu phát triển và
ứng dụng trên thế giới như: vi nang, vi cầu, phức hợp lipid, liposome. Trong đó, hệ
vận chuyển thuốc tiên tiến có nhiều ưu điểm nhất là dạng thuốc liposome do có thể
làm tăng thời gian lưu thông của thuốc trong hệ tuần hoàn, tăng khả năng thấm nội bào,
khu trú tác dụng của thuốc tại cơ quan đích
Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang cho dược chất ít tan trong
nước, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B sử
dụng tá dược distearoyl phosphatidylglycerol và phosphatidylcholin đậu nành
hydrogen hóa” nhằm mục tiêu:
+ Bào chế được liposome amphotericin B sử dụng tá dược distearoyl
phosphatidylglycerol và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa bằng phương
pháp hydrat hóa film.
+Bước đầu đông khô liposome AMB và nghiên cứu ảnh hưởng của các tá dược
đông khô đến đặc tính của liposome amphotericin B sau pha lại.
2



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Amphotericin B
1.1.1. Nguồn gốc
Amphotericin B là một kháng sinh polyene tự nhiên, được đưa vào sử dụng từ
năm 1955; và được phân lập lần đầu tiên năm 1959 từ Streptomyces nodosus bởi
Dutcher và cộng sự [10]. Cụ thể, Amphotericin B là một hỗn hợp của polyenes kháng
nấm sản xuất bởi sự tăng trưởng của một số chủng Streptomyces nodosus, bao gồm
chủ yếu là (1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,27E,29E,
31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl) oxy] -1,3,
5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,18-trimethyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo [33.3.1]
nonatriaconta-19,21,23,25,27,29,31 - heptaene-36-carboxylic acid. Hàm lượng
không nhỏ hơn 750 IU/mg, tính theo chất khô [14].
1.1.2. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17
.
Khối lượng phân tử: 924 [14].

1.1.3. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [3],[10],[14].
- Độ tan: thực tế không tan trong nước, hòa tan trong dimethyl sulphoxide và trong
propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực
tế không tan trong cồn [14]. Amphotericin B hầu như không tan trong nước
(<0,1mg/ml ở 21
0

C), không tan trong cloroform hay ethanol. Nó hòa tan trong
dimethyl sulphoxide (DMSO) (30-40 mg/ml) và dimethylformamide (DMF) (2-4
mg/ml), tan được trong methanol [3].


3



Bảng 1.1: Độ tan của Amphotericin B trong các dung môi khác nhau [10].
Dung môi
Độ tan (mg/l)
Nước
<1 (ở pH 6-7)
Methanol
2,000
Ethanol
500
Choloroform
100
Ether dầu hỏa
10
Dimethyl formamide
2,0
Prolylene glycol
1,0
Cyclohexane
20

 Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin

và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tính và lưỡng thân [3].
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung dịch
kiềm [3].
- Dung dịch amphotericin B trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405
nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381
nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [3].
1.1.4. Tác dụng dược lý
Amphotericin B là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là
ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng [4],[20].
Amphotericin B cũng gắn với sterol bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải
thích được một phần độc tính của thuốc đối với người [4].
Trên mặt lâm sàng, amphotericin B có thể chống lại Absidia spp. , Aspergillus
spp. , Basidiobolus spp. , Blastomyces dermatitidis , Candida spp. , Coccidioides
immitis , Conidiobolus spp. , Cryptococcus neoformans , Histoplasma capsulatum ,
Mucor spp. , Paracoccidioides brasiliensis , Rhizopus spp. , Rhodotorula spp. , và
Sporothrix schenckii [20].
1.1.5. Dược động học
Dược động học của amphotericin B thay đổi đáng kể phụ thuộc vào dạng dùng
như amphotericin B quy ước (micell), phức amphotericin sulfate cholesteryl, phức
4



amphotericin B lipid hoặc liposome amphotericin B.
- Hấp thu: Amphotericin B không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được
dùng đường tiêm.
- Phân bố: hơn 90 % thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein.
Thông tin về phân bố của amphotericin B còn hạn chế. Để đạt được nồng độ trong
dịch não tủy có tác dụng kìm nấm, amphotericin B phải được thường xuyên tiêm

vào trong vỏ não. Thuốc qua được nhau thai, chưa biết có qua sữa hay không.
- Chuyển hóa: chưa được làm rõ.
- Thải trừ: Amphotericin B được thải trừ rất chậm qua thận. Thời gian bán thải của
liposome amphotericin B là 100-153 giờ [11].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans
ở miệng và đường tiêu hóa.
- Thuốc tiêm tĩnh mạch amphotericin B thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn
nấm toàn thân nặng do nấm Aspergillus, Blastomyces, Candida,
Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và
Sporotrichum.
- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid: được chỉ định cho những trường hợp đã
được điều trị bằng amphotericin B thông thường mà bị thất bại hoặc những trường
hợp mà amphotericin B thông thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [4].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn (thường gặp)
- Phản ứng chung: Rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp.
- Máu: Thiếu máu đẳng sắc, kích thước hồng cầu bình thường và hồi phục được
- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn
- Chuyển hóa: Rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết.
- Tiết niệu: Giảm chức năng thận kèm theo tăng creatinin và urê huyết [4],[20].
1.1.8. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:
- AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa
5



1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách
1 ngày.
- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 mg/kg/ngày.

- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.
- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong
miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [4].
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
Bảng 1.2. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường [25].
TT
Tên chế
phẩm
Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
Dạng bào
chế
1
Fungizone
50 mg
AMB với natri
deoxycholat
Micell
bột đông
khô
2
Abelcet
(ABLC)
100mg/

20ml
DMPC:DMPG:AMB
(tỷ lệ mol 7:3:10)
phức hợp
lipid
hỗn dịch
3
Amphotec
(ABCD)
50 mg,
100 mg
phức hợp AMB với
cholesteryl sulfate
(tỷ lệ mol 1:1)
phức hợp
lipid
bột đông
khô
4
Ambisome
(L-AMB)
50 mg
HSPC:DSPG:Chol:AMB
(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)
liposome
bột đông
khô
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở

giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích
thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1],[2],[9],[27].
Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, là hệ điều trị phát triển ở mức
cao hơn thuốc tác dụng kéo dài [1],[2]. (hình 1.1).


6



A: Bề mặt ưa nước của lớp vỏ lipid kép
B: Lớp kỵ nước của lớp vỏ lipid kép
C: Nhân nước bên trong có thể chứa dược
chất tan trong nước
D: Các dược chất kết tinh bên trong nhân
E: Các dược chất thân dầu trong lớp vỏ lipid

Hình 1.1. Cấu trúc của liposome
Liposome amphotericin B đã được
chứng minh là đã làm giảm độc tính, thuận
lợi cho sử dụng liều lượng lớn và hiệu quả
hơn [2],[25].
Hình 1.2. Cấu trúc liposome AMB
1.2.2. Thành phần của liposome amphotericin B
1.2.2.1. Vỏ liposome
Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol.
Phospholipid
Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm phosphatidylcholin đậu
nành hydrogen hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).

Hình 1.3. Phân tử HSPC và DSPG.
HSPC có các ưu điểm sau: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu
nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo
chưa no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất
[8],[37].
7



DSPG ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid kép, còn đóng vai trò quan
trọng trong cơ chế hình thành của liposome AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính,
DSPG có một nhóm phosphate bị ion hóa và do đó, phân tử tích điện âm. Khi được
hòa tan trong một dung môi không proton với độ pH khoảng từ 1,0 đến 3,0, các phân
tử DSPG có xu hướng nhận một proton và tạo thành một phân tử trung hòa về điện
tích. Khi AMB thêm vào dung dịch axit hóa trên, các proton của nhóm phosphate sẽ
có xu hướng được chuyển giao cho các nhóm amin của amphotericin B. Kết quả là
các phân tử AMB sẽ tích điện dương. Đồng thời, nhóm phosphate của phospholipid
sẽ từ bỏ một proton và mang điện tích âm. Do đó sự tích điện trái dấu, các phân tử
thu hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của chúng tạo thành một cặp ion. Như vậy,
sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phosphatidylglycerol được tăng lên rất nhiều. Các
chuỗi hydrocarbon béo của các phospholipid bị thu hút bởi tương tác kỵ nước vào
chuỗi dài của liên kết đôi không có nhóm thế của polyene [26].
Việc lựa chọn phospholipid cho thành phần của liposome là rất quan trọng,
ảnh hưởng đến các đặc tính của liposome. Vì vậy, việc lựa chọn phải căn cứ trên các
đặc điểm sau:
- Mức độ bão hòa của lipid: phospholipid không bão hòa (như
phosphatidylcholin lòng đỏ trứng, phosphatydylglycerol,…) dễ bị peroxyd hóa dẫn
đến hỏng màng, rò rỉ dược chất. Vì vậy, phospholipid bão hòa (như dipalmytoyl
phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic,…) được sử dụng nhiều hơn [8],[37].
Quá trình oxy hóa phospholipid trong liposome chủ yếu diễn ra trong chuỗi acyl béo

không bão hòa theo cơ chế chuỗi gốc tự do. Nhưng các axit béo bão hòa cũng có thể
bị oxy hóa ở nhiệt độ cao [17]. Có thể cho thêm vào thành phần liposome chất chống
oxy hóa như α-tocoferol, BHA, BHT,… nhưng có thể sẽ làm mất ổn định vật lý của
liposome và tăng khả năng kết tụ [8],[37].
- Khả năng tích điện: phospholipid tích điện (phosphatidylglycerol, acid
phosphatidic,…) sẽ làm tăng thể tích khoang nước hoặc tạo nên liên kết tĩnh điện với
dược chất tích điện. Thay đổi điện tích trên bề mặt liposome có thể thay đổi đặc tính
dược động học và sự phân bố của liposome trong cơ thể [8].
8



- Nhiệt độ chuyển pha (T
C
): liên quan đến hiện tượng chuyển pha của
phospholipid. Ở dưới nhiệt độ chảy, vỏ phospholipid ở trạng thái gel có cấu trúc bền
chặt, khó thấm, còn ở trên nhiệt độ chảy, phospholipid chuyển sang trạng thái lỏng
với cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo, dễ dò rỉ dược chất khi bào chế, bảo quản liposome [8].
Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lý, do đó nên sử
dụng các phospholipid có T
C
> 37
0
C [12].
- Độ tinh khiết: tùy theo mục địch nghiên cứu và sử dụng mà yêu cầu nguyên
liệu có độ tinh khiết khác nhau.
Cholesterol
Cholesterol không tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều chỉnh
thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome. Nếu không có
cholesterol thì lớp phospholipid của liposome dễ tương tác với protein huyết tương

như albumin, transferrin, macroglobulin dẫn tới giảm độ ổn định của liposome. Do
đặc tính về cấu trúc phân tử và độ tan, cholesterol lấp vào các khoang của
phospholipid kép làm tăng độ vững chắc cho màng liposome. Có thể phối hợp
cholesterol với phospholipid ở những tỉ lệ rất cao (100-200%). Tuy nhiên, trong thành
phần liposome, cholesterol thường chiếm tỷ lệ 20-30%. Tỉ lệ cholesterol cao quá cũng
có thể ảnh hưởng ngược lại đến sự vững chắc của màng [8].
Ngoài ra, trong liposome AMB, cholesterol có ái lực tốt với AMB nên tạo liên
kết với AMB góp phần đưa dược chất vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn
định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ dược chất và giúp liposome vận chuyển AMB tới đích
tác dụng. Chỉ khi nào tiếp xúc với sterol của tế bào nấm là ergosterol thì AMB trong
liposome mới được giải phóng do có ái lực cao hơn với sterol này [26],[28].
1.2.2.2. Dược chất
AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình tạo thành liposome bởi
sự hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với cholesterol trong thành
phần vỏ phospholipid.
1.2.3. Ưu nhược điểm
1.2.3.1. Ưu điểm
- Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học
như tính thấm, tính đẳng trương, đặc tính bề mặt, khả năng tương tác với các chất tan.
9



Do đó đây được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [30].
- Liposome có thể thay đổi hoàn toàn các đặc điểm dược động học của hoạt
chất, cải thiện sinh khả dụng của dược chất hơn hẳn so với việc dùng thuốc dạng tự
do phải qua các quá trình dược động học thông thường [2],[13].
- Cải thiện độ tan của thuốc: dựa vào đặc tính hai pha của liposome và sự đa
dạng trong thiết kế công thức, thành phần tá dược [38].
- Liposome có tác dụng bảo vệ và giải phóng một cách có kiểm soát các dược

chất: Khi dược chất được nang hóa trong liposome, cấu trúc đặc biệt của liposome
làm giảm lượng dược chất bị chuyển hóa khi qua gan và lượng lớn dược chất còn lại
vượt qua được các quá trình chuyển hóa này sẽ tạo hiệu quả tác dụng cao hơn [13],
[22], [35].
- Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết
bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng
liên kết với chol trên màng tế bào người làm giảm độc tính của thuốc. Chỉ khi thuốc
phân bố đến các tổ chức viêm nhiễm do ái lực của AMB với ergosterol cao hơn với
chol làm giải phóng AMB ra khỏi lớp màng lipid, hình thành phức hợp AMB -
ergosterol trên màng tế bào nấm và phát huy tác dụng của thuốc [28].
- Có thể dễ dàng thiết kế ra nhiều loại liposome có kích thước, thành phần
phospholipid và các đặc tính bề mặt khác nhau, do đó có thể phục vụ cho nhiều mục
đích khác nhau [19].
1.2.3.2. Nhược điểm
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng
rộng rãi do có một số nhược điểm sau:
- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí , hóa học và sinh
học [29]. Liposome là một hệ không đồng pha, luôn có khả năng kết tập của các tiểu
phân trong hệ dẫn đến sự không ổn định. Mặt khác nguyên liệu để làm lớp vỏ
liposome là các lipid rất dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, vi sinh của môi
trường [2],[13].
10



- Nguyên liệu đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, đắt tiền nên giá thành chế phẩm
cao [2],[13].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để
hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [36].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí

nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [29].
1.2.4. Độ ổn định
Một trong những lý do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng
loạt là vấn đề về độ ổn định của chế phẩm. Trong quá trình bảo quản, liposome không
bền cả về mặt vật lý và hóa học [8].
+ Về hóa học: sự ổn định hóa học của phospholipid được xem xét trên 2
phương diện là sự oxy hóa và sự thủy phân. Các quá trình này bị ảnh hưởng bởi pH,
nhiệt độ, nồng độ đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép… Sự oxy
hóa xảy ra mạnh nhất ở các phospholipid không no và cũng có thể xảy ra ở
phospholipid no nếu ở nhiệt độ cao. Bảo quản ở nhiệt độ thấp, bảo vệ tránh ánh sáng
và oxy môi trường được cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa. Ngoài ra, có thể cho
thêm các chất chống oxy hóa (α-tocoferol, BHA, BHT…), sử dụng EDTA tạo phức
loại trừ ion kim loại, dùng khí trơ như nitơ trong quá trình bào chế cũng làm giảm
đáng kể quá trình oxy hóa. Động học của quá trình thủy phân phospholipid chưa được
trình bày cụ thể [8],[23].
+ Về vật lý: sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số
PDI, sự tích điện bề mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự thẩm thấu của màng
phospholipid (hay chính là sự rò rỉ của dược chất qua màng). Nhìn chung, KTTP, chỉ
số PDI và sự tích điện bề mặt ít thay đổi ở các điều kiện bảo quản khác nhau. Tỉ lệ
cholesterol trong công thức ảnh hưởng đến tĩnh vững chắc của lớp màng kép và tính
thấm của lớp màng này. Cụ thê, bổ sung cholesterol vào công thức liposome làm cho
màng kép trở nên cứng chắc hơn, sự rò rỉ dược chất cũng giảm đi so với các công
thức không chứa cholesterol hoặc chứa lượng thấp cholesterol [23].
11



Ngoài ra, tính thấm của liposome phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại
phospholipid, hàm lượng và tính chất của dược chất cũng như điều kiện bảo quản [8].
Độ ổn định của liposome là mối quan tâm lớn cho việc lưu trữ lâu dài. Một số

thay đổi như thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kệt tụ có thể xảy
ra khi lưu trữ trong thời gian dài. Vì vậy, bào chế liposome ở dạng bột đông khô là
hướng đi mới để kéo dài tuổi thọ của chế phẩm [33].
1.3. Bào chế liposome
1.3.1. Bào chế liposome thô bằng phương pháp hydrat hóa film
Phương pháp này được Bangham đưa ra và phát triển từ năm 1965 và cho đến
nay vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để bào chế liposome vì tính tiện ích, dễ
thực hiện, không yêu cầu thiết bị công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến.
Phospholipid tạo vỏ và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung
môi hữu cơ thích hợp. Sau đó, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách
bốc hơi trong một bình đáy tròn để tạo một tấm film khô bao gồm các thành phần
lipid phức tạp và các thành phần khác. Hydrat hóa film đã tráng để tạp liposome.
Dung dịch được dùng để hydrat hóa tốt nhất là natri clorua, hoặc đường dextrose hoặc
lactose [26].
Liposome được tạo ra bởi phương pháp này có thể có KTTP lớn và không
đồng nhất. Để đạt được mục đích điều trị, việc đồng nhất và giảm KTTP liposome là
cần thiết.
1.3.2. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch [31].
Liposome được làm giảm KTTP bởi các tác dụng của lực cắt. Các phương
pháp được sử dụng để làm giảm kích thước của liposome là dùng siêu âm hoặc đồng
nhất, hoặc bằng cách đóng băng và tan băng, thẩm tách một dung dịch có chứa chất
12



tẩy rửa từ lipids, hoặc các phương pháp khác. Kích thước của các hạt liposome, cho

dù chúng là đơn lớp hoặc đa lớp, có thể được kiểm soát bằng cách sử dụng nhiều kỹ
thuật đã được biết đến, kể cả kiểm soát thời gian của siêu âm [26].
Sản phẩm thu được sau khi làm giảm kích thước tiểu phân phần lớn là
liposome nhỏ một lớp. Quá trình đồng nhất hóa sẽ làm hỏng một tỉ lệ nhất định
liposome gây rò rỉ, thất thoát một lượng khá lớn dược chất đã được liposome hóa
trước đó. Do đó cần phải xác định lại hàm lượng dược chất trong liposome sau khi
đồng nhất hóa [8].
Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân như đùn ép và siêu âm đóng vai
trò quan trọng trong kiểm soát các đặc tính của liposome, ví dụ như hình dạng, kích
thước, phân bố và sự tích điện bề mặt [24],[31].
Siêu âm
Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm nhỏ kích thước tiểu
phân của liposome. Các liposome có đường kính nhỏ hơn 100 nm có thể được bào
chế một cách dễ dàng nhờ siêu âm. Trong các thông số kỹ thuật thì tần số và năng
lượng là hai trong số các thông số quan trọng của siêu âm. Siêu âm tần số thấp có thể
làm giảm kích thước liposome nhanh hơn trong khoảng kích thước mong muốn. Thời
gian ngắn sử dụng năng lượng siêu âm mạnh có hiệu quả hơn so với thời gian dài sử
dụng năng lượng siêu âm yếu [32].
Với phương pháp siêu âm, liposome được làm nhỏ nhờ năng lượng của sóng
siêu âm, thu được các tiểu phân kích thước nhỏ và tương đối đồng nhất. Nhược điểm
của phương pháp: có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm và giải
phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, hiệu suất nạp thuốc giảm do
rò rỉ được chất trong quá trình siêu âm. So với phương pháp đùn ép, phương pháp
siêu âm tiến hành trong thời gian ngắn hơn nhưng không có sự đồng nhất giữa các lô
mẻ [18],[21],[34].
Đùn ép
Đùn ép là một biện pháp làm giảm KTTP, sử dụng áp lực vừa phải để đẩy các
liposome trong dung dịch qua các màng lọc polycarbonate tiêu chuẩn với kích thước
màng xác định [21].
13

Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch liposome được đùn
qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp đồng trục, kích thước xác định, ở áp suất
vừa phải, nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha T
c
của phospholipid và với số lần thích
hợp. Khi đó các tiểu phân có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ được làm nhỏ
khi đi qua qua màng, còn các tiểu phân kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích
thước khi qua màng, do đó thu được hỗn dịch liposome có kích thước đồng nhất
[18],[34].
Kỹ thuật đùn ép có nhiều ưu điểm: nó có thể được áp dụng cho nhiều loại lipid
và hỗn hợp, nhanh (thời gian đùn qua các màng khoảng 10 phút), chi phí thấp, có thể
đùn trực tiếp liposome đa lớp thành đơn lớp, và nó có thể tạo ra các liposome với
phạm vi kích thước từ 40 đến 150 nm [18],[21].
Đùn ép có 2 loại: đùn tuần tự bằng thiết bị cầm tay mini – extruder hoặc đùn
ép sử dụng áp suất cao.
a, Đùn tuần tự bằng thiết bị mini – extruder:
Đùn ép có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay
trang bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ
lọc 200 nm, dung dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với
kích thước lỗ lọc lớn hơn. Sau đó, quá trình đùn ép dùng áp lực cao có thể được sử
dụng để có thể đấy dung dịch qua màng lọc có đường kính 100 nm và nhỏ hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này bị giới hạn bởi áp lực mà xylanh và bộ lọc có thể
chịu được, như cũng như áp lực có thể đẩy được bằng tay. Cụ thể, với nồng độ
phospholipid dưới 20 mg/ml và kích thước lỗ lọc lớn hơn 200 nm thì có thể đẩy dễ
dàng bằng tay. Nhược điểm khác là khó đẩy qua màng có kích thước lỗ lọc nhỏ do
hạn chế về lực đẩy bằng tay cũng như khả năng chịu áp lực của thiết bị. Ngoài ra, thể
tích mẫu có thể bào chế bằng phương pháp này thường hạn chế do quy mô của bộ

dụng cụ nhỏ [21].
14




a, b,
Hình 1.4 Thiết bị đùn ép mini extruder (a) và thiết bị đùn ép dưới áp suất cao (b).
b, Đùn ép dưới áp suất cao.
Với thiết bị có quy mô lớn hơn, liposome có thể được nén qua màng với áp
suất cao hơn, sử dụng khí nén là Nitơ. Liposome sẽ bị “bóc tứng lớp một” cho đến
kích thước mong muốn. Khi bị nén qua lỗ lọc hình trụ, liposome có đường kính nhỏ
hơn lỗ lọc dễ dàng đi qua màng lọc. Liposome có kích thước lớn hơn đường kính lỗ
lọc, một số sẽ bị biến dạng để đi qua lỗ lọc và bị một số tác động của lực trượt sẽ bị
“bóc” lớp vỏ ngoài sau khi đi qua lỗ lọc.Tỉ lệ liposome nứt vỡ phụ thuộc vào bản chất
màng lipid, đường kính lỗ lọc, môi trường hydrat hóa và áp suất nén. Thường nén
tuần hoàn nhiều vòng cho đến lúc thu được liposome khoảng 50-100 nm [8].
1.3.3. Đông khô liposome
Liposome được sử dụng rộng rãi với vai trò là các hệ thống phân phối thuốc,
bởi vậy liposome phải đáp ứng được các tiêu chuẩn nghiêm ngặt về độ ổn định.
Nhưng liposome là một dạng thuốc kém ổn định về cả mặt vật lý và hòa học. Do đó,
việc thiết lập điều kiện bảo quản phù hợp để cải thiện thời hạn sử dụng của các
liposome là rất quan trọng. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng sự ổn định lâu dài
có thể đạt được bằng cách đóng băng cũng như đông khô liposome sử dụng các
carbohydrate khác nhau (lactose, sucrose, trehalose,…) hoặc alcol đa chức
(manniltiol, glycerol,…) [15].
Quá trình đông khô
Có thể chia quá trình đông khô thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp,
làm khô thứ cấp.
15

 Giai đoạn đông lạnh:
Là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô, ở giai đoạn này phần lớn nước
được tách ra khỏi dược chất và tá dược, hệ tách thành nhiều pha. Kết thúc giai đoạn
này sẽ tạo ra trạng thái kết tinh, vô định hình hoặc kết tinh kết hợp với vô định hình.
 Giai đoạn làm khô sơ cấp:
Kết quả của quá trình làm khô sơ cấp thể hiện ở độ dày của lớp băng giảm
xuố1ng còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên (hình 1.5).
Ghi chú: H.1.1a: Dung dịch cần đông khô chứa trong
lọ thủy tinh, “đậy hờ” nút cao su. H.1.1b: Dung dịch
đông lạnh chuyển sang trạng thái đá. H.1.1c: Giai
đoạn làm khô sơ cấp: nước bốc hơi từ đá. H.1.1d: giai
đoạn làm khô thứ cấp, hình thành khối bột xốp.
H.1.1e: đậy nắp cao su, kết thúc quá trình đông khô.
Hình 1.5: Sơ đồ quá trình đông khô
Nước đá tạo thành trong giai đoạn đông lạnh sẽ thăng hoa trực tiếp ở điều kiện
áp suất của buồng đông khô dưới áp suất hơi của nước đá và nhiệt độ của giá đỡ trong
khoảng từ – 30
0
C đến + 10
0
C.
 Giai đoạn làm khô thứ cấp:
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, lượng nước hấp phụ trong khối
bột sẽ được loại ra khỏi sản phẩm.
Mục tiêu của giai đoạn làm khô thứ cấp là giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối
ưu, thường dưới 1 đến 2 % để đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo
quản.

Một chế phẩm thuốc đông khô phân liều phải có các đặc tính: ở dạng bánh
thuốc, ổn định trong thời gian dài, thời gian hoà tan lại ngắn, duy trì được những đặc
tính gốc của dạng ban đầu (tính chất của dung dịch, cấu trúc của protein hay kích
thước tiểu phân của hỗn dịch) [7],[16].
Tuy nhiên, quá trình đông khô hay quá trình phân tán trở lại để tạo hỗn dịch
liposome đều gây những tác động có thể ảnh hưởng cấu trúc và tính nguyên vẹn của
16



lớp màng kép của liposome làm thay đổi các đặc tính như KTTP, tính đồng nhất của
hỗn dịch hay hiệu suất liposome hóa… Cụ thể, KTTP thường tăng đáng kể, có thể là
do sự phá vỡ liên kết hydro giữa các phân tử nước và các phân tử phospholipid. Để
hạn chế ảnh hưởng của các quá trình này đến cấu trúc của liposome, người ta thường
cho vào công thức đem đi đông khô các tá dược như glucose, lactose, sucrose,
mannitol, glycerol… Các tá dược này có 2 vai trò chính: vừa là tá dược giúp tạo
khung của bánh đông khô vừa có tác dụng bảo vệ cấu trúc liposome do tạo liên kết
với phospholipid thay thế nước. Kích thước của các hạt liposome có thể được bảo vệ
bằng cách thêm các đường trên với tỉ lệ phospholipid:carbohydrat ít nhất là 1:8, hay
dùng nhất là tỉ lệ 1:10 [15]. Quá nhiều các đường này có thể sẽ làm chậm quá trình
đông khô, gây nứt lọ trong quá trình đông khô và làm chậm thời gian phân tán lại tạo
hỗn dich liposome [5].
Các đường đôi như lactose, trelactose, sucrose được sử dụng rộng rãi hơn trong
đông khô. Các đường đơn là quá nhỏ để có thể ổn định liposome ở trạng thái khô.
Ngoài ra, mannitol hay glycerol còn được biết đến như những chất bảo vệ cấu trúc
thường được sử dụng trong đông khô, giúp duy trì sự đồng nhất của hỗn dịch. Cụ thể,
nếu sử dụng kết hợp một lượng nhỏ glycerol và carbohydrat có sự đồng nhất cao hơn
(PDI<0,15) so với các mẫu chỉ sử dụng carbohydrat (PDI<0,3) [15].
1.4. Một số nghiên cứu về liposome AMB
Profitt cùng cộng sự đã nghien cứu bào chế liposome AMB từ các tá dược

HSPC, DSPG, cholesterol bằng phương pháp hydrat hóa màng film: AMB phân tán
trong hỗn hợp dung môi methanol/chloroform được thêm vào dung dịch DSPG đã
acid hóa. HSPC và cholesterol được hòa tan vào hỗn hợp dung môi
methanol/chloroforom và được bổ sung vào dung dịch DSPG – AMB. Dung dịch thu
được bao gồm AMB và các thành phần tạo vỏ được mang đi phun sấy tạo thành dạng
bột phun sấy khô. Hydrat hóa bột phun sấy trên để thu được hỗn dịch liposome. Hỗn
dịch liposome được làm giảm KTTP bằng cách lọc qua bộ lọc có kích thước lỗ màng
0,22 nm. Nồng độ của AMB trong hỗn dịch thu được là 1,86 mg/ml, được xác định
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đường kính liposome trung