Định lương flavonoid toàn phần trong hạt cần tây bằng phương pháp đo quang

Định lương Aavonoid toàn phẩn trong
hạt cần tây bằng phương pháp đo quang
Nguyễn Thu Hằng\ Nguyễn Ngọc Cấu\
Hoàng Phương Thảo\ Phạm Thùy Linh^
^Trường Đại học Dược Hà Nội
^Trường Đại học YDược Thái Nguyên
SUMMARY
A spectrophotometric method was developed for the determination o f the totol flavonoid content o f celery seeds. It wos based
on complex formation between polyphenol and triethylơmine as photometric reaction. Apigenin was used as calibration standard.
For photometric measurement, a wavelength o f 380.5 nm was recommended. The method was validated showing good linearity
(A = 0.0338x C -ị- 0.0033, R^= 0.9998), repeatibility (RSD = 4.7%) and accuracy (9.8-101,9%). The total flavonoid content was found to
be 0.65% in dried materials. These results could be used for the standardization o f celery seeds in the future.
Từkhóa:Apium graveolens L , cân tây, đo quang, định lượng, fiovonoid toàn phần, hạt

Đặt vấn để
Cây cần tây có tên khoa học là Apium grơveolens L,
là loại cây rau án rất phổ biến trên thế giới và đã được
di thực vể trổng ở Việt Nam [4], [6 ]. Bên cạnh việc sử
dụng bộ phận trên mặt đất làm rau ăn, hạt cần tây
cũng được biết đến là một dược thảo ở một số quốc
gia để chữa các bệnh về khớp, bệnh gút an thần, lợi
tiểu [9] hạ huyết áp và chống viêm [8 ]. Gần đây, một
số tác dụng sinh học của hạt cẩn tây đã được chứng
minh bằng thực nghiệm khoa họQ trong đó đáng chú
ý là tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase là enzym
chìa khóa trong bệnh gút [2 ] tác dụng ức chế ngưng
tập tiểu cầu [3] và các tác dụng này có liên quan đến
thành phần flavonoid trong dược liệu [7], [11]. Do
đó, flavonoid là một trong các nhóm hoạt chất quan
trọng của hạt cẩn tây và việc xác định hàm lượng
flavonoid trong dược liệu này là cẩn thiết. Mục tiêu

của nghiên cứu: Xây dựng phương pháp định lượng
fiavonoid toàn phần trong hạt cẩn tây và tiến hành
định lượng flavonoid trong hạt cần tây để nâng cao
hiệu quả quản lý chất lượng và từng bước tiêu chuẩn
hóa dược liệu này.
Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên vật liệu
Mẫu cây cần tây có hoa được thu hái tại xã Hải
Nam, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định vào tháng 8 năm
2012, được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản, Bộ
môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu
tiêu bản là HNIP/17860/13 và đã được xác định tên
khoa học là Apium graveolens L, họ Cẩn (Apiaceae).

Hạt cần tây được thu hái vào tháng 1 1 năm 2012. Hạt
được phơi khô trong bóng râm, sau đó được bảo quản
trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát.
Hóa chất
+ Chất chuẩn apigenin (98,03%) cung cấp bởi
Shanghai Tauto Biotech.
+ Các hóa chất: Methanol, triethylamia ether dầu
hỏa đạt tiêu chuẩn phân tích.
Thiết bị
+ Cân phân tích MettlerToledo AB204-S9 (Thụy Sĩ)
độ chính xác 0,01 mg.
+ Cân phân tích Precisa (Thụy Sì) độ chính xác 0,1 mg.
+ Máy đo độ ẩm Precisa XM 60.
+ Bộ dụng cụ chiết Soxhlet.
+ Máy đo quang Hitachi U-1900 (Nhật Bản).
Phương pháp nghiên cứu

Flavonoid toàn phẩn trong hạt cẩn tây được định
lượng bằng phương pháp đo quang.
- Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan apigenin chuẩn
trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ
khoảng 15,3 ng/ml.
- Dung dịch thử: Càn chính xác khoảng 5 gam bột
dược liệu cho vào trong túi giấy lọc đã chuẩn bị sẵn,
tiến hành chiết soxhlet với 10 0 ml ether dầu hỏa đến
khi hết chất béo (thử bằng quan sát vết trên giấy lọc).
Lấy túi bã dược liệu ra, để bay hơi hết dung môi, chiết
tiếp soxhlet với 80 ml methanol đến kiệt flavonoid
(kiểm tra bằng cách lấy dịch chiết trong bình soxhlet
cho vào ống nghiệm, thêm bột Mg và vài giọt HCI
đặc không thấy xuất hiện màu hổng hoặc đỏ). Lấy
dịch chiết methanol cho vào bình định mức 10 0 ml,


bổ sung methanol vừa đủ tới vạch (dung dịch T^). Lấy
chính xác 1 ml dung dịch cho vào bình định mức 25
ml, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều (dung dịch T^).
- Phản ứng tạo màu: Nhóm -OH phenol trong
phân tử của các hợp chất flavonoid có thể phản
ứng với kiềm tạo thành các phenolat làm tăng
màu của dung dịch trong môi trường kiểm. Nghiên
cứu chọn phản ứng với dung dịch trlethylamin
1 % trong methanol với các thông số tham khảo
theo tài liệu [ 1 0 ] làm phản ứng tạo màu để định
lượng flavonoid toàn phần trong hạt cắn tây bằng
phương pháp đo quang.
- Thẩm định phương pháp

+ Xác định khoảng nồng độ tuyến tính: Khảo sát
trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên. Xác định
sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ
bằng phương trình hổi quy tuyến tính.
+ Độ đúng của phương pháp: Sử dụng phương
pháp thêm chuẩn, sau đó tính toán độ thu hổi.
+ Độ lặp lại của phương pháp: Phân tích một mẫu
6 lần song song. Xác định kết quả định lượng theo
phương trình đường chuẩn. Sau đó xác định độ lặp
iại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các
lần định lượng.
+ Tính toán kết quả: Từ độ hấp thụ của mẫu thử,
tính nồng độ flavonoid toàn phẩn trong dung dịch
thử (C) tương ứng theo phương trình hổi quy tuyến
tính.
Hàm lượng flavonoid toàn phẩn trong hạt cắn tây
được tính theo công thức:

• k: Hệ số pha loãng của dung dịch đo quang so
với dung dịchT^.
• H: Độ ẩm của mẫu thử hạt cần tây (%).
• m: Khối lượng hạt cắn tây đã cân để chuẩn bị
dung dịch thử(g).

Kết quả nghiên cứu
Khảo sát cực đại hấp thụ
Lấy chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc vào
bình định mức 10 ml, thêm 5 ml triethylamin ^%, bổ
sung methanol vừa đủ 10 ml. Tiến hành quét phổ từ
bước sóng 190 - 500 nm với mẫu trắng là dung dịch

trỉethylamin 0,5% trong methanol (v/v). Kết quả quét
phổ được trình bày ở hình 1 cho thấy dung dịch có 3
cực đại hấp thụ ở 380,5 nm; 275,0 nm và 231,5 nm.
Chọn bước sóng 380,5 nm làm bước sóng đo quang.
Thẩm định phương pháp
- Xác định khoảng tuyến tính
Lấy chính xác 1 ,2, 3,4, 5 ml dung dịch chuẩn gốc
cho vào lần lượt 5 bình định mức 10 ml rồi thực hiện
phản ứng tạo màu. Đo độ hấp thụ dãy dung dịch
chuẩn trên tại bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng là
dung dịch trỉethylamin 0,5% trong methanol (v/v). Đổ
thị biểu diễn mỗi tương quan tuyến tính giữa nồng
độ dãy dung dịch chuẩn và độ hấp thụ được trình bày
ở hình 2 .
Kết quả trên cho thấy trong khoảng nồng độ khảo
sát tại bước sóng 380,5 nm, độ hấp thụ và nồng độ
apigenin có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ với hệ
so xác định R2 = 0,998.
Cxk
Phương trình hổi quy tuyến tính:
% Flavonoid toàn phẩn = ---- — 7 7 7 ^^^^
mxio x ( l - / / )
A = 0,0338xC + 0,0033
Trong đó:
Trong đó:
•
C: Nồng độ flavonoid toàn phần dung dịch thử • A: Độ hấp thụ của dung dịch.
• C: Nồng độ dung dịch (|jg/ml).
tính được phương trình hổi quy (Mg/nnl).

0 .5 0 0

ABS

Ũ. 000
1 9 C 1 .0

1-------—....... r"""”'

3 4 5 .
Hình 1. Hình ỏnìi phổ opigenin chuấn có tợo phức với tríethỵlơmin


0.300
0250
0.200
0.150
0.100
0.050
0.000

Hình 2. Đổ thị biếu diễn sự phụ thuộc củơ độ hâp thụ vào nống độ opìgenin

Khảo sát độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng
phương pháp thêm chuẩn. Do trong quá trình chuẩn
bị dung dịch thử, Aavonoid đã được chiết kiệt nên yếu
tổ có ảnh hưởng chủ yếu đến độ đúng là phản ứng
tạo màu. Vì vậy, chất chuẩn được cho vào trước khi
làm phản ứng tạo màu với triethylamỉn.

Chuẩn bị 6 bình định mức 10 ml, đánh sổ từ 1 đến 6 .
+ Bình 1 : Cho chính xác 2 ml dung dịch thửT^
+ Bình 2 - 6 : Cho chính xác 2 ml dung dịch thửT^ và
lần lượt 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch chuẩn.
Thực hiện phản ứng tạo màu rồi đo độ hấp thụ
tại bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng là dung dịch
trỉethylamin 0,5% trong methanol (v/v).
Tính tỷ lệ tìm lại theo công thức:
^chuẩn tìm lại

^mẫu thử thêm chuẩn

^m ẳuthử

Tỷ lệ phần trăm chuẩn tìm lại (%) = -

mức 10 ml, thêm chính xác 5 ml trỉethylamin 1%, bổ
sung methanol vừa đủ 10 ml, lắc đểu. Đo độ hấp thụ
của mẫu thử ở bước sóng 380,5 nm với mẫu trắng là
dung dịch triethylamin 0,5% trong methanol (v/v).Từ
độ hấp thụ của dung dịch đo đưỢQ tính nồng độ c
của dung dịch phương trình hổi quỵ tuyến tính. Hàm
lượng flavonoid toàn phần trong hạt cẩn tây được
tính theo công thức (*) với hệ số pha loãng k = 62,5.
Tiến hành định lượng flavonoid toàn phán trong hạt
cẩn tây 6 lẩn ở cùng một điểu kiện.
Kết quả định lượng flavonoid toàn phẩn trong hạt
cán tây được trình bày ở bảng 2 .
Kết quả bảng 2 cho thấy phương pháp có độ
lặp lại chấp nhận được với RSD = 4,70%. Hàm lượng

flavonoid toàn phẩn trong hạt cẩn tây là 0,65% tính
theo apigenin trong dược liệu khô tuyệt đối.

" chuẩn tìm lại
^ chuẩn thêm vào

Bàn luận

Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học mạnh với nhiểu tác dụng quan trọng như
chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng virus,
Bỏng 1. Kết quả M o sớt độ đúng của phương pháp
chống ung thư, chống viêm, chống dị ứng, chống loét
^
chuẩn
thêm
vào
^diuẩn
tìm
lai
[7]. Gần đây, các hợp chất flavonoid còn được đặc
TT
%tìm lại
(Ha/mi)
(iio/mi)
biệt quan tâm bởi chúng ức chế hoạt tính của nhiều
0,77
0,76
1
99,39

enzym như cyclooxỵgenase, Ca^^-ATPase, xanthin
2
1,53
1,56
101,91
oxidase, acethyl Cholinesterase, phosphodiesterase,
3
2,30
2,27
98,88
lipooxygenase, aldose reductase và tyrosin kinase là
những enzym có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của
4
3,06
3,04
99,30
nhiểu loại bệnh tật [7]. Các nghiên cứu trước đây đã
5
3,83
3,78
98,77
cho thấy một số tác dụng sinh học của hạt cần tây có
% tìm lại = 99,65 %,RSD = 1,29%
Thống kê
liên quan đến thành phần flavonoid trong dược liệu
N h ậ n x é tĩù kết quả ở bảng 1 cho thấy phương [7], [1 1 ]. Do đó, hàm lượng flavonoid toàn phần trong
pháp định lượng có độ đúng cao với % chất chuẩn tìm hạt cán tây là chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá
lại từ 98,77 -101,91 %; RSD = 1,29%.
chất lượng dược liệu này.
Đo độ hấp thụ của mẫu thử và khảo sát độ lặp lợi Hàm lượng flavonoid toàn phẩn trong dược liệu

của phương pháp
thường được xác định bằng phương pháp đo quang
Lấy chính xác 4 ml dung dịch T2 cho vào bình định hoặc phương pháp cân [5]. Phương pháp cân thường
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp được
trình bày ở bảng 1 .

Sổ 4 /2014 1Nghiên cứu dượcThông tln thuỗc Ị1 3 7


Bỏng 2. Kẽt quở định lượng ílovonoid toàn phân trong hạt cân tây
Mẫu

Khối lương

Đô ẩm
(%)

Lẩnl

ĐỘMbtiIHI(A)
Lần 2
Lần 3

0,162

0,163

0,163

0,173

0,174

0,170

0,156

0,154

0,165

0,166

I

C(|ig/ml)

Hàm lượng flavonoid
toàn phần (%)

0,163

4,71

0,65

0,172

5,00

0,68

0,153

0,154

4,47

0,61

0,165

0,165

4,79

0,66

TB

1

(g)'
5,0597

2

5,0788

3

5,0770

4

5,0612

5

5,0683

0,154

0,155

0,155

0,155

4,48

0,61

6

5,0734

0,171

0,169

0,170

0,170

4,93

0,67

9,95

Giá trị trung bình X
Thống kê Độ lệch chuẩn s
Độ lệch chuẩn tương đối RSD

có sai số lớn hơn so với phương pháp đo quang do
khó có thể loại bỏ tuyệt đối tạp chất trong dịch chiết
dược liệu hoặc một phẩn flavonoid có thể bị hư hao
trong quá trình loại tạp. Do đó, trong nghiên cứu
này flavonoid toàn phẩn trong hạt cán tây được tiến
hành định lượng bằng phương pháp đo quang, thực
hiện phản ứng tạo màu với triethylamin, kết quả định
lượng được tính theo apigenin.
Dung môi được dùng để đo phổ UV-VIS có những
bước sóng giới hạn (Â ^ khác nhau mà dưới bước
sóng đó, dung môi hấp thụ đa phần các bức xạ chiếu
qua nó [1]. Kết quả quét phổ của apigenỉn tạo phức
với triethylamin cho thấy dung dịch có 3 cực đại hấp
thụ ở 380,5 nm, 275,0 nm và 231,5 nm. Vì vậy, để giảm
thiểu sai số do ảnh hưởng của dung môi, các chất

tham gia phản ứng cũng như dụng cụ đo, nghiên cứu
đã chọn bước sóng 380,5 nm để tiến hành đo quang.
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp xây
dựng có độ đúng cao (99,65%) và độ lặp lại chấp nhận

0,65
0,030
4,70%

được (RSD = 4,70%). Đây là phương pháp đơn giản, dễ
thực hiện, có độ tin cậy cao, ít tốn kém. Kết quả này là
cơ sở bước đẩu để xây dựng chỉ tiêu định lượng trong
tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây.
Kết luận
Flavonoid toàn phẩn trong hạt cẩn tây đã được
định lượng bằng phương pháp đo quang, sử dụng
phản ứng tạo màu với triethylamin. Kết quả định
lượng được tính toán theo apigenin. Phương pháp
định lượng này có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ
giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch chuẩn trong
khoảng khảo sát với
= 0,9998. Phương pháp có
độ lặp lại RSD = 4,70% và độ đúng cao với tỷ lệ chất
chuẩn thu hổi từ 98,77 -101,91% (RSD = 1,29%). Hàm
lượng flavonoid toàn phẩn trong hạt cẩn tây là 0,65%
tính theo apigenin trong dược liệu khô tuyệt đối.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

2.

Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr. 50.
Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thanh Tùng (2014), "Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của
cây cần tây {Apịum graveolens D", Tạp chí Dược học, (6), tr. 67-71.

3.

Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thị Hồng Vân (2013), "Nghiên cứu ảnh hưởng in vitro của dịch chiết hạt cần tây đối với sự ngưng tập tiểu
cẩu và quá trình đông máu'; Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc, 1 (5), tr. 25-28.

4.

Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 314-315.

5.

Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu họQĨập I, NXB Y học, Hà Nội, tr. 378-379.

6.

Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật,Hà Nội,

7.

tr. 566-568.

Agrawal AD (2011), "Pharmacological activities of flavonoids: a review" International Journal of Pharmaceutical Sciences and
Nanotechnology, 4 (2), pp. 1394-1398.
8.

Asif HM, Akram M, Usmanghani KH, Akhtar Naveed et al. (2011), "Monograph of Apium graveolens Linn'; J Medicin Plan Res, 5, pp.
1494-1496.
9. Barnes Joanne, Anderson Linda A, Phillipson J David (2007), Herbal Medicines, Third edition, Pharmaceutical Press, London, UK, pp.
145-148.
10. Chinese Pharmacopoeia Commision (2010), "Pharmacopoeia of the People's Republic of China" People's Medical Publishing House,
Volum I, pp. 46.
11. Lin Chun-Mao, Chen Chien-Shu, Chen Chien-Tsu, Liang Yu-Chih et al. (2002),"Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine
oxidase" Biochemical and Biophysical Research Communications, 294 (1), pp. 167-172.

13 8 Nghiên cứu duợcThông tin thuöc Số 4/2014