Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cây đậu khấu chín cánh {amomum maximumroxb , zingiberaceae)

Góp phần nghiên cứu thành phần hóa
học cây Đậu khấu chín cánh {Amomum
maximum Roxb., Zingiberaceae)
Phan Minh Giang', Nguyễn Hoàng Duyên’, Đỗ Ngọc Cương^ Phan Tống Sơn'

'TrườngĐại tìọcKhoahọc Tựnhiên, Đợi học Quốc gia Hà Nội,
^Trường Đại học Dược Hờ Nội
SUMMARY
Chromatographic isolation afforded two sterols, p-sitosterol and 6p-hydroxystigmast-4-en-3-one, as the main constituents of the
methanol extract of the rhizomes ofAmomum maximum Roxb. (Zingiberaceae). Their chemical structures were determined by means
of spectroscopic methods. GC-MS analysis revealed the presence of monoterpenoids in the hydrodistilled essential oil of A. maximum.
Từ khóa: cây Đậu khấu chín cánh; Zingiberaceae; monoterpenoid; steroid; 6P-hyclroxystigmast-4-en-3-on.

Đặt vấn đề

Amomum là một chi lớn của họ thực vật
Zingiberaceae mọc chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông
Nam và Nam Á. Một số loài Amomum được ghi chép
là các cây thuốc truyền thống của Việt Nam như Thảo
quả (A. tsao-ko), Đậu khấu (A. cardamomum), Dương
xuân sa {A. villosum) và Sa nhân (A. xanthioìdes) [2],
Nhiểu nghiên cứu hóa học các loài Amomum được
thực hiện với các tinh dắu [2 ] nhưng một số nghiên
cứu phân lập cho các cấu trúc lý thú như các nonan
hai vòng từ A. tsơo-ko [5], dioxa-dispiroketal từ A.
aculeatum [4] và eicosenon từ/A. koenigii [3]. Nghiên
cứu hóa học các loài Amomum của Việt Nam còn
hạn chế; các nghiên cứu gán đây vể A. muricarpum
cho các diarylheptanoid mới [6, 7], Cây/A. maximum
Roxb. chưa được nghiên cứu về các thành phán hóa
học. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu

xác định thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định của các phần chiết từ
thân rễ cây Đậu khấu chín cách A. maximum.
Nguyên vật liệu, phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu
Thân rễ cây Amomum maximum Roxb.
(Zingiberaceae) được TS. Nguyễn Quốc Bình, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, thu thập và giám định
vào tháng 3 năm 2006 tại Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc.
Hóa chất
Cácdungm ôisửdụnglàn-hexan,diclorom ethan
(CH^CI^) và ethỵl acetat (EtOAc) dùng cho sắc ký (Hàn

Quốc) và methanol (MeOH) đều được làm khan và
chưng cất lại trước khi sử dụng. Silica gel (Merck,
Darmstadt, Đức) với cỡ hạt 63-200 |am. Thuốc thử
hiện màu là dung dịch vanilin trong HjSO^ đặc 1 %.
Phương pháp nghiên cứu
Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên thiết bị Nicolet
Impact 410 FT-IR spectrophotometer.
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được
ghi trên thiết bị Hewlett Packard HP-5890 Series II
spectrometer.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ('H-NMR)
và carbon-13 C^C-NMR) với chương trình DEPT được
ghi trên thiết bị Brucker Avance 500 spectrometer.
Độ chuyển dịch hoá học (ổ) được đo theo ppm.
Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (ỗ =

0,00) ppm.
Sác ký khí-khối phổ liên hợp (GC-MS) được đo
trên thiết bị Hewlett Packard 19091 s-433, cột HP5 -MS (dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp
phim dày 0,25 (xm) liên hợp với MSD HP 6890 với
chế độ chạy: chương trình nhiệt độ 60 - 260°c, 5°c/
phút, nhiệt độ detector 280°c, nhiệt độ buồng tiêm
250°c, khí mang: He.
Điểm nóng chảy được đo trên thiết bị Boetius.
Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện trên silica
gel.
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn silica gel có chiểu dày 0,2 mm trên
nền nhôm Merck 60
Thuốc thử hiện màu là
dung dịch vanilin trong H so đặc 1%.


ề.
Phương pháp GC-MS
Để xác định thêm các chất dễ bay hơi tinh dầu
thân rễ tươi cây Đậu khấu chín cánh được điểu chế
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
Tinh dầu này được phân tích bằng phương pháp
GC-MS. Các thành phẩn của tinh dầu được nhận biết
bằng cách so sánh với thư viện phổ Wiley GC-MS.
Thửhoợt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm 8 vi
sinh vật thuộc 4 nhóm:
Hai chủng vi khuẩn gram âm: Escherichia coli
ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923

Hai chủng vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilis
ATCC 272M,Staphylococus oureus ATCC 12222
Hai chủng mốc: Aspergillus niger 439, Fusarium
oxysporum M42
Hai chủng nấm men: Candida albicans ATCC
7754, Saccharomyces cerevisioe SH 20.
Các chất kháng sinh kiểm định bao gồm
ampicilin (50 mM), tetracylin (10 mM) và nystatin
(0,04 mM) được pha trong DMSO. Đối chứng âm là
vi sinh vật không trộn với thuốc kháng sinh và chất
thử.
Bước 1: Thử theo phương pháp khuyếch tán
trong môi trường đặc (thạch). Hoà tan các phẩn
chiết vào dung môi thích hợp với nồng độ 20 mg/
ml. Tẩm toàn bộ dung dịch thu được lên khoanh
giấy lọc có đường kính 7 mm. Để bay hơi hết dung
môi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm rổi đặt các khoang
giấy lọc trên mặt đĩa thạch dinh dưỡng đã trộn với
nhũ dịch vi sinh. Các đĩa petri (đĩa thạch) trên được
giữ ở 37°c trong vòng 24 giờ. Sau đó lấy các đĩa ra và
đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng cách xác
định đường kính vùng ức chế sự phát triển của vỉ
sinh vật (vòng vô khuẩn). Các mẫu thử có tác dụng
dương tính ở bước 1 được tiến hành thử theo bước
2.
Bước 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
trên bản nhọn 96 giếng. Các vi nấm và vi khuẩn được
duy trì trong môi trường dinh dưỡng Trypcase soya
broth (TSB) cho vi khuẩn và Sabouraud dextrose
broth (SDB) cho vi nấm. Các chủng kiểm định được

hoạt hóa trước khi thử nghiệm trong môi trường
dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn và 48
giờ đối với vi nấm). Vi sinh vật kiểm định sau khỉ hoạt
hoá được hoà loãng bằng môi trường dinh dưỡng
có nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 10^ vi sinh
vật/ml) rổi ủ trong tủ ấm 37°c trong 24 giờ cho vi
khuẩn và 30°c trong 48 giờ cho vỉ nấm. Mẩu thử đã
có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được hoà tan
hoàn toàn trong dung dịch DMSO 100 được pha

loãng theo các thang nồng độ thấp dẩn, từ 5-10
thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà
ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gắn như hoàn
toàn. Các giá trị MIC của đối chứng: ampicilin 21,83
ỊLig/ml, tetracylin 6,87 Ịig/m l và nystatin 1,44 |Lig/nnl

với nấm men và 2,89

|Lig/ml

với nấm mốc.

K ết q u ả n g h iê n cứu

Thân rễ tươi cây đậu khấu chín cánh được thái lát
mỏng, hong khô ở nhiệt độ phòng, sau đó được sấy
khô ở 40 - 50°c rổi xay thành bột mịn. Bột khô (3 kg)
được chiết với methanol (cho methanol ngập phán
bột) trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày lọc
lấy dịch methanol, bã còn lại được ngâm chiết tiếp

trong methanol. Lặp lại quá trình ngâm chiết mẫu 5
lẩn. Các dịch lọc methanol được gộp lại, sau đó được
cất loại bớt methanol dưới áp suất giảm còn 1/10
thể tích. Pha thêm nước cất vào dịch methanol thu
được và chiết với n-hexan, dicloromethan và ethyl
acetat. Làm khan các dịch chiết bằng Na^so^ và cất
loại kiệt dung môi cho các phần chiết n-hexan (5,0
gam), dicloromethan (3 gam) và ethyl acetat (2,4
gam). 5 gam phần chiết n-hexan được phân tách
bằng sắc ký cột c c trên silica gel với hệ dung môi
gradient n-hexan/EtOAc cho 135 phân đoạn (20 ml/
phân đoạn), được gộp lại thành 11 nhóm phân đoạn
theo TLC. Kết tinh các phân đoạn 7 và 11 trong hệ
dung môi chạy cột cho ß-sitosterol ( 1 ) (10 mg) và
6/3-hydroxystignnast-4-en-3-on (2) (5 mg).
j3-sitosterol (1): Tinh thể hình kim màu trắng,
điểm nóng chảy 141-142°c,
= 0,34 (n-hexan/
EtOAc 5:1, v/v), hiện màu tím với thuốc hiện vanilin/
H^SO^ đặc 1%. IR (KBr): V cm-^ 3427, 1657, 1462,
1376J 053.
6/3-hydroxystigmast-4-en-3-on

(2):

Bột

vô

định hình màu trắng. R^= 0,21 (n-hexan/EtOAc 5:1,

v/v), hiện màu tím với thuốc hiện vanilin/H^SO^ đặc
1%. IR (KBr): V cm-' 3404, 1673, 1465, 1377, 1231,
1197, 1042. Er-MS: m/z 428
M^-). ^H-NMR
(500 MHz, CDCI3): ỗ (ppm) 0,74 (3H, s, H3- I 8), 0,82
(3H,Ố J = 7,0 Hz, H3-26 ) ,0,84(3H,d j= 7 ,0 Hz, H3-27 ),
0,85 (3H, t j = 7,5 Hz, H3-29), 0,90 ( 1 H, m, H-9), 0,92
(3H, d j = 6,5 Hz, H3-2 I ), 0,95 (1H, m, H-24), 1,02 (1H,
m, H-22a), 1,03 (1H, m, H-17), 1,16(1 H, m, H-14), u 7
(3H, m, H-15a, 2H-23)' 1,18 ( 1 H, m, H-12a), 1,24 ( 1 H,
m, H-7a), 1,25 (2H, m, 2H-28), 1,30 (1H, m, H-16a),
13 3 (1H, m, H-22b), 13 8 (1H, m' H-20), 1,38 (3H, s'
H3- 1 9), 1,52 (2H, m, 2H-11), 1,62 (1H, m, H-12b), 1,66
(1H, m, H-25), 1,70 (1H, m, H-1 a), 1,88 (1H, m, H-16b),
1,93 (IH , dd, J = u , 5 Hz, 3,0 Hz, H-8), 2,02 (IH , m’
H-7b), 2,04 ( 1 H, m, H-1b), 2,05 (IH , m, H-12b), 2,37
( 1 H, d t J = 17,0 Hz, 3,0 Hz' H-2a), 2,51 (IH , ddd, J


= 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (IH , dd, J =
2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4). '^C-NMR (125
MHz, CDCI3): ổ (ppm) 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29),
18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q,
C-19), 20,9 (t, C-1 1 ), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1
(t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8),
33.9 (t, C-22 ), 34,3 (t, C-2 ), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1 ),
38,0 (s, C-1 0), 38,6 (t, C-7), 39,6 (t, C-1 2 ), 42,5 (s, C-13),
45.9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d, C-17), 56,1 (d,
C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,5
(s,C-3).

Trong thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật
của các phẩn chiết theo phương pháp được mô
tả bởi Vanden Berghe và Vlietinck [8] chỉ có phẩn
chiết ethyl acetat cho hoạt tính kháng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa (100 (ag/ml) và 2 chủng vi
nấm Candidơ albicans (200 |jg/ml) và Saccharomyces
cerevisiae (100 (xg/ml); các phẩn chiết khác không
thể hiện hoạt tính mạnh.
Kết quả phân tích GC-MS cho thấy tinh dầu
thân rễ tươi cây Đậu khấu chín cánh có chứa các
monoterpenoid với a-pinen (5,1%) và j8-pinen
(10,8%) là các thành phẩn chính (Bảng 1).

Bàn luận

Chất 1 được nhận dạng là j8-sitosterol bằng
phương pháp co-TLC và so sánh với phổ IR của mẫu
chuẩn jß-sitosterol. Phổ IR của 1 cho các đỉnh hấp
thụ ở V
3427 cm“' (nhóm OH), 1657 cm ' (liên
kết C=C), 1462 cm“' (nhóm methylen), 1376 cm“'
(nhóm methyl), và 1053 cm“' (liên kết C -0). Phân tích
TLC cho thấy jß-sitosterol chiếm chủ yếu phán chiết
n-hexan và có từ nhóm phân đoạn 4 đến 10.
Phổ IR của chất 2 cho các đỉnh hấp thụ ở V 3404
em ' (nhóm OH) và 1673 cm"' (nhóm cacbonyl a, ß
không no). Phổ EI-MS của 2 cho pic ion phân tử ở
m/z 428. Phổ ’^C-NMR và DEPT cho các tín hiệu của 6
nhóm methyl (6 q), 10 nhóm methylen (101), 9 nhóm
metin (9 d) và 4 carbon (4 s). Trong số các tín hiệu

carbon-13 có các tín hiệu của một nhóm carbonyl
a, ß không no [ổ^ 200,5 (s), 168,6 (s) và 126,3 (d)] và
một nhóm oxymetin [ỗ^ 73,3 (d)]. Các tín hiệu này
phù hợp với các tín hiệu proton ở
5,81 (1H, s) và
4,35 ( 1 H, dd, J - 2,5 Hz, 2,0 Hz). Sáu tín hiệu nhóm
methyl xuất hiện trên phổ 'H-NMR của 2 ở 0,74 (s),
0,82 (d), 0,84 (d), 0,85 (d), 0,92 (d) và 1,38 (s). Từ các
dữ kiện phổ EI-MS, ’H-NMR, '^C-NMR và DEPT, công

Báng l Phân tích 6C-MS thành phân monoterpenoid và atíd béo của tình dâu thân rễ tươi
SIT

Thời gian lưu (phút)

Hợp chất

Hàm lượng (%)“’

1

7,84

a-pinen

5,1

2

9,14

ß-pinen

10,8

3

10,54

p-cymen

3,3

4

10,82

1,8-cineol

1,3

5

15,36

1,4-terpineol

2,9

6

15,78

a-terpinyl axetat

2,6

% TICtrên cột 6C m o quỏn HP-5


thức phân tử của 2 được giả thiết là C^gH^gO^ và cấu
trúc khung stigmastan đã được xác định. Từ giả thiết
này, sự so sánh tiếp theo các tín hiệu cộng hưởng
carbon-13 của 2 với của ]8-sitosterol đã cho thấy khả
năng liên kết của một nhóm hydroxy vào C-6 và sự
định vị của nhóm carbonyl a, /3 không no là 4-en-3on. Điều này hoàn toàn phù hợp với các giá trị ỗ và
J của H-2 [ổ^ 237 (1H, d t J = 17,0 Hz, 3,0 Hz) và 2,51
(1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz)] và H-6 (ỗ^ 4,35).
Hằng số tương tác của H-6 (dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz) cho
thấy H-6 định hướng a, do đó nhóm hydroxy phải
được định hướng p. Hóa lập thể ở các tâm lập thể
còn lại được xác định là tương tự của p-sitosterol dựa
trên sự so sánh các giá trị độ chuyển dịch carbon-13.
Trên cơ sở các phân tích phổ, cấu trúc của 2 được xác
định là 6j8-hydroxystigmast-4-erì-3-on [ 1 ]. Các tương
tác quan sát được trên các phổ ^H-^H c o s x HSQC va
HMBC (Hình 1) đã khẳng định cho cấu trúc này.

Kết luận

Để nghiên cứu thành phần hóa học của thân
rễ cây Đậu khấu chín cánh các phương pháp phân
tích GC-MS kết hợp với phân tách sắc ký và xác
định cấu trúc bằng các phương pháp phổ (IR, MS,
1D và 2D NMR) đã được sử dụng. GC-MS đã xác
định được các thành phần monoterpenoid chính a
-pinen và Ị3-pinen trong tinh dầu thân rễ tươi. Sắc ký
cột trên silica gel đã phân lập và được /3-sitosterol
và 6j8-hỵdroxystigmast-4-en-3-on. Đây là lẩn đầu
tiên các chất này được thông báo từ Amomum
moximum. /3-sitosterol chiếm chủ yếu phẩn chiết
n-hexan. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định của các phần chiết cho thấy chỉ có phần chiết
ethỵl acetat có hoạt tính kháng khuẩn Pseudomonơs
oeruginosa và kháng nấm Cơndida albicans và
Soccharomyces cerevìsioe.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Arai Y, Nakagawa T., Hitosugi M., Shiojima K., Ageta H., Basher o. (1998), "Chemical constituents of aquatic fern Azolla nilotico",
Phytochemistry, 48,471-474.

2.

ĐỖ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

3.

Dong H., Gou Y.L, Cao S.G., Chen S.X., Sim K.Y., Goh S.H., Kini R.M. (1999), "Eicosenones and methylated flavonols from Amomum

koenigii", Phytochemistry, 50,899-902.

4.

Heilmann J., Brun R., Mayr s., Rali T., Sticher 0. (2001), "Minor cytotoxic and antibacterial compounds from the rhizomes of Amomum
aculeatum", Phytochemistry, 57,1281 -1285.

5.

Moon S.S., Lee J.Y., Cho s.c. (2004), "Isotsaokonin, an antifungal agent from Amomum tsơo-ko", 1 Not. Prod, 67,889-891.

6.

Phan M.G., Phan T.S., Matsunami K., Otsuka H. (2006), "New diarylheptanoids from Amomum muricarpum Elmer", Chem. Pharm. Bull.,
54,139-140.

7.

Phan M.G., Phan T.S., Matsunami K., Otsuka H. (2012),"One new and several minor diarylheptanoids from Amomum muricarpum" Nat
Prod. Res., 26,1195-1200.

8.

Vanden Berghe D.A., Vlietinck AJ. (1991), Methods in Plant Biochemistry, 6,47-69, Academic Press, London.

SỐ 3/2014: Nghiên CÚU duợcĩhông tin thuốc 1 0 5