Xác định hàm lượng allantoin trong củ mài {dioscorea persimilis dioscoreaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xác định hàm lượng allantoin
trong củ mài {Dioscorea persÊmìlis
Dioscoreaceae) bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao
Trần Thị Oanh\ Nguyễn Thị Vân Anh^
Kục Khoa học công nghệ &Đào tạo - Bộ Y tế, Kònq ty cổphân Traphoco

SUMMARY
A simple and reliable HPLC with u v detection was reported for the determination of allantoin in (Dioscorea persimilis
Dioscoreơceae). The chrom atographic separation was achieved by using a cyano column (150 X 4.6mm, Sjjm ) at 25°c Effluent was
monitored Ơt215nm using a mixture ofmethanol-water (2:98) ƠS the mobile phase at Ũ flow rate of 0.2 ml/min. The total run time was
less than 15 min. The content ofollontoin in 15 real samples ranged from 1.21 to 6.18 mg/g dry weight
Từkhoá:Allantoin, Củ mài, HPLC, cộtcyano.

Đ ặt vấn đề

Củ mài còn gọi là Hoài sơn có tên khoa học là
Dioscorea persimilis (Dioscoreaceae), được dùng rộng
rãi làm thức ăn cũng như thuốc chữa bệnh. Chuyên
luận "Củ mài" trong Dược điển Việt Nam IV quy định
bộ phận dùng là rễ củ với tiêu chuẩn chất lượng yêu
cầu các chỉ tiêu kiểm nghiệm là mô tả, bột, định tính
(dựa vào soi huỳnh quang bột dược liệu, sắc ký lớp
mỏng với chuẩn là dược liệu Củ mài chuẩn), tạp chất,
độ ẩm [ 1 ], Đã có một số nghiên cứu chỉ ra rằng, dược
liệu trong chi Dioscorea có chứa một lượng lớn chất
có hoạt tính sinh học là allantoin - một dẫn chất purin
[6], Allantoin có khả năng làm lành vết thương, bảo vệ,
làm mềm da và chống viêm, chống gây độc tế bào,...
[7]. Có nhiểu nghiên cứu định lượng allantoin trong
dịch sinh học được công bố như HPLC dẫn chất hóa

trước cột với thuốc thử 2,4-dinitrophenylhydrazin và
phát hiện ở bước sóng 360 nm [3], LC-MS/MS [2], GCMS [4], và điện di mao quản [9]. Trong đó, định lượng
allantoin trong dược liệu chủ yếu được thực hiện
bằng phương pháp HPLC (trực tiếp) với detector u v
[5-8] và điện di mao quản [9].
Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng được
phương pháp định lượng allantoin trong Củ mài và
ứng dụng xác định hàm lượng allantoin trong một
số mẫu Củ mài thu hái trong tự nhiên và trổng ở các
địa điểm khác nhau tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam
bằng HPLC với detector uv.

82 Nghỉén cứu duợcThõng tin thuõc Số3/2014

Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Mơu thử
15 mẫu Củ mài được thu hái trong tự nhiên ở các
tỉnh khác nhau và trổng tại các vùng trổng dược liệu
của Công ty cổ phẩn Traphaco, được chế biến theo
phương pháp của Dược điển Việt Nam IV, xay thành
bột nửa thô, đóng gói trong 2 lẩn túi polyetthylen,
bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Hóa chất, chất chuẩn
Chất chuẩn: Allantoin hàm lượng 98,0% Lot: BCBG
2959, của Fluka (Đức).
Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho HPLC
hoặc PA (Merck - Đức).
Thiết bị
Hệ thổng HPLC - detector uv - DAD Agilent

Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mểm
Aligent Chemstation version B.
Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01
mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc
xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius
sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo Nhật; Nổi cách thủy
WiseCircu',Tây Ban Nha.
Các dụng cụ thủy tinh chính xác.
Phương pháp nghiên cứu
Điểu kiện sâc ký:
Cột: Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5 um), nhiệt độ
Cột25°c.
Pha động: Methanol - nước (2:98).


Kết quả cho thấy cột Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5
ịjm) cho pic allantoin cân đối, tách khỏi đường nền rõ
ràng, thời gian phân tích ngắn nên cột này được lựa
chọn dùng trong nghiên cứu.
Thực hiện sắc ký allantoin VỚI các hệ pha động
gồm: 1) dung dịch đệm phosphat 20 mM, pH 3,0; 2)
methanol - nước với tỷ lệ thay đổi, của methanol 0 10% (AC = 2%), nước từ 100 - 90%, lưu lượng dòng 1
ml/ phút hoặc chế độ gradient lưu lượng dòng. Kết
quả cho thấy, khi sử dụng pha động là dung dịch
đệm phosphat 20 mM, pH 3,0 pic của allatoin không
ổn định; còn với hệ pha động 2, khi tăng tỷ lệ dung
môi hữu cơ thì thời gian rửa giải của allantoin giảm,
nhưng vẫn chưa đạt độ phân giải đường nền, nếu tỷ
lệ nước 100% thời gian phân tích quá dài. Do đó, việc
kết hợp giữa hệ pha động chứa tỷ lệ lớn là nước (98%)

và lưu lượng dòng pha động thấp (0,2 ml/phút) giúp
cho quá trình tách allantoin ra khỏi nền mẫu được dễ
dàng với thời gian phân tích hợp lý.
Bước sóng phát hiện được lựa chọn là bước sóng
cực đại hấp thụ khỉ quét phổ hấp thụ của pic allantoin
trong sắc ký đổ dung dịch chuẩn.
Từ kết quả khảo sát bằng thực nghiệm, chúng tôi
lựa chọn điểu kiện sắc ký để định lượng allantoin như
trình bày ở phẩn phương pháp nghiên cứu.
Xử lý mâu
Xử lý mẫu dược liệu Củ mài để thu được dung dịch
dùng cho tiêm HPLC được tiến hành tương tự như
p =— —
—
nghiên cứu của Kee Dong Yoon et al. (2008). Sau khỉ
m X (1 - R % ) X 5
tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm với thời gian
Trong đó:
chiết thể tích và nổng độ dung môi chiết (ethanol từ
m: khối lượng dược liệu (g)
70 - 100%), thời gian để lạnh để lựa chọn quỵ trình
R: độ ẩm của dược liệu (%)
xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao nhất, loại được tạp
C: nồng độ (|jg/nnl) allantoin trong dung dịch thử nhiều nhất với thời gian xử lý ngắn. Từ kết quả thu
(dung dịch tiêm sắc ký)
được quy trình xử lý mẫu lựa chọn được trình bày ở
Nồng độ allantoin trong dung dịch thử được tính phẩn phương pháp nghiên cứu (Dung dịch thử).
dựa vào phương trình hổi quy được thiết lập trong
Đánh giá phương pháp
cùng ngày phân tích trong khoảng nổng độ allantoln

Nghiên cứu này được tiến hành theo phương
từ 12,5 -100 |ag/ml, với hệ số tương quan r > 0,999.
pháp được Kee Dong Yoon et al. (2008) xây dựng, với
một vài thay đổi nhỏ. Do đó, chúng tôi không tiến
Kết quả nghiên cứu
hành thẩm định toàn bộ các tiêu chí yêu cầu đối với
Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích
xây dựng một quy trình mới, mà chỉ thực hiện thẩm
định một số tiêu chí nhằm đánh giá giá trị sửdụng của
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sác ký
Dựa vào các kết quả nghiên cứu định lượng phương pháp, bao gồm tính chọn lọQ khoảng nồng
allantoin bằng HPLC đã công bố [5, 6, 8], tiến hành độ tuyến tính (sử dụng để tính kết quả định lượng
khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp và trong mẫu thực), độ chính xác
Tính chọn lọc
khả thi.
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng (cô cách
- Tiến hành khảo sát trên cột sắc ký nhồi pha tĩnh
octadecyl (C18), cyano (-CN) của các hãng khác nhau, thủy tới cắn 5 ml ethanol 95%, hòa cắn trong vừa đủ 5
bao gồm Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm, 5 ịiiTi), Hypersil ml nước, lọc qua màng lọc 0,22 |am), dung dịch chuẩn
C18 BDS (250 X 4,6 mm, 5 laỉTì), Zorbax Eclip C18 (150 X allantoin, dung dịch thử từ 1 mẫu dược liệu Củ mài
3,9 mm, 3,5 |im) và Zorbax CN SB (150 X 4,6 mm, 5 |jm). (CM1 ). Kết quả được trình bày ở hình 1 .
Detector: u v 215 nm.
Thể tích tiêm mẫu:5 |il.
Tốc độ dòng: 0,2 ml/ phút
Chuẩn bị các dung dịch:
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một lượng
chất chuẩn tương đương khoảng 25 mg allantoin cho
vào bình định mức 50 ml, hòa tan trong vừa đủ thể
tích bằng nước
Dung dịch chuẩn làm việc Pha loãng chính xác

một thể tích dung dịch chuẩn trong nước để được dãy
dung dịch chuẩn có nồng độ allantoin là 12,5 - 25 - 50
-75-100 |jg/ml.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 2,0 g bột
dược liệu (có độ ẩm R %), cho vào bình nón, thêm
khoảng 5 ml nưỚQ lắc nhẹ tạo thành hỗn dịch. Thêm
50 ml ethanol 95%, đậy bằng giấy nhôm. Siêu âm
trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Bảo quản ở 4°c qua
đêm (15 giờ). Lọc qua giấy lọc băng xanh. Rửa bình
nón và giấy lọc 3 lần mỗi lần với 5 ml ethanol 95%.
Tập trung dịch rửa và dịch lọQ cô cách thủy ở khoảng
60°c tới cắn. Hòa tan cắn trong chính xác 10 ml nước
(siêu âm 15 phút). Ly tâm dung dịch thu được ở 4 °c
tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 1,00 ml
dịch trong, cho vào bình định mức 20 ml, thêm nước
vừa đủ. Lắc đểu. Lọc qua màng 0,22 |jm.
Hàm lượng Allantoin p (mg/g) trong dược liệu tính
theo dược liệu khô được tính theo công thức:


ĩĩlAU
25

9 .5 9 3

Aíỉantoỉn

20
15

10
5
8

(a)

10

12

14 m in

(b)

mAU
25

20
15

9 .5 9 5

Allantoin

10

5

0
10

12

14 m in

(c)
tỉinh l Sâc ký đổ các mẫu: ũ. mẫu trâng; b. ũllQíìĩoin chuổn; c Củ mòi (CM1)
Kết quả ở hình 1 cho thấy thời gian lưu của pic trên sắc đổ dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu pic
allantion của dung dịch mẫu chuẩn (9,59 phút) và trên sắc ký đổ mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng
8-11 phút. Như vậy phương pháp có tính chọn lọc cao.
Tính thích hợp của hệ thống được xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời
gian lưu của allantoin khi sắc ký 6 lán liên tiếp dung dịch chuẩn allantoin nồng độ 50 |ig/ml. Kết quả cho thấy
RSD của diện tích pic và thời gian lưu của pic allantoin lẩn lượt là 1,38% và 1,06% (n = 6) đều thấp hơn 2,0%, do
đó hệ thống sắc ký là phù hợp để định lượng allantoin.
Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp được xác định dựa trên mối tương quan hổi quy giữa nồng
độ allantoin và diện tích pic của allantoln trong khoảng nồng độ khảo sát 12,5 -100 |jg/ml. Kết quả được trình
bày ở bảng sau:
Bỏng 2. Kết quở khỏo sát khoáng nông độ tuyến tính
Nỗng độ allantoin (ng/ml)

12,5

25

50

75

100

Diện tích pic (mAU. giây)

63,8

124,3

263,1

391,1

517,7

Phương trình hổi quy; y = 5,222 X -2,1524
Hệ số tương quan: r = 0,9998

Độ chính xác của phương pháp được đánh giá dựa vào sự phân tán số liệu (RSD) khi tiến hành phân tích 6
lẩn riêng biệt trong 1 ngày trên một mẫu bột dược liệu Củ mài (CM l) theo quy trình trên. Kết quả cho thấy hàm
lượng allantoin trong mẫu thử có giá trị trung bình là 3,91 mg/g tính theo dược liệu khô với RSD = 2,93% (n = 6).
ứng dụng

Tiến hành định lượng allantoin trong các mẫu nghiên cứu gồm 6 mẫu Củ mài thu hái tự nhiên, 4 mẫu Củ mài
trổng. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích
với hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,999. Kết quả được trình bày ở hình 2 và bảng 3.


mẵSS

25f
2ữ
15

9.5 9 4

lơ
s

lA lla n t o i»

ữ
1

ỉ

6

CM 1

ỉ

ĩõ

Ỉ2

ĩĩliiii

CM2

CMS

CM4

■lUĩ

mm

25

25

9 .5 B 9

20
IS

20

ÌAIcmtoln

9.59S
AtoiToín

15

10

lỉl

5

5

0

0
0

2

4

6

8

10

12

14 « in

0

2

4

é

i

CM6

CMS
mãXỊ
25

2Ũ
15

9.S91
ịMgx^oin

10
5

0
0

2

4

6

i

10

12

14 « i n

CM7

CMS

mm^
25
20

9 ^

15

ẳAlonAain

to

s
G

_____
min

CM9
Hình 2. Sâckỷđổcủomộtsổmẫuữmũi

1) thuhóitựnhiên (CMl, m i (M ì, CM4, CMS, CMS)
2)tm gm 7,CM 8,CM 9,CM W )

CM10

lỡ

12

14 wăM


Bảng3. KếtquảhàmlượngQllantoinữongcácmẫuCủmài (n=3)
Củ mài thu hái tự nhiên
TT

Tên mẫu

Độ ẩm (%)

P(mg/g)

1

CM1

6,10

3,91

2

CM2

6,32

6,00

3

CM3

7,07

4,54

4

CM4

7,24

4,83

5

CMS

7,76

6,18

6

CM6

9,35

5,78

7

CM7

7,08

3,21

8

CM8

6,79

4,26

9

CM9

7,25

4,78

10

CM10

6,87

3,77

11

CM11

7,44

1,21

12

CM12

6,56

1,55

13

CM13

6,75

5,36

14

CM14

7,00

3,22

15

CM15

7,21

5,48

Củ mài trổng

P: Hàmlượngallantoin(mg/g) tínhtheodượcliệukhô

Bàn luận

Xu hướng hiện nay là ứng dụng các phương pháp
phân tích hiện đại (quang phổ, HPLC, G C ,...) để tiêu
chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu với
các chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm đánh
giá đúng và góp phẩn kiểm soát chất lượng dược liệu.

Phương pháp HPLC định lượng allantoin trong Củ mài
xây dựng được đơn giản chỉ cẩn sử dụng thiết bị HPLC
detector u v là loại detector phổ biến trong các phòng
phân tích, có tính chọn lọc cao (pic allantoin tách khỏi
các pic cản trở, cân đối), chính xác (RSD = 2,93% với n
= 6), khoảng nổng độ tuyến tính rộng (khoảng nổng
độ 12,5 -100 |jg/ml với r > 0,999), kinh tế (pha động
phẩn lớn là; nước 98%; cột sắc ký là loại thông thường:

cyano) với thời gian phân tích hợp lý (15 phút).
Phân tích allantoin bằng HPLC có thể dùng cột
tách với pha tĩnh C18 hoặc cyano, nhưng dùng cột
C18 thì hệ pha động dùng là dung dịch acid formic
[8] hoặc đệm phosphat [5] với tỷ lệ dung môi hữu cơ
khoảng 30%, còn nếu dùng cột cyano pha động chỉ
đơn giản là nước với một tỷ lệ nhỏ acetonitril (2 %)
[7] do allantoin là một chất rất phân cực nên sử dụng
pha tĩnh phân cực (cyano) sẽ cho kết quả tốt hơn. So
với nghiên cứu của Kee Dong Yoon et al. [7], điểu kiện
phân tích có thay đổi, pha động tác giả dùng dung
môi hữu cơ là acetonitril nhưng nghiên cứu này dùng
methanol và chế độ dòng pha động là đẳng dòng
còn của tác giả là chế độ gradient lưu lượng dòng pha


động; đồng thời thể tích tiêm mẫu giảm đi 4 lần (5 |al
so với 20 |il của tác giả) do đó tuy phát hiện ở bước
sóng thấp 215 nm nhưng đường nển ổn định và cho
phép tách tốt allantoin ra khỏi nền mẫu với thời gian
phân tích hợp lý.

Chuyên luận "Củ mài" ở Dược điển Việt Nam IV [1 ]
chưa để cập tới chỉ tiêu định lượng, allantoin là một
hoạt chất có hoạt tính sinh học với hàm lượng tương
đối lớn trong dược liệu thuộc chi Dioscorea [6]. Do
đó, kết quả của nghiên cứu góp phán cung cấp quy
trình phân tích mới định lượng hoạt chất trong Củ mài
nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của
dược liệu này.
Hàm lượng allantoin trong Củ mài từ các nguồn
khác nhau như thu hái trong tự nhiên tại các tỉnh
khác nhau và trồng tại một địa điểm có sự dao động
trong khoảng từ 1,21 - 6,18 mg/g. Trong đó, mức độ
dao động hàm lượng allantoin trong các mẫu Củ mài
trổng và thu hái tự nhiên của các mẫu nghiên cứu
tương đương nhau; tuy nhiên hàm lượng hoạt chất
của mẫu trổng thấp hơn so với nguồn thu hái trong tự

nhiêa kết quả cụ thể biểu thị hàm lượng trung bình
± RSD của các mẫu dược liệu có nguồn gốc tự nhiên
và trồng lán lượt là 5,21 mg/g ± 17,5% với n = 6; 3,65
mg/g ± 41,9% với n = 9. Kết quả này cho thấy có thể
tiêu chuẩn hóa dược liệu Củ mài dựa vào hàm lượng
allantoin nhằm kiểm soát chất lượng nguyên liệu đẩu
vào của quá trình sản xuất đảm bảo ổn định chất
lượng sản phẩm.
Kết luận

Phương pháp HPLC định lượng allantoin trong
Củ mài có tính chọn lọc cao, độ chính xác đảm bảo,
khoảng tuyến tính rộng phù hợp với điểu kiện thiết bị

của các phòng phân tích do đó phương pháp có tính
ứng dụng cao.
Hàm lượng allantoin trong 15 mẫu Củ mài có
nguồn gốc tự nhiên (tại các tỉnh khác nhau) và trổng
dao động trong khoảng từ 1,21 - 6,18 mg/g, do đó có
thể sử dụng chỉ tiêu định lượng allatoin để kiểm soát
chất lượng dược liệu cũng như kiểm soát quy trình
trồng trọt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. 730-731.

2.

Antoine Berthemy, John Newton, Danlin Wu, Deborah Buhrman (1999), Quantitative determination of an extremely polar compound
allantoin in human urine by LC-MS/MS based on the separation on a polymeric amino column, 7. of Phormaceutical and Biomedical
Analysis, 19, pp. 429-434.

3.

Chen XB, Kyle DJ, Orskov ER (1993), Measurement of allantoin in urine and plasma by high-performance liquid chromatography with
pre-column derivatization, 7 C/iro/T?ứfògr. 11; 617(2), pp. 241-247.

4.

X.B.Chen, A.G.Calder, P.Prasitkusol, DJ.Kyleand M.CNJayasuriyat(1998), Determination of Isotopic Enrichment and Concentrations
of Allantoin and Uric Acid in Urine by Gas Chromatography/Mass Spectrometry, J. of mass spectrometry, vol. 33, pp. 130-137.

5.

Ghasem Haghi *, Rohollah Arshi and Alireza Safaei (2008), Improved High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for
Qualitative and Quantitative Analysis of Allantoin in Zea maysJ.Agric. FoodChem., 56 (4), pp. 1205-1209.

6.

Kee Dong Yoon, Min-Hye Yang, Young-Won Chin, Ju Hyun Park, and Jinwoong Kim (2008), Determination of Allantoin in Dioscoreo
Rhizoma by High Performance Liquid Chromatography Using Cyano Columns, Natural Product Sciences, 14(4), pp. 254-259.

7.

Kiran Kumar M and Sitaram B. (2013), Biological activities, HPLC and NMR of Blepharis Glomerans, InternơtionaUournal of Biological &
Pharmaceutical Research, 4(6), pp. 437-440.

8.

Thermo Fisher Scientific Inc. (2010), Thermo Scientific Syncronis HILICHPLC Columns.

9.

Zhang, u Liu, Y., and Chen, G., (2004), Simultaneous determination of allantoin, choline and arginine inRhizoma Dioscoreae by
capillary electrophoresis.-/. Chromơtogr. A, 1043, pp. 317-312.