Nghiên cứu khoa học những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”

Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa
học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464-468.
Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ
di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv.
Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Nguyễn Hoàng Nghĩa
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
Đặt vấn đề
Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài đang bị đe dọa ở
các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng mà nguyên
nhân chủ yếu vẫn là hậu quả của việc tàn phá môi trường sống và thu hẹp diện tích rừng
tự nhiên.
Cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv. còn gọi là cây Lim, họ phụ Vang
Caesalpinioideae, họ Đậu Leguminosae. Lim xanh là loài cây gỗ quý, nổi tiếng từ lâu
đời, có giá trị kinh tế cao và hiện vẫn đang được ưa chuộng trên thị trường [1].
Lim xanh có phân bố trải dài suốt từ Quảng Ninh đến Quảng Bình trong đó có các
xuất xứ nổi tiếng như Cầu Hai, Chân Mộng (Vĩnh Phú), Ba Vì, Sơn Tây (Hà Tây), Mai
Sưu (Hà Bắc) hoặc Hữu Lũng (Lạng Sơn) song đến nay khó tìm thấy những quần thụ
lim rộng lớn mà chỉ còn một số cá thể rải rác [12]. Hiện nay Viện Khoa học Lâm nghiệp
Việt Nam đã sưu tầm và bảo tồn cây Lim xanh từ nhiều xuất xứ khác nhau. Câu hỏi
được đặt ra là liệu các xuất xứ này có trùng lặp nhau hay không?, chúng ta có cần thiết
phải bảo tồn nguồn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ hay không?
Những năm gần đây các chỉ thị phân tử được dùng rộng rãi trong nghiên cứu phân
loại ở nhiều loại cây. Trong số đó, chỉ thị RAPD được sử dụng rộng rãi nhất, bởi kỹ
thuật này đơn giản và ít tốn kém. RAPD đã được sử dụng để xác định giống [4,5] và
mối quan hệ phát sinh loài ở Citrus [6].
Việc sử dụng chỉ thị ADN lục lạp (cpDNA) trong phân tích phát sinh loài đã mang
lại những kết quả rất lý thú bởi tính bảo thủ của nó trong thiên nhiên, tần số đột biến
thấp hơn ADN nhân và có kích thước nhỏ. Sự đa hình của ADN lục lạp được sử dụng
trong nhiều nghiên cứu xác định mối quan hệ địa lý hoặc đa dạng di truyền các loài

[3,10]. Phản ứng PCR để nhân các vùng không mã hoá của cpDNA với các mồi lục lạp
phổ biến, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng các enzym cắt hạn chế để tìm đa hình đã
được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài ở Citrus .
Trong bài này, chúng tôi trình bày những kết quả về sử dụng chỉ RAPD và cpDNA
trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh nhằm đưa ra
khuyến cáo về việc bảo tồn nguồn gen đối với loài cây quan trọng này.
Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu

1


Chín mẫu xuất xứ Lim xanh (Thanh Hoá, Ba Vì, Hà Bắc, Đông Giang, Lang Hanh,
Nghệ An, Cầu Hai, Tam Đảo, Quảng Ninh) do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
cung cấp.
Hoá chất chuẩn được mua từ các hãng Sigma và Amersham (Mỹ).
Các mồi RAPD (C1, C7, C9, B1, B4, B9) được mua từ hãng Operon - Mỹ. Các mồi
lục lạp (cpDNA) trnH-trnK, PsbC-trnS được mua từ hãng Fermentas theo trình tự đã
công bố [9] .
Phương pháp
Nghiên cứu đa dạng loài.
Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành như đã công bố [2]. Sản
phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh
bằng hệ thống Thermal Imaging System FTI-500, Pharmacia Biotech.
Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp. Phản ứng PCR của ADN genome các xuất xứ Lim
xanh với hai cặp mồi cpDNA (20 nucleotide) được tiến hành với tổng thể tích là 25
μl/mẫu gồm: ADN tổng số (12 ng), dNTP (0,2 mM), mồi cpDNA (10 ng), MgCl2 (1,5
mM), Taq polymerase (2 đơn vị) và 2,5 μl đệm 10xPCR. Chu trình nhiệt: 920C 2 phút;
10 chu kỳ gồm các bước: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút; 20 chu kỳ gồm các
bước sau: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút 10 giây; cuối cùng kéo dài ở 720C 10

phút [7,8]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực
tím.
Phân đoạn ADN duy nhất nhận được từ sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được cắt
bằng các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I và sau đó điện di trên gel agarose 1,5
%, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh.
Phân tích số liệu
Các số liệu được đưa vào xử lý bằng chương trình NTSYS pc (Rohlf F. J, 1993) [11]
để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý
tiếp trong NTSYS - SIMQUAL và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Phân tích đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim xanh bằng các chỉ thị RAPD
Trung bình mỗi mồi cho 5,2 đến 9,7 phân đoạn (hình 1). Tổng số 428 băng đa
hình/428 băng nhận được từ các phản ứng PCR ADN genome từ 9 xuất xứ với 6 mồi
RAPD. Như vậy là tỷ lệ đa hình đạt 100%. Số phân đoạn đa hình ở từng mồi là rất cao,
đạt 47-87 phân đoạn.
Mồi C7 cho số phân đoạn đa hình thấp nhất cũng đạt 47 phân đoạn ở 9 xuất xứ, mồi
C1 và B1 cho số phân đoạn đa hình cao nhất, 87 phân đoạn.
ở 9 xuất xứ Lim xanh, số phân đoạn trung bình từ 5 đến 11. Xuất xứ Nghệ An cho số
phân đoạn trung bình thấp nhất (5 phân đoạn), xuất xứ Hà Bắc cho số phân đoạn trung
bình cao nhất (11 phân đoạn). Cả chín xuất xứ đều cho số phân đoạn đa hình bằng số
phân đoạn đếm được, nghĩa là tỷ lệ phân đoạn đa hình ở 9 xuất xứ Lim đều đạt 100%.
Như vậy, bước đầu dựa trên các chỉ thị RAPD chúng tôi có nhận xét là các xuất xứ
Lim xanh rất đa dạng về mặt di truyền.
Bảng 1. Tỷ lệ đa hình của 9 xuất xứ Lim xanh với chỉ thị RAPD

2


Ký
hiệu

Xuất xứ

Tổng số băng
đếm được

Tổng số băng
đa hình

Số băng tb ở
mỗi xuất xứ

Tỷ lệ băng đa
hình(%)

1

Thanh Hoá

38

38

7,6

100

2

Ba Vì

41

41

8,2

100

3

Hà Bắc

53

53

10,6

100

4

Đông Giang

31

31

6,2

100

5

Lang Hanh

46

46

9,2

100

6

Nghệ An

25

25

5

100

7

Cầu Hai

44

44

8,8

100

8

Tam Đảo

41

41

8,2

100

9

Quảng Ninh

24

24

4,8

100

Tổng

428

428

Phân tích sự đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim bằng chỉ thị ADN lục lạp
Kết quả PCR-cpDNA với mỗi mồi lục lạp đều nhận được một phân đoạn ADN duy
nhất có kích thước mong muốn. Sản phẩm với cặp mồi trnH-trnK cho phân đoạn ADN
có độ dài 1750 bp (hình 2a) còn với cặp mồi psbC-trnS thì cho phân đoạn có kích thước
1600 bp. Sản phẩm PCR-cpDNA của cặp mồi trnH-trnK với 9 xuất cây Lim xanh được
cắt bởi các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I với mục đích tìm ra các vị trí cắt của
các enzym này ở các xuất xứ khác nhau. Từ đó có thể nhận được đa hình giữa các xuất
xứ. Kết quả minh họa ở hình 2b.
Từ kết quả ở các hình ảnh thu được cho thấy sau khi cắt với 3 enzym đã thu được 72
phân đoạn từ sản phẩm cắt, trong đó có 54 phân đoạn đa hình.
Enzym Tag I cắt gen lục lạp của một xuất xứ duy nhất đó là Quảng Ninh và ở một vị
trí cắt duy nhất (1600 bp).
Enzym Hha I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 4 vị trí (thứ tự như sau vị trí 1: 1500
bp, vị trí 2: 1000 bp, vị trí 3: 700 bp, vị trí 4: 600 bp). Các xuất xứ Thanh Hoá, Hà Bắc,
Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo có vị trí cắt như nhau, đó là vị trí cắt 2, 3, 4. ở xuất xứ
Ba Vì, Đông Giang, enzym Hha I cắt gen lục lạp vị trí 2 và 4; còn xuất xứ Nghệ An và
Quảng Ninh, enzym này cắt ở vị trí 1, 2, 3.
Enzym Hinf I cắt gen lục lạp của các xuất xứ ở 6 vị trí (vị trí 1: 700 bp, vị trí 2: 600
bp, vị trí 3: 500 bp, vị trí 4: 200 bp, vị trí 5: 100 bp, vị trí 6: 80 bp). Enzym này cắt gen
lục lạp các xuất xứ Ba Vì, Đông Giang ở cả 6 vị trí nêu trên. Các xuất xứ Thanh Hoá,
Hà Bắc, Lang Hanh, Cầu Hai, Tam Đảo, enzym này cắt ở 5 vị trí 1, 2, 3, 4, 5. Tuy

nhiên, enzym Hinf I không cắt bất kỳ một vị trí nào trên gen lục lạp của 2 xuất xứ
Quảng Ninh và Nghệ An.
Như vậy, các kết quả phân tích chỉ thị cpDNA cho thấy các xuất xứ Lim xanh rất
khác nhau về mặt di truyền tế bào chất.
3.3. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh
Các phân đoạn đa hình dựa trên phân tích RAPD và cpDNA được ghi nhận dựa trên
sự có mặt hay vắng mặt của chúng. Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là
0. Các số liệu này được xử lý bằng chương trình NTSYS-pc để phân tích mối tương
quan giữa các đối tượng nghiên cứu. Dựa trên ma trận số liệu được thiết lập, chúng tôi
tiến hành xác định mối tương quan di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh.

3


Dựa vào các hệ số giống nhau về di truyền Jaccard thu được, một sơ đồ về quan hệ
di truyền giữa các xuất xứ Lim xanh được thiết lập (hình 3). Từ sơ đồ nhận được chúng
tôi thấy rằng quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Lim là rất xa nhau. 100% các xuất xứ
có hệ số di truyền nhỏ hơn 0,5. Hai xuất xứ Lang Hanh và Cầu Hai được coi là gần nhau
nhất về quan hệ di truyền (tuy nhiên hệ số Jaccard cũng chỉ đạt 0,43).
Hai xuất xứ Quảng Ninh và Nghệ An có mối quan hệ di truyền xa nhất so với các
xuất xứ còn lại (hệ số Jaccard là 0,17).
Kết luận
Trong tổng số 428 phân đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên trong phản ứng PCRRAPD sử dụng 6 mồi với 9 xuất xứ cây Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình. Điều
này cho thấy các mồi RAPD được nghiên cứu cho sự đa hình cao ở các xuất xứ Lim
xanh.
Phân tích các vị trí cắt đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế trong sản phẩm PCR với
các mồi lục lạp cũng cho thấy chỉ thị ADN lục lạp cho mức độ đa hình cao.
Các phân tích đa dạng di truyền dựa trên hệ số di truyền giống nhau Jaccard giữa
các xuất xứ cây Lim xanh bằng các số liệu về chỉ thị RAPD và ADN lục lạp đã cho thấy
các xuất xứ này rất đa dạng về di truyền.

Từ các kết luận trên, chúng tôi đi đến khuyến cáo về sự cần thiết phải bảo tồn vốn
gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ vì các xuất xứ được nghiên cứu rất xa nhau về di
truyền.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe dọa ở Việt Nam. Nxb Nông
nghiệp Hà nội. 147 tr.
2. Nguyễn Đức Thành, 1999. Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà
Nội: 1205-1215
3. Demesure B., Sodzi N., Petit RJ., 1995. A set of universal primers for
amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and
chloroplast DNA in plants. Mol Ecol 4:35-38.
4. Deng ZN. et al, 1995. Identification of in vivo and in vitro lemon mutants by
RAPD markers. J Hortic Sci, 70:117-125.
5. Deng ZN. et al, 1995. Parentage determination of some citrus hybrids by
molecular markers. Proc Int Soc Citricul 2:849-854.
6. Federici CT. et al, 1998. Phylogenetic relationship within the genus Citrus
(Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis. Theor
Appl Genet, 96:812-822.
7. Gielly L., Taberlet P., 1994. The use of chloroplast DNA to resolve plant
phylogenies: non-coding vs RbcL sequences. Mol Biol Evol, 11: 769-777.
8. Mohanty A. et al, 2001. Chloroplast DNA study in wild population and some
cultivars of Prunus avium L.. Theor Appl Genet, 103: 112-117.

4


9. Nicolosi E. et al, 2000. Citrus phylogeny and genetic origin of important
species as investigated by molecular markers. Theor Appl Genet, 100: 11551166.
10. Olmstead RG., Palmer JD., 1994. Chloroplast DNA systematics: a review of

methods and data analysis. Am J Bot 81: 1205-1224.
11. Rohlf FJ., 1993. NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system,
Version 1.80. Applied Biostatitics Inc., New York.
12.
Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Chương
trình NCCB trong KHTN. Chúng tôi xin cám ơn GS. TSKH. Lê Xuân Tú đã đọc và
góp ý cho bản thảo.
Summary

The use of RAPD and chloroplast DNA markers in the study of
genetic relationship of Erythrophleum fordii Oliv. From different
origins
Quach Thi Lien, Nguyen Đuc Thanh
Institute of Biotechnology –VAST
Nguyen Hoang Nghia
Forest Science Institute of Viet Nam
Genetic relationship of nine Erythrophleum fordii Oliv. origins were investigated
using RAPD and cpDNA markers. The RAPD analysis using random amplified
polymorphic primers reveled 428 Polymorphic bands. All the bands were polymorphic
among the investigated origins. Non-coding regions of cpDNA were amplified using
chloroplast universal primers trnH-trnK and PsbC-trnS, and polymorphisms were
subsequently generated by digestion of the PCR products with TaqI, HhaI and HinfI
endonucleases. Eleven restriction sites were detected and 54 polymorphic bands of the
total number 72 bands were obtained.
The coefficients of genetic similarity between the investigated origins based on
RAPD and cpDNA data were rather low (from 0,17 to 0,43) showing the genetic
divergent of the E. fordii origins. Our results indicated an necessary to protect all of the
E. fordii investigated.

5