Tổng quan về phương pháp xác định gốc tự do và các dạng hoạt dộng cùa chúng

RỘ&ÁM
Y TÊơw
JÍỜ3
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
83C8 caso VŨC8

Đổ thực hiện đế tài này, tôi luôn nhận đươc sự quan tâm, hướng
dẫn tận tình của các thấy cô.
Tôi xin bàv tỏ lòng kính Lrọng và biết ơn sâu sắc tới:
- Thầy giáo-PGS* TLSKH Lẽ Thành Phưức
- Cô giáo-Ths. Hoàng
Thị Tuyết
Nhung
TRỮỠNG
THỊ
MAN
đã luôn quan tầm, hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàh thành khoá
luận này.

TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy, các cô, và các anh
VÀ CÁC DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG
chị kỹ thuật viên trong Bộ môn đã tạo điều kiện thuân lợi và giúp đỡ

tôi thựcKHÓA
hiện khoá
xin gửi
lờisĩcảm
ơn59
tới(2004-2009)

các cán bộ trong
LUẬNluận.
TỐTTôi
NGHIỆP
Dược
KHỚA
thư viện ĐH Dược HN; thư viện Quốc Gia; thư viện khoa học kỹ
thuật, đã giúp đỡ tôi tìm những tài liệu quý giá trong quá trinh làm
luận văn. Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Đảng Uỷ nhà trường cùng
toàn thể các thầy cô giáo đã tao điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện
khoá luận này.
-

Người hướng dăn : P(ỈS. TSKH* Lê Thành
Phước
Cuối cùng, tôi xin gửi
lòi cảm ơn sâu sắc đến gia dinh và bạn bè
ThS. Hoàng Thị Tuyếí Nhưng
đã luôn động viên giup
hoàn
khoáHóa
luận.
- đỡ
Nưitôi
Ihực
hiệnthành
: Bộ mân
Đại Cương - Vô Cơ
- Thcfi gian thực hiện : 02/2009 - 05/2009

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2009

HÀ NỘI-5/2009


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ .................................................................................................1
Phẩn lĩ ĐẠI CƯƠNG VỀ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG

HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG...................................................2
1.1- Gốc tự do và các dạng hoạt dộng của chúng....................................2
1.1.1- Khái niệm......................................................................................2

1.1.2= Sự lílĩlh thầnh gốc tự do trong eơ
1.1.3- Vai irò và lấc hại cua gốc lự do.................................................6
1.2-...................................................................................................................... Hệ
thống bảo vệ chồng gốc tự do của ccr thể....................................................8
1.2.1- Các enzym nội bào....................................................................... 8
1.2.2- Các chất phi enzym phân tử nhó...................................................8
1.2.3- Các phối tử tạo phức khoá kim loại............................................10
1.3- Các nhóm chất chông gốc tự do............................................... 10
1.3.1- Nhóm chất đã biết rõ cấu tạo phân tủ cơ chế tác dụng................ .
10
1.3.2- Nhóm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu, và thực phẩm cố hoạt
tính chống oxy hoá....................................................................... 10
1.3.3- Hormon......................................................................................11
Phẩn 2: CÁC PHƯƠNG PIIẢP XÁC ĐỊNH GỐC Tự DO VẢ CẮC

DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG.......................................13

2.1- Các phương pháp xác định trực Eìếp .....................................
2.1.1-

13

ESR và bẫy spin..........................................................................13


2.1.6-

Phái hiện dạng elor hoá (HOCI)...............................................20

2.1.7-........................................................................... Phát hiện hydrogen
peroxid {H202)........................................................................................21
2.1.8-

Phát hiện oxy đơn bội ('02)....................................................... 22

2.2- Các phương pháp dáu vân tay. ...................................................... 23
2.2.1-

Đo quá trình peroxyd hoá lipid (POL).....................................23

2.2.2-

Đo các tổn thương của ADN..................................................

2.2.3-

Đo các tổn thương của protein.................................................. 31

2.2.4-

Đo hoạt tính enzym superoxyd dismutase (SOD)...................... .

30

32
2.2.5-

Đo cấc chất chống peroxỵd GSH và GSHPx................................

33
2.2.6-

Đo hàm lượng selen..................................................................35

2.3- Các phương pháp do hoạt tính chống oxy hoá toàn phần......... . .36
2.3.1-

Phương pháp TRAP................. . ..............................................36

2.3.2-

Phương pháp ABTS...................................................................37


CHÚ GIẢI CHÙ VIẾT TẮT
ABTS: 2,2-aáno bỉs-(3- ethylbenzothiazolm-6-sunfonic acid)
ESR: Electron Spin Resonance (Cộng hường spin electron)

EPR: Electron Paramgnetic Resonancc ( Cộng hưởng thuận từ eỉectron)
FAD : Flavin Adenin Dinucleotid
FMN : Fiavin tnononuclcotidc
GC-MS: Gas chrornatography- mass spectrometry (Sẳc ký khí - khối phổ)
GR: Glutathion rcductase
QSHi Ỡltỉtâửliỡn

GSHPs: Glutathion peroxydase
HPLC: High pcríormance liquid chromatographyỊSãc ký lỏng hiệu năng can)
IsoPs: Các Isoprostan
MDA: Maìondĩaldehyd
NAD : Nicotinamid Adenin Dinudeotid
NADPH.2; Díhvdronicotinainide adenine dinucleotid phosphat
POL: Peroxvd hoá lipid
PUFAs: Polyunsaturated fatty aci.ds
(Các acid béo khổng có khả năng sinh cholesterol)
ROS : Reactive oxygen species (Dạng oxy hoạt động)
RCS : Reactive chlorine spccics (Dạng clor hoạt động)

RN§ : Rsâcỉivc ĩiitrogên spẽcỉês ( Dạng nitỡlìoặt động)
SOD: Superoxyd dismutase
TAS; Total Antioxidant Status ( Hoạt tính chồng oxy hoá toàn phần)
TRAPr ToiaL peroxy radical Irapping antioxyđant pararaeter assay
(Đo thông số chống oxy hoá toàn phần bằng bãy gốc (pcroxyl) )
TBA: Thiobarbituric acid
TBARS: TBA - reactivity or TBA reactive material (Chất phản ứng vối TBA)


ĐẶT VẤN ĐỂ
Trong những năm gần dây, gốc Lự do và các dạng hoại động của chúng

đang là mổi quan tâm lớn của con người, đặc biệt là Y- Dược học hiện đại do
sự tiên quan cùa chúng đến nhiểu cơ chế bệnh lý nghiêm trọng à người.
Gốc tự do sinh ra từ quá trình chuyển hoá trong CƯ thể hoặc từ ngOíũ môi
tnrờng xâm nhập vầo cơ thể. Các gốc tự do và các dạng hoạt động của chúng
có khả năng oxy hoá cao, phát sinh những phản ứng dây chuyền làm tổn hại
đến tế bào, tổ chức, gây ra nhiều loại bệnh như: bệnh lý tim mạch, ung thư,
đái Lháo đường... và làm Lãng quấ trình lão hoá ở người. Do đó hiện nay các
gốc tự do đang được quan tâm nghiên cứu để tìm ra các chất chống gốc Lự do,
chống oxy hoá hiệu quả dùng cho phòng và diểu trị nhiều loại bệnh tật góp
phần bảo vệ sức khoe, kéo dài tuổi thọ của con người.
Để đánh giá lác động và vai trò gày lổn thương oxy hoá cùa các gốc tự do
và dạng hoạt động chúng trong các bệnh lý ở người và đánh giá hiệu quả của
các thuốc phòng và điều trị các bệnh trẽn, người ta đã dựa vào việc xác định
các gốc tự do và dạng hoạt dông của chúng, Hiện nay, nhiều trường Đại học,
Viện nghiên cứu đã triển khai ứng dụng các phương pháp nghiên cứu, xác
dinh gốc lự do Irong sinh học và dược học. Xuất phát từ những thực tế trẽn
chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Tổng quan về phương pháp xác định gốc tự
do và các dạng hoạt dộng cùa chúng” vtìri hai mục tiêu:
1. Viết được tổng quan về sự hình thành gốc tự do và các dạng hoại động
của chúng trong cơ thổ, trong tự nhỉcn.
2. Hộ thống được nguyên tắc của các phương pháp xác định gốc tự do và
các dạng hoạt dộng của chúng.

1


PHẦN I : ĐẠI CƯƠNG VỂ Gốc Tự DO VÀ CÁC DẠNG HOẠT
ĐỘNG CỦA CHỦNG
1.1-GỐC tự do và các dạng hoạt động của chúng [6] [12]
1.1.1-

Khái niệm

Gốc tụ do (R‘) là những tiểu phan hoá học (phán tử, mảnh phân tử, nguyên
tử, ion) có electron độc thân ( e- hưú trị) và có thể tồn tại độc lập. Ví dụ;

0H\ộ ỉị

....

Từ phản ứng thứ cấp của các gỏ'c tự do, nhiều chất không phải gốc nhưng
hoạt lính oxy hoú mạnh được tạo thành.
Ngày nay. lý thuyết gốc tự do đã chứng minh trong cơ thể người tồn tại
nhiều loại gốc tự do và các dạng hoạt động của chúng (bảng 1)
1.12- Sự hình thánh gốc tụ do trong cơ thể
Trong cơ thể, gốc tự do được hình thành Ihoo 3 con đường:
1.12.1- Từ chuồi hô hấp tểbào trơng ty thể
Chuỗi vận chuyển Hydro và c-( tóm tắt);
4 Ferocytocrom + 4H‘ + 02 = 4 Fericytocrom 4- 2ĩFO
(Fe3+)

(FC2+)

Đó là phản ứng tổng kết cho ví dụ vận chuyển 4H+ 4- 4Ể theo sơ dồ sau;

Xúc tác bởi; Các enzym vận chuyển hydro: Dehydrogenase (với NAD;

2

ĩ

ô 2+~e= '0'j

(1)

FAD; FMN là Coenzym); các enzym vân chuyển e (5 cytochrom là phức của
Fe2+, Fe3+) và catalase, peroxyda.se, glutalhĩon, vitamin c...
Sau đó, phân tử OT nhận từng electron:
gổc anion superoxyd
*0_2 + e+ 21 r = 1 í2o2

(2)

Hydroperoxyd
H2G2 + ể + H* = H20 4- :GR (3)

Gốc hydroxyl
‘OH + e + H+ = Hp

Phản ứng tổng:

(4)

02 + 4 É? + 4H' = 2H ,0 + Năng lưựng(ATP)

Do rò ri, thẩm lậu, tự huỷ giữa các gốc:
'02 + '02 + 2H* = H2OZ + *02
(5)
oxy đơn bội

*02 + H202 = OH + ỎH + l02

(ố)

103
lít.mol"1 . s 1
không xúc tác:
lỉaber - weìss
K 2=

cổ xúc tác Fe2f, Cu+:
Fenton

Tốc độ phản ứng Fcnton » phản ứng Habcr- wciss
Từ 6 phản ứng trên, xuất hiện 4 chất độc hại:
o, Gốc xuất hiện đáu tiên trong hô hấp tế bào, không quá độc, nhưng khơi
mào cho các phán ứng sinh gốc khác.
OII* Gốc nguy hiểm nhất (gốc đom giản, khối lượng nhỏ, hoạt tính mạnh)
H>02 Phan lử oxy hoá- khử mạnh, rất độc hại
'02 Phan tử năng lượng cao, nguy hiểrn
4 tiểu phân này gọi chung là các dạng oxy hoạt động đầu tiên (OXHĐ)

3


H2N^

^.COOH

H2N^ ^COOII

02 ,
NO-synthase

.C-NH(CH,)rCH

,C-NỊỊ(g[,)rCỊỊ

HN
ỉ. 1.2.2TừL-Arginia
quá
trìnhỜ
hoá
ỉỉpìd
=L-Cilrulĩn
POL)
ỉLI.12.3Từperoxyd
các phản
ứng
tạo(peroxydlìpid
gốc khác
thể cơ thể ị nội môi)
2.5nhiễm
mối
trườngỉ
ngoại
môi)trung
gây
ôcơnhiễm
NADPH

,l+1 oir hoặc
( POL
phát
triển
nhiều
gốc
- Xenobiotic(
dị rasinh):
Hoá
chất,
trừhoạt
sâu,đông
diệt khác)
cỏ, CC1 4 ... từ môi
lạo
ROS,
RNS,
RCS)
->
Mịetạo
+ •Ochất
Màng sinh học chủ yếu cấu tạo bởi phospholipid với các acid béo chưa no
trường
Fe2* + ô?. —* Feỉ+ + •0 2
có áiR"lực mạnh(10
vói) OXHĐ
vào
hoá tạo
H,0cơ-4thể
RHsẽ+chuyển

/QH (LH)

Me"'

L_

+ Õ7

J

Sơ đổ quá trình POL có thểVtóm lược như sau;
(70 % cơ
* X------»
X thể)
- — * + X —» X'+ --------»....
(12)
í.,-OII(
Tham
R* +gia
LHPOL
-» RH
+ L' Iĩyđroxyl hoá)
OH- +LH-»H20 + l/
Tiếp tục:
* CC14—>cr+ccv CCI3O2' + CC12’
(13)
i
í
L +02^L00
gây POL mãnh liệt(7)

ở gan
- KỈm ỉoại nạng:
LOO* + LH LOOH + L*
Gốc NO' sinh ra trong
nội
mạcLOO*
mạch và
máu
(gây
L’ + o,
—►
tiếp
lụcgiãn
quaymạch)
vòng và
nhưtrong
trên mọi tế
bào
(gây1Ocác
chức năng khác
Hoặc
a + LH -» LOOH
‘ khơicơmào
gốccủa môi trường
+t* Sự lạo Ihiinh gốc tự ■do02trong
thể phản
do tácứng
động
Quú trình POL
dẫn đến peroxyđ hoá lipid(LOOH), phân cắt LH (như acid

2+
Mgoài ra, Fe còn xúc lác phản ứng
Fenton tạo ‘OH, '02 gây nguy hại.
(ngoại
arachiđonic tạo MDA, ethan, pentan).
- Thuữ'c( Blcomycin, Artcmisinin...)
sinh):

- HợpCác.
chái tia,
Niiư:các
Ar-bức
NOn,xạR,R2NH- NO , Nitrcsamin
1.12.4Vi(7)
khuẩn,
virus,
ký sinh
vạt gốc + gốc (polymer hoá):
Phản -ứng
có thể
bị dập
tắt bằng
• Tia phóng xạ( đâm xuyên)
L*
+
L*
-»
L-L
Polymerhoá
I.Ỉ2.6- Cúc slressị quá tải về thể "Ị

chất
hoặc tinh (8)
thần)
R,- R2 L*
—^+Rị
-tR
T
(11)
R* -> L-R I
Phá vỡ cân bằng nội môi làm tăng R' trong cơ thể gáy sựẹss oxy họẩ ( quá
Hoặc đổng lv do peroxvd hoạt tính cao, tạo phản ứng sinh gốc vượt qua
tải gổc tự do).
gàyPOL
H0do
2'
màng:
1.1.3- Vai trò và
tác hại của gốc tự
[6] [8]
Lì .3.1- Vai trờ của gấc tự doJỊ[61
Ht
LQQ*
Hydroperoxyd(HO-,‘) là mội acid
diện
lygổc
hoàn
toàn ở pH cơ thể —> H+ + *0~2
Gốc
hvdro
Iípopcroxyd

* Trong hoá học: Trong các phán ứng phân huỷ, tổng hợp hoá học...thực
khai mào LOOH------------------►
các phản ứng sinh gốc.[6]
LO-tạo
+ OH*
chất là(9)
quá trình bẻ gãy các liên kết,
gốc tự đo. dể hình thành liên kết mới,
• N.
TiaGỐC
tử ngoại
alkaxyl gổc hvdroxyl
chất mói .
■'-* L*
+
-OOH
Gốc acid. béo gtíc hydrosuperoxyd

Các gốc này lại dóng vai trò R* ban đầu khơi mào lại phản ứng dây

ST - > ST*-------»ST
+ '02 u hắc tò. ung thư da
chuyên (7)
4 56


* Trong sinh học: R 'có nhiều vai trò quan trọng:
> Dị hoá, ly giải chất
> Tổng hợp chất (2 gốc dễ kếl hợp nhau như tổng hựp hormon sleroid}
thông qua R'

> Sản xuất nâng lượng ATP
> Bảo vệ (tiêu huỷ virus; vỉ khuẩn; ký sinh trùng; các lế hàn gíà, hỏng,

ung thư)
> Điểu hoà tính thấm các màng

Tuy nhiên, §ự ĩhẩm lậu, rò rỉ, dư thừa R' khỏi cấc quá trình hữu ích lằ

mặt trái gay nguy hại cho cơ thể.
ỉ .ì .3.2- Tác hại của gấc tự do
[R]
Tất cả các phân tử sinh học đều có thể bị gốc tự do tấn cõng, nhưng phân
tử lipid là dễ nhất. Màng tế bào rất giàu các acid béo chưa no, là những phân
tử dễ bị các gốc có tính oxy hoá tán công- Sự hưỷ hoại cấu trúc của các acid
héo chưa no chính là quá trình peroxyd hoá lipiđ (POL), sinh ra các gốc mới:
L*, LOO' ...Băn than các gốc LOO’ có thể chuyển dịch điện tử Lạo ra các
pcroxid nội và phân huỷ thành những mảnh có số nguyên tử cacbon ngắn hơn,
ở dạng andehyd độc hại như: hydroxynonenal, malonyldiandehyd, hoặc etan,
pentan...Quá trình phân huỷ này gây tiêu huỷ màng tế bào, lạo ra các sản
phẩm aldehyd độc hại. Đây là một kiểu gây tổn thương, viêm hoại từ đặc biệt
của phần ứng gổc tự do. Quầ trinh nầy gắn liền với tổn thương mổ ơ cảc bệnh
(nhu tổn thương gan do CC1 4, xơ vữa động mạch, tổn thương ở các khối u ác
tính...)
Các ADN cũng bị các gốc có tính oxy hoẩ mạnh tấn công, khi gốc này
hình thành ở gần sát phân tử ADN. Những tmcleobase tìm thấy ỏ trong nuớc
tiểu của người là bằng chứng có sự tấn công liên tục của các gốc tự do và phân
tử ÀDN. Dù được sửa chữa với hiệu quả rất cao, mộl sổ tổn thương này vân có

7

GSH
GSH

H
GS‘H‘HO*
GS
H20
O
H
GS-H-HO*
—*
H20
thể
được
tíchchống
tụ lại,oxh
saungoại
một bào(
thời gian
lượng
lích
tụ
lạingoại
đù đểbào,
dãn máu...:
tới dột hiến
•OCác
chất
thân

nước)
gồm
dịch
GS
và từ đó mà sinh ra ung thư.
VitaminC, glutathion(GSH)

1.2- Hệ
thống
bảolấc
vệdụng
chống
gốchoà
tựgốc
do tự
của
thế
Các
chấl này
trung
docơ
theo
các[6]
cách:

Hê thống bảo vệ của cư thể bao gổm: enzym, các chất chống oxy hoá phi
(Ị) Cơ chế Cần hẳng hydroquinon- qiùnon
enzym và phối tử tạo phức khoá ion kim loại.
ĩ.2.1- Các enzym nội bào
* SOD (superoxyd dismutase):

* Mn-SOD (superoxyđ dismustase chứa Mn/ ty thể) có tác dụng loại *0 2
nhưng lại sinh ra iỉ202 ;
*cr2 4 ‘Cf2 4 2H+
^gg-4 H2O2 4 302

(15)

Hydrnquínoĩi
(HvdrỡquitìOl
Quiiion Lưỡng gốc bền Semiquinon
(dãn Chat)
dạng khử)
(dạng oxy hoá)
(dản Chat)
_
Quinol *Cu-Zn-SOD (supcroxyd dismuslase chúa Cu, Zn/ bào tương) loại ‘0 2 từ

ty thể thoát ra bào tương(như phản ứng 15),
Phản E,
ứngVitamin
(16) có hằng
số vận
tốc rất lớn K = 10 9 L.mol '.s 1 do có xúc tác
Ví dụ: Vitamin
c, CoQ
J0, Flavonoid... đều có kiểu chuyển đổi
(tốc
độ phản ứng tăng lên hàng triệu lổn so với phân ứng (5)) và khỏng
QuiSOD
non và

Qụinol.
tạo ‘Q7 đỏc hại
* Catalase (Fe**) tác dụng khi [H202] > 10‘8 moLL'1:
b) Cơchếịổc + gốc ị nhờ
chết + xúc tác
3
2Hcơ
> Henzym):
202
202 4 02 (16)

í Qtetiìien pẽrexyởa§s (Sê) = GSHPX; tắ£ dỵng khi [HA] ^ lô8 môl:L ■;
H202 4 2GSH

> GSSG 4 2H20 (17)

20H* 4 2GSH -4- GSSG 4 2H20 (18)
1.2.2- Các chất phi enzym phân lử nhủ (bầy gốc tự do)
* Các chất chống oxh nằm ngay trên màng lố bào:

Vitamin E (a - tocoíerol), p - caroten, vitamin A, coenzym Q 1(l.

8


1.2.3-

Cúc phôi từ tạo phức khữú các lon kim loại

Các ion kim loại nặng như Fc 1+, Fe3*, Cu+, Cu2+... xúc tác các phản ứng tạo

ra các gốc tự do, Trong cơ thể có một số phối lử có khả Iiãng tạo phức với ion
kim loại này, làm mất khả năng xúc tác đó. Các chất tác dụng theo cơ chế này
là:
- Transferin ( protein vận chuyển Fe3+/ huyết tương)
- Laetoíerin ( phức Fe2V trong dịch (sữa, nước mắt, nước mũi))
- Feritin ( phức dự trữ Fc/ bào tương)
= QẽnỊteptaĩin; prQtêin shổa Ctì dpg phét ÌỂĨÍỊ e&y híầ Fê2+ -ị Fẽ3+

1.3-Các nhóm chất chống gốc tự do( chống oxy hoá) [6]
1.3.ỉ- Nhóm chãi đã hiết rõ cấu tạo phân tử cơ ché tác dạng
- Enạym: MĩiSOU, CuZnSOD, Catalase(Fe), GSHPx(Se)
- Goenxym: CoQ10
- Cơ chất: Glutathion(GSH), chất cổ -SH như L-cystin( Acctylcytcin)
- Vitaminc: E

, c, A, p - earoten

- Một số Flavonoid( =Biflavonoid)
- Nguyên tđ vi lượng: Cu, Zn, Mn, Se
- Các phối tử sinh học tạo phức làm mất vai trồ tạo R* của Fe, Cu( quá
tải và ở trạng thái tự do).
Thuốc chống oxy hoá được bào chế từ các chất trên, đưn lẻ hoặc kết hợp
2GSH
H2Ơ2 . ^ ) GSSG + 2 H202 (21)
nhiều chất trong một dạng
bào+chế
1.3.2Nhúm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu, và thực phẩm có
c) Cơ chế giải toả năng lượng:
hoạt
tính

'o, + Ịp-carolen —> P-caroten* 4- 3Oa
chông oxy hoá:
* Chứa
họ hợp chất +Bĩoflavonoid:
------►p-caroten
Nhiệt vò hại thoát ra
- Bạch qưả( Ginkgo biloba); Ginkgoílavon, proanthocyaniđin
- Nho, vỏ câv thông: Proanthocyanidin/ dịch chiết Pycnogenol
- Hoa hoè: Rutin
- Chè xanh: Polyphcnol thuộc catcchin

910


Dạng gốc

Dạng không gốc

Các dạng oxy hoạt động( ROS):
Bảng
1:Nhãn
Gốc trán;
tự do0Havonoiđ
của chúngperoxide,
trong cơ H
thể
- Superoxide,
Hydrogen
2và các dạng hoại dộng
20,[12]

• Nghệ
( curcumin);
Hydroxvl,
OH' tỏi (allicin);

Hypobromous aciđ, HOBr
Gâ'c,
xoài,
cà
chua,
cà
rốt
(carotenoid:
(3 - caroten,
lycopen,...)
Hydroperoxvl, HO,'
Ozone
03
Rau, quả, mầm ngũ cốc, củ (vitamin c, E, A)
Lipid peroxyl, L02’
Oxy dơn bội (0,'Ag)
Nấm men hia, cây xấu hổ, nhàu...(Se hữu cơ)
Lipid alkoxvl, LO’
Các peroxide lipid, LOOH
Sâm, nấm linh chi, sữa ang chúa( nhiều chất)
Các sàn phẩm cùa phàn ứng Maillard
Nhiều rau, quả, củ là rtguổn bổ sung dinh dưỡng chống oxy hoấ hằng ngày
CácHormon
dạng clo hoạt dộng (RCS):
1.3.3Nguyên

tử
do,
C1 lùng
Hypochlorous acid, HOC1
= Melalonin/ luyến
Nitryl
(nitronium)
chloride
N02C1
- DHEA( Dehydroepĩandơslcron/
tuyến
thượng thậndẫn chất
sinh dục
nam) Các chloramine
- GH( hormon
tãng
trưởng/
tuyến(RNS):
yên)
Các dạng
nitơ
hoạt động
oxĩde, NO'
Nitrous aciđ, HNG,
-Nitric
Testosteron
Nitrogcn
dioxidẽ, N02'
- Oestrogcn

Nitrousyl cation, NO'

Nilroxyl
NOphức tạp, cùn
Là những hormon chống oxy hoá, nhưng
cư chê anion,
lác dụng
tetroxide, N204
nghiên cứuDinitrogen
tiếp.

Dinitrogen ĩrioxide, N0O3
Peroxynitrite, ONOO
Peroxynitrous acid, ONOOH
Nitronium(nitryl) cation, N02+
Alkyl peroxynitrites, ROONO
Nitryl( nitronium) chlorided^OoCL

12
11


PHẦN 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Gổc Tự DO VÀ CÁC
DẠNG HOẠT ĐỘNG CỦA CHƯNG

2.1-Phương pháp xác định trực tiếp
Phương pháp xác định trục tiếp được phận thành ha loại như sau:
2.1.1Phương pháp cộng hưởng spin dectrnn (ESR) và bấy spỉn
[11] [12]
Quang phố cộng hưởng spin clcctron (ESR) là kỳ thuật duy nhất xác định

trực tiếp các gốc tự do, còn gọi là cộng hưởng thuận từ electron (EPR). ESR
đặc hiệu với các gốc tự do vì phương pháp này phát hiện sự có mặt của các
electron dộc thân. Một electron có hai trạng thái spin là + 7? hoặc - 7 Z và nó
giống như một nam châm nhỏ, khi đặt vào một từ trường ngoài, nó sẽ sắp xếp
cùng chiểu hoặc ngược chiều từ trường. Do đó nó tạo ra hai mức năng lượng
khác với từ trường ngoài. Nếu sử dụng bức xạ điện từ có mức năng lượng phù
hợp, bức xạ này sc bị hấp thu và năng lượng này được dùng dc chuyển
electron từ mức năng lượng thấp lên mức năng lượng cao hơn. Khi đó, thu
được phổ hấp íhụ ở vùng sóng cực ngắn của phổ điện tử. Phổ kế ESR hiển thị
phổ đạo hàm bậc nhất, không chỉ cho biết độ hấp thụ mà còn cho biết tốc độ
thay đổi thay đổi độ hấp thụ.
Điều kiện để xảy ra sự háp thụ là; AE = gpll
Trong đó, AE là khoảng cách nàng lượng giữa hai mức năng lượng của
electron.
H là cường độ từ trường
p là hằng số Bohr magneton
g (hệ số phân chia) = 2.00232 đối với một clcctrơn tự dơ. Và hẩu
hết các gốc tự do quan trọng về mặt sinh học đểu có giá trị gần đúng với giá
trị này.

13


Nếu phương trình trCn được Ihoả mãn, k.ếl quà ta sẽ thu đưực một phổ hấp
thụ. Đối với một elcctron độc thân, phổ hấp thụ của nó có dạng như sau;

Nếu sử dụng đạo hàm bậc nhất thì quang phổ hấp thụ có dạng:

Một số các hạt nhân nguyên tử, ví dự hạt nhân hydro và hạt nhân nitơ,
cũng giống như những nam châm nhỏ và sẽ sắp xốp cùng chiéu hoặc ngược

chiều với từ trường ngoài. Do đó electron độc thân trong nguyên tử hydro sẽ
tiếp xúc với hai lừ trướng khác nhau. Do đó sẽ có hai sự hấp thụ náng lượng và
phổ hấp thụ đem sẽ trờ thành một dường dôi:

Thường biểu diẽn theo phổ đạo hàm bốc nhất:

14


Số đường trong phổ ESR cùa một gốc dược gọi là cấu trúc siêu Tinh vi và
cấu trúc này thường rất phức tạp khi các gốc có chứa nhiều hạl nhân. Có thể
xác định một gốc từ phổ ESR của nó bầng cách nhìn vào giá trị g, cấu trúc
siêu tinh vi và hình dạng phổ,
* Bẩy spỉn
Phương pháp ESR không dũ nhạy để xác định trực tiếp các gốc rất hoạt
đông như 'O 2, OH\ alk_oxyl(RO’j, R02* trong các cơ thể sống trừ khi ở nhiệt
độ rất thấp để giảm thiểu các phản ứng của chúng, mà độ nhạy của phương

phấp nầy ehi pliát hiện đượe m |ếe ít h9ệt động hm nto
£á£ i& aseerbỵl và
tocophcroxyl. Đổ khắc phục đidu này người ta sử dụng bẫy spin, một gốc Lự
do hoạt động được cho phản ứng với một bây (chất bẫy gốc) dể tạo ra một gốc
bẻn hưn( có thời gian sống dài hưn), gốc này sẽ đạt lới một nồng độ để có thể
xác dịnh dược bằng phương pháp ESR. Một bảy spin lý tưởng cần phản ứng
nhanh và đặc hiệu với gốc cần nghiên cứu và tạo ra sản phẩm bẽn về mặt hoá.
không bị chuyển hoá trong cơ thể sống và có một phổ ESR duy nhất. Mọt số
bầy ,spin( các phân tử bẫy) đã dược sử dụng trong các hệ sinh học: tNB, BNB,
4-POBN, DBNBS, đạc hiệt phổ biến là DVIPO(5,5-DímethVipyrroline-Noxide)và PBiN( alpha-Phenyỉ-lerl- bulyinitronc).
Ví dụ: DMPO phản ứng với cá hai gốc tự do "Cũ và OH' để tạo thành các
sản phẩm cổ phổ ESR khác nhau (Hình ). Hằng số tốc độ của các phản ứng

rất iíhẩc nhau, xấp Xí lõ M' Ế s’1 đối vổri ;Ồ% vầ 3.4 X ỈÔ^M^s'1 đốL với ÕH\
nghĩa là OH* bi bày nhanh hơn *0"2 rất nhiổu. Do dổ đế bẫy ‘CT? hiẹu quả thì
nồng độ DMPO phải cao hơn. Tuy nhiên sản phẩm của phản ứng DMPO với
‘O 2 (DMPO QOH) không bền và phân huý thành mội sơ sản phẩm, gồm
DMPO-OH, sản phẩm tương tự được tạo ra bởi phản ứng của DMPO với OH*
(Hình ). Glutathion peroxidase đã được đùng để chuyển DMPO-OOH thành

15


DMPO- OH. Tuy nhiên, sự phân hựỷ DMPO- OOH giải phổng OH", nghĩa là
thêm DMPO vào hệ chỉ tạo XJ 2 cố thể sẽ tạo ra một lượng nhỏ OH'.

Hình 1. Các phán ứng của bảy spin DMPO với các gốc superoxide, hydroxyl
và ethanol. Sơ dổ minh họa sự khấc nhau cơ bản giữa phổ ESR cửa các sản
phẩm cộng hợp DMPO-OIỈ và DMPO-ỌOII.
Một sứ giải pháp với vấn đề này, Nếu tín hiệu DMPO-OH quan sát được là
do DVĩPO bẫy OH\ thêm lượng dư ethanol có thể làm mất tín hiệu trên.
Ethanol dọn OH‘ và cạnh tranh với DMPO; ở hàm lượng đủ lớn, nó ngăn chặn
không cho bất kì OH’ nào phản ứng với DMPO. Hơn nữa, phản ứng của
elhanol với OH“ tạo ra gốc hvílroxyctliyl (Hình 1), gốc này phản ứng với
DMPO tạo ra một gốc mới có phổ ESR khác biệt. Phổ này xuất hiện như tín
hiệu OH* đã bị mất. Tuy nhiên, nếu tín hiệu DMPO-OH xuất hiện do sự bẫy

lố


và sự phán huv của phức DMPO-OGH, ihi ethanol không thể phá huỷ nó
được vì nó không dọn gốc 'O 2 ■
2.12-Phái hiện gốc Hydroxyỉ (Oiỉ •) [11] [12]

Ngoài phương pháp phát hiện OH’ bằng bầy spin và ESR, còn có các
phương pháp bẫy khác:
2. ỉ 2.1- Hydroxyl hoá các hợp chất thơm
Sản phẩm ban đẩu của sự tấn cồng OH’ trên các hựp chất Lhưm là các gốc
tự do và cuối cùng tạo các sản phẩm hydroxvl hoá. Phản ứng hyđroxyl hoá các
'hựp chất ihỡm dẫ đữợc sử dụng để phất hiện OH' bằng cấch do cắc sấn phẩm
hydroxyl tạo thành. Chứng có thế được đo bằng các thiết bị đo mầu, nhưng
các phản ứng tạo màu thường khồng thể phát hiộn tất cả các dạng đổng phrin
hydroxyl và do đó là phương pháp bán định lượng. Lý tưởng là nôn tách các
sản phẩm khác nhau bằng phương pháp sác ký khí(GC) hoặc phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao( HPLC) và được đo bằng detector điện hoá, quang phổ
hu^nh quang, phổ khối hoặc những phản ứng tạo màu đơn giản. Ví dụ, tách
bằng HPLC kết hợp với delector điện hoá nhạy đã đưực sử dụng dể đo các sản
phẩm tạo thành bởi sự tấn còng của OM’ trên các hợp chất thơm, là một
phương pháp nhạy dể đo OH' dược tạo thành hởi các tế bào, các bào quan.
Phải lựa chọn các hợp chất thơm phát hiện OH* phù hợp ( các ‘dctcctor’), sử
dụng phổ biến là salicylat. Sự tấn công của OH 4 trên salicylat(2h y dro

X

y be n zoat) tao ra hai sản phẩm hydroxyl hoá(2,3- và 2,5-

dihydroxybenzoat),và một lượng nhố sản phẩm decarboxyl hoá là catechol.
Kỹ thuật hydroxyl hoá phcnylalartin được dùng đổ đo sự tạo thành OH" do
thiếu máu cục bộ cơ tim- tái tưới máu trong cơ thể. Sự tấn công của OH' trên
phenylalanin tạo thành ba sản phẩm dihydroxyl hoá.
2.1.22- Phương pháp deoxyrihose
Sự tấn công của C)H’ vào phần tử dương 2-deoxyribose tạo ra rất nhiều sản
phẩm khác nhau. Một số mảnh sản phẩm khi bị đun nóng ở

17


hựỷ tạo thành dạng malonaldehyd(MDA), chát này có thể được phát hiện bằng
cách thêm acid Utiobarbituric(TBA) vào hỗn hợp phản ứng , kết quả là lạo ra
chất có màu hồng (TBA)2- MDA. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện
sự tạo thành OH*
ị)o hảng sộ'tốc độ
Một ứng dựng khác của phương pháp deoxvribose là đo hằng số tốc độ các
phản ứng của của OH'. OH' được sinh ra từ hỗn hợp gồm acid ascorhic, H 20?
và sắt EDTA. Rất kì gốc OH’ nào khồng bị dọn bởi phức sắt -EDTA thì sẽ tấn
Gông decẴyrtas tạo thành ehấl phản ứng với TBA(TBARS): Khi thêm bất hì

chất dọn gốc OH‘ nào đểu cạnh tranh OH‘ vói deoxyribose và ngan chặn sự
tạo thành TBARS. Có thể sử dụng một đ6 thị cạnh tranh đơn giản đổ tính hằng
số tốc dộ dọn gốc OH \
Ngoài những phương pháp đã trình bày ở trên còn có các phương pháp
khấc phát hiện các gốc hydroxyl được tóm tắt trong phụ lục 1.
2.13-Phát kiện Superoxyd ỰO~2) [11] [12]
Ngoài bầy spĩn DMPO kết hợp với ESR là một phương pháp phái hiện ‘O i
hiệu quả ( mục 2.1.1), các bẫy spin khác cũng được sử dụng. Những chất phát
hiện có khả năng phát huỳnh quang như lucigenin được sử dụng rộng rẫi để
phát hiện sự tạo thành

*cr2

bởi các thực bào. nhưng dẻ tạo ra sự giả mạo.

Thống thường, *cr2 được phát hiện bởi khả năng khử cytochrome c hoặc
nitrobỉue tetrezo]ìum(NBT). Về mặt hoá học, phản ứng khử cytochrom c đơn

giản hơn phàn ứng khử NBT
Cytochrome c-Fe(UĨ) + ’0_2 —> 02 + cytochiome oFe2+
Tưy nhiên, nhiểu chất khác cũng có thể khử cytochrome c (đặc biệt
ascơrbate và các thiol) gủy cản trử việc phái hiện ‘O 2 . Khắc phục bằng sử
dụng một ‘điện cực *0~ 2’ để đo sự khử cytochrom c. Thông thường thêm SOD
để thấy sự khử gián tiếp của ’0"2. Sự khử NBT diẽn ra phức tạp hơn, và '0“2

18


có thể được sinh ra trong quá trình khử. Do vậy việc thêm NBT vào một hệ
sinh học không tao ra *0~2 nhưng có thể khử N BT có thể tạo ra sự giầ phát
sinh *0~2.
Một số phương pháp dể phái hiện ’0~2 trong mô: ví dụ làm ngập mô với muối
tetrazolium có thể dãn tới tạo kết tủa formazan quan sát được dưới kính hiển vi
tại vị trí mô sinh ra 'O '2.
2.1.4-

Phát hiện nitric nxid (NO’) [11] [12]

Nitric oxiđ liên quan đến nhiổu quá trình sinh lý và bệnh lý, do đố có
nhiều phương pháp phát hiện nó. Các phương pháp bẳy trực tiếp, bao gổm các
phản ứng của NO* với các bảy spin, các hợp chất hem, các phức hạp kim loại
khác, hoặc ozon (phụ lục 2). Một phương pháp khác chứng tỏ có NO’ trong
một quá trình nếu quá trình đó bị ức chế bởi các chất ức chế enzym nitric
oxide synthase (NOS). Một phương pháp khác là do sản phẩm CUỐI cùng của
NO*, phổ biến nhất là đo NOj' bằng test Griess bởi thiết bị đo màu. Sự oxy hoá
NO’ trong dung dịch tạo ra sản phẩm chủ yếu NO-,’.
4NO* + 02 + 2HaO —»■ 4N 02’ + 41 r
2.1.5-

Phát hiện peroxynừrừ (ONOO ) [11] [12]

* Oxy hoá thuốc nhuộm dihydrcrkodamin(DHR): ONOO oxv hoá DHR
thành rhodamin 123, chất này phát huỳnh quang ỏf 536nm khi được chiếu sáng
ở 500rim, Ouá trình oxỵ hoá này không cần ịon kim ]oạị yà không hị ức chế
bởi các chất dọn gốc OH\ nhưng có thể bị ức chế 60% bởi HC0 3‘ !OOmM(
chất này phản ứng với ONOO). Quan sát sự oxy hoá của DHR 123 dược tiêm
vào chuột bị shock nội độc tố hoặc bị xuất huyết, sự oxy hoá giảm di khi cho
uống các chất ức chế NOS. Superoxvd, NO', và H 202 không oxy hoá
DHR123. Các gốc hydroxyl cổ khả năng oxy hoá được nhưng bị cản trử bởi
các chất dọn gốc OH\ Tuy nhiên hỗn họp H-,0-7 peroxidase và HOC1 cũng có

19


thể oxy hoá DHR. Do vậy sự oxy hoá DHR khổng phải là dấu hiệu duy nhất
nhận biết ONOQ . Do đó cần kicm soát cẩn thận.
* Phương pháp nitro hoá: ONOO nitro hoá rất nhiều các hợp chất thơm
gồm các acid amin tyrosin, tryptophan và phenyỉalanine, trong đó chú ý đến
tyrosin. Quá trình nitro hoá phụ thuộc ONOO được thúc đẩy bằng cách thềm
ion Fe(III) hoặc Cu2+ và một số metalloprotein, gồm CuZnSOD, MnSOD. Sự
nitro hoá các tyrosin có thể đuạc đo bàng phưrmg pháp quang phổ( 3nitrotyrosin có màu vàng ở pH kiồm), hoặc bằng cách phan Lích ami.no acid
sau khi thủy phận protcin. Các phương pháp sắc ký khí, phổ khối, HPLC vội
phố hấp thụ hoặc detector điện hóa cũng đã được sử dụng. Detector điện hoá
(có đô nhạy cao) phát hiện dẽ hơn nếu tyrosine trong các mầu sinh học bị khử
trước tiên thành aminotyrosin, chất nàv bị oxy hoá ở điện áp thấp hơn nhiều
bằng cách thôm các tác nhân khử mạnh dithionite. Aminotyrosin, không giống
nitrotyrosiii, có một phổ huỳnh quang đặc trưng.
*Mộỉ phương pháp khắc là sử dụng kháng thể dơn dòng hoặc da dòng trực

tiếp kháng lại các proteín bị nitro hoá. Mặc dù ít dùng để định lượng hơn các
phương pháp trên, phương pháp này có ưu điểm là cho phép xác định vị trí các
protein đã bị nitro hoá trong các mô.
2J.6-Phát hiện dạng cior hoá(UOC[) [11] [12]
Phương pháp taurine: dựa trên sư biến dổi laurine thanh taurme chloramĩne

Taưriii-NH? + HOƠ -4 ĩâurin-NHCl + H.,0
Taurin chluraminC gỉống HOCI) oxy hoá acid lhionitrobcnzoic có màu vàng
thành sản phẩm không màu, 5,5 -dithiobỉs(2-nitrobenzoic acìd) (DTNR, thuốc
thử Ellmun) .Quá trình clor hoá monochlodimedon thành đíchlodimeđon, với

sự mất hấp thụ à 290nm, đã được sử dụng để đo sự tạo thành HOC1 bửĩ
myeloperoxidase. Vì nói chung HOC1 phản ứng với nhiêu các phân tử sinh
học, nên nói chung các phép định lượng này khống hữu ích để đo sự tạo thành
của nổ trong cơ thổ. H0C1 clor hoá t.yrosin ở dạng tự do hoặc trong protein tạo

20


thành sàn phrim 3-elorolyrosin, sản phẩm này được coi là chất đánh dấu sinh
học cùa sự sinh ra HOC1. Tuy nhiên NQ 2C1 có Lhế clor ho á lyrosin lạo thành
các sản phẩm nitrat hoá và clor hoá, do đó hữu ích trong việc phân biệt tác
dụng của ONOO (nitro hoá), HOCl{ clor hoá) và N02Cl(cả hai loại phản ứng).
2.1.7-

Phát hiện hydrogen peroxid (HỊOỊ) L11Ị [12]

Các phuơng pháp cần phải nhậy vì tốc độ tạo thành H 20, bởi các tế bào và
các bào quan chỉ khoảng nmol/ phúi( ngoại trừ các thực bào đã hoạt hoá).
Phương pháp được sử dụng phổ biến nhát là sử đụng sự oxy hoá phụ thuộc

HUỌ^ cùa scopoỊctịn bởị horsẹradịsh peroxịdase tạo thành sản phẩm không
phát huỳnh quang. Đo sự mất huvnh quang của scopoletin à 460 nm. Đôi khi
sử dụng các cơ chất khác của pcroxidase ( ví dụ sự biến đổi của guaicol thành
một chất cố màu nâu). Superoxide có thể làm giảm hoạt tính của pcroxidasc
và có thể ảnh hưởng đến phép đo H 2OJ trong các hộ sinh ra *Oj' . Điéu này có
thể tránh được bằng cách Thêm vSOD.
Nếu một chất dọn. UnOn cản trở hệ phụ thuộc peroxidase, thì có thể sử
dụng các phép định lượng khác cho H202. Do vậy cổ thô định lượng H 3OJ
bằng chuẩn độ với kalĩ pennanganat (KMn04) đã acid hoá hoặc bằng cách đo
02 giải phóng ra ( lmol 02 tương ứng vơi 2 moi II,0.) khi một mẫu của hỗn
hợp phản ứng dược tiôm vào điện cực oxy có chứa chất độm và một lượng dư
catalase( phụ lục 3). Việc quan sát các sản phẩm trung gian có phổ cùa

oatâlâẵe đẫ được §ử dụng để định lượng §ự tạo thành H.ft trong toần bộ cấc
cơ quan của cơ thể. Catalase bị ức chế bởi aminotriazol, sự ức chế này trong
các mô động vật và thực vật cho thấy HX)2 đang được tạo ra in vivo. Mức độ
khử hoạt tính của catalase hởi aminoiriazol đã được sử dụng để định lượng sự
tạo thành H202 trong các tế bào hoặc cơ quan dã phân lập.Các thuốc nhuộm
hoá học tế bào khác nhau cho việc dịnh lượng H v02 cũng dược phát triển,
thường dựa vào khả năng của peroxidase oxy hoá các cơ chất như
cUaminobenzidin khi có mạt H20-.

21


Một số phương pháp phát hiện H ?0? trong các hệ sinh học được đưa trong
phụ lục 3.
2.1.82.1.8.1-

Phương pháp phát hiện oxy dơn bội [11] [12]

Phương pháp phát hiện trực tiếp

Sự phấn rã ‘Ch sinh ra hai kiểu phát xạ ánh sáng: ánh sáng yếu gọi là sự
phát xạ monomol tại bước sóng 1270nm và sự phát xạ dimol do sự va chạm
giữa hai phân tử ‘02, phát xạ ánh sổng ở 630nrn và 701nm. Sự phát xạ ở 1270
nm(hồng ngoại) thường dùng đổ nghiôn cứu tính chất hoá học của lO-, nhưng
đòi hỏi cần có Ịoạị detector đặc bịêt bời vì hầu hết các bô nhân quang không
nhạy cảm ở bước sổng này. Các buởc sóng của sự phát xạ dimol dẽ bị nhiỗu
bới các phán ứng phát quang khác. Bởi vậy chí những quan sát về sự phát xạ
ánh sáng chưa thể nói về ‘0-2 trừ khi có phổ phát xạ đặc trưng. Có nhiều phản
ứng hoá học tạo ra ánh sáng, ví dụ phản ứng pcroxyd hoá lipid, phản ứng
Fenlon và các phản ứng của một số loại protein hem VỚI H202.
2. ỉ .8.2- Phương pháp sử dụng cúc chất dọn gốc và cúc bẫy
Một số chất dọn phản ứng vối OH' vkhông khẳng định được sự có mặt của i02. Nhưng các sản phẩm thu được lừ
phản ứng cửa một số acid béo, cholesterol và tryptophan vói

'o, khác với sản

phẩm thu dược từ phản ứng của cùng các chất này với OH\ Iihờ vậy thỏng
qua việc phân lập và xác định đặc điểm của các sản phẩm sẽ cho phép phấn
Mệt hai leại Ệốe hối Erêri. Ví dụ, quan úỉ sẳiĩ phẩm -ỆRỆ' ,cdhydroperoxycholesrerol, được coi là một bằng chứng tốt cho sự có mạt của
l

02, 3-caroten có thể cho các sản phẩm duy nhất khi bị oxv hoá bởi '02.

2.2-Các phương pháp dấu ván tay [11] [12]
ROS và RNS phản ứng theo những cách riềng với ADN, protein, lipid và
mộl số chất chống oxy hoá khối lượng phần tử thấp( ví dụ ascorbic, urat). Do
dó các sản phẩm tạo thành được coi như những ‘dâu vân tay’ của sự tân cổng

oxy hoá. Các phương pháp này không do các dạng hoạt động ROS/RNS mà

22


đo các sản phẩm của sự tổn thương oxy hoá gây bởi ROSỊ/RNS và các sản
phẩm này phải là các chất đánh dấu đạc trưng của sự lổn thương do oxy hoá.
Và phải đảm bảo chắc chắn rằng các sẳn phẩm đươc xác đinh chỉ do sự tấn
công oxy hoá chứ không phải được tạo ra bởi các quá trình sinh học thông
thường.
2.2.1-

tìơ quá trinh peroxyd hoá lipid{POL) [11] [12]

Quá trình peroxyd hoá các lipid màng, các lipoprotein hoặc các acid béo
chưa no do sự tấn cồng của các gốc tự do tạo ra các sàn phẩm cuối: các

pẽĩexyđ liptd (LQQH); eấe diẽỉi liên hợp, MPA và aldchyd khấ£; cát khí
hydrocarbon (ethan, pentan). các isoprostan. Mồi kỹ thuật đo một sản phẩm
của quá trình POL và không một kỹ thuạt nào đo được chính xác toàn bộ quá
trình POL. Dưới đây là một số phương pháp đo các sản phẩm của quá trình

POL.
2.2.LẦ- Do sự mất các acid béo chưa no
Quá Irình peroxyd hoá lipid gây mất các acid béo chua no, do đó một cách
đưn giản dể đo tốc độ toàn phán cửa quá trình peroxyd hoá lipid là đo lượng
mất của của mồi acid béo. Hệ nghiên cứu phải được phá vỡ (ví đụ lipid được
chiết ra từ tế bào hoặc các lipoprotein) và các lipid bị thủy phân dể giải phỏng
ra các acid béo, sau đó các acid béo có thể dược do băng HPLC hoặc biến đổi
thành các sản phẩm dễ bay hơi (ví dụ tạo ester với methanol) và được tách

bâng GLC(sẫc kỹ khí- lổng). Phai rât cẵh thận đê trắnh sự pcroxvd hoắ cắc
acid béo trong quá trình thủy phân và chiết xuất, cách phổ biến là tiến hành
các phản ứng trong khí nitơ.
2.2.1.2Đo cácperoxyd lipid(LOỠH)
Một sổ phương pháp do các phương pháp peroxyd lipid được đưa ra trong
phụ lục 4.

23


2.2.1.3-

Đo sự hấp thụ uv

Quá trĩnh peroxyd hoá lipid di kèm với sự hình thành các cấu trúc dien liên
hợp với sự sắp xếp liên kết đôi- đơn- đôi. Chúng hấp thụ ánh sáng tử
ngoại(UV) trong vùng bước sóng 230-235 nm. Đo sự hấp thụ ƯV này hữu ích
như một chĩ số của quá trình peroxyd hoá trong các nghĩôn cứu trên các lipid
tinh khiết và các lipoprotein đâ phàn lăp và thuận lợi để đo giai đoạn đđu của
quá trình peroxyd hoá. Các phép do dien liên hợp thường không thể tiến hành
trực tiếp trốn các mô và dịch cơ thổ bởi sự có mặt của nhiêu chất khác cững
hấị> thu mạnh tịa

uy

như protein hem, các cỊ|Ịoj*ophyỊL các purịn và

pyrimidinc, sự bc gãy của các pcroxyd lipid cũng tạo ra một sổ hợp chất
carbonyl hấp thụ ƯV.
Có thổ lăng độ nhạy của phương pháp dicn liòn hợp bầng cách sử dụng

HPLC tách các dicn liôn hợp khác nhau hoặc áp dụng phổ đạo hàm bậc hai.
Những thay đổi trong phổ dạo hàm bậc hai theo quá trình peroxyd hoá rõ hơn
rất nhiều những thay đổi trong phổ hấp thụ

uv

đơn giản. Việc sử dụng phổ

đạo hàm bậc hai cho phép phân biột các cấu trúc dicn liên hợp khác nhau cổ
mặt.
2.2.1.4-

Đo các khí hydrocarbon

Các khí hydrocarbon là sản phàm phụ cuối cùng của qưá trinh pcroxyd
hoá, sự hlnh thành cùa chúng phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại

ehiiỹển

tiếp để *úc tấc

phân huy eấe perỡxyđ. Etỉìãh

điíỢc lậỡ

thành từ (h3)PUFAs còn pentan dược lạo thành từ (n-6)PUFÁs. Cả hai khí nay dểu có thể
dễ dàng đo dược bằng sắc ký khí. Hơi thở ra đưực dẫn qua chấl hấp phụ ử
nhiệt đô thấp (-100°C) dể hấp phụ và làm giàu các khí hydrocarbon. các chất
này sau đó được phản hấp thụ và đo bảng sắc ký khí cố đetector ion hoá bằng
ngọn lửa.

Cán phải kiểm soát cẩn thận khi thực hiện phép đo này do: Một số
hydrocarbon bị chuyển hoá ở gan do dó có thể gây ra sự nhám lãn vẻ sư thay

24


đổi lốc độ quá trình peroxyd hoá lipiđ trong cơ thổ. Một vâh đề nữa là nhicu
cột GC không tách được pentan khòi isopren, một hydrocarbon có nhiều trong
hơi Ihở cùa người là sản phẩm phụ của quá trình sinh tổng hợp choleslerol do
dó gây ra sai số dương. Không khí hít vào bị nhiễm các khí hydrocarbon sinh
ra từ các quá trình đốt cháy ví du từ các động cơ xe và khói thuốc ỉá. Sự tạo
thành các khí hydrocarbon từ các vi khuẩn trên da và trong ruột.
2.2.ỉ.5- Đo MDA bằng phtíưngpháp ucỉd tkỉobarbìturic(TBẢ) [3] [11] [12]
Phương pháp TBA là một trong nhĩmg phương pháp cổ nhất và thường
đươc dùng nhất để đo quá trình peroxyd hoá của acịd béơ; các màng. Ưu điểm
lớn nhất của phương phốp này là dễ thực hiện: chất thử nghiêm ehỉ đơn giản
được đun nóng với TBA trong môi trường acid, phức màu hồng tạo ra dược đo
quang ở (hoặc gần) bước sóng 532 tun, và nó có thể thực hiện trên các nguyên
liệu sinh học.

TRA

MDA
Phản ímg tạo phức gi ưa MDA và TBA.

MDA (malondialdehyd) là một trong cầc sản phẩm cuối cùng của quá trình
peroxyd hoá lìpid, phản ứng trong thử nghiộm TBA tạo phức màu hổng bén
với aciđ thiobarbituric MDA-(TBA)^. Trong dung dịch acid phức hấp thụ cực
đại ủ bước sớng 532 nm và phát huỳnh quang ở bước sóng 553 nm. Vì iMDA
không ổn định và do dó phải được chuẩn bị ngay trước khi phân tích bằng

cách thuý phân hoàn toàn các dẫn xuất của MDA. MDA trong các mẫu thử
còn được tạo ra phân lớn bởi sự phân huỷ cẩe peroxyđ lipid trong giai đoạn
đuri nóng với TBA trơng môi trường acid. Sự phân huỷ peroxide sinh ra cắc

25