NGHIÊN cứu CHIÉT XUẢT, PHÂN lập, TINH CHẾ LINARIN từ cây cúc HOA VÀNG

Bộ Y TẾ
LỜ3 CẢĨE ơĩl
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

Đe hoàn thành được khóa luân tắt nghỉêp, trước hết em xỉn bày tỏ
ỉòng bỉểt ơn sâu sắc tới Ts. Trần Việt Hùngy Ths, Hoàng Tuyết Nhung,
NCS Vũ Thì Nguyệt Minh, những người đã tân tình hướng dẫn và giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin gửi ỉời cảm ơn tới Ban Giám Đổc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc
PHẠM VĂN HOÀNG
Trung Ương và toàn thể cản bộ Khoa Vặt Lý Đo Lường- Viện Kỉểm
Nghiêm Thuốc Trung Ương đõ tuôn giủp đỡ và tạo điều kỉện cho em
trong quá trình thực hiện luận văn.
NGHIÊN CỨU CHIÉT XUẢT, PHÂN
Ent cũng xin chân thành gửi tờỉ cảm ơn tới Ban giảm hiêu, các thầy
CÔ trường Đai học Dược Hà Nộiy các thầy cô và cán bộ Bộ môn Vò cơ đã
LẬP, TINH CHẾ LINARIN TỪ CÂY
tận tình gỉắng dạy và giúp đỡ em trong quả trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè, những người đã
luôn động viên, khích tệ và giúp đỡ em về mọi mặt đế em có kết quả như
ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 10 thảng 05 năm 2010
Sinh viên
Phạm Vãn Hoàng

Ngưòi huóng dẫn:
AI i. Ao
\'

HÀ NỘI-2010

___


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

1
3
3
3

DANH MỤC CÁC HÌNH

3
4
4
4

ĩ

5
..5

MỤC LỤC

..ố

..6
..6
. 6

ĐẠT VẤN ĐÈ.............................................................................

..7
.9
.9
10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................

11


CHƯƠNG 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU...........................................................................................................................13

2.1.............................................................................................................................. Đối
tượng nghiên cứu..........................................................................................................13

2.2...........................................................Phương tiện nghiên cứu................................
.................................................................13

2.3....................................................................Phương pháp nghiên cứu......................
............................................................................13
CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ NGHIÊN cứu....................................................................................15

3.1.........................................................................................................................Địn

h tính nhóm chất ílavonoid và linarin.....................................................................15

3.1.1..................................................................Định tính iìavonoid trong Cúc hoa
vàng.................................................................................................................. 15

3.1.2...........................Định tính linarin bằng phương pháp sắc ký lóp mỏng (TLC)
............................................................................................................................16

3.2...............................................................Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất
..................................................................................................................................18

3.2.1................................................................................................................Chi
ết xuất ílavonoiđ toàn phàn............................................................................... .
18

3.2.1.1..........................Phương pháp chiết lạnh..................................... ,
................................................... . .......... . 18

3.2.1.2......................................................Phương pháp chiết nóng.............
...........................................................................................19

31


33.2.2.2......................................................................................... Mô tả quy trình phân
lập ................................................................................................31
3.3.3. Đánh giá độ ổn định của quy trình.................................................................. 34

3.4......................................................................................... Nghiên cứu xây dựng quy
trình tinh ché ỉinarin.......................................................................................................37

3.4.1............................................................................................................................Kh
ảo sát xây dựng quy trình tinh chế linarin.....................................................................37

3.4.2.......................................................Ọuy trình tinh chế linarin. ...............................
......................................................................................40

3.4.3............................................................................................................................Sơ
đô quy trinh tinh chê linarin .........................................................................................40
BÀN LUẬN...............................................................................................................................42


Bảng 3.1: pcết quả định tính tlavonoid trong dược liệu.........................................................15
Bảng 3.2: Kểt quả chiết xuất llavonoid toàn phần theo phương pháp chiết
lạnh..........................................................................................................................................18
Bảng 3.3: Kết quả chiết xuất ílavonoid toàn phần theo phương pháp chiết
nóng..........................................................................................................................................20
Bảng 3.4: Kiết quả định lượng linarin trong tlavonoid toàn phần.............................22
Bảng 3.5: Ket quả khảo sát độ lặp lại của quy trình chiết xuất.................................................23
Bảng 3.6: Ket quả định lượng linarin trong cẩn linarin thô sau quy trình phản
lập.............................. . ..................................................... . ........................................... ......34


DANH MỰC CÁC HÌNH

Hình 1: Cúc hoa vàng...................................................................................................... 3
Hình 3.1: sác kỷ đồ của vết linarin chuẩn và mẫu thừ2....................................................17
Hình 3,2: sắc ky đồ của hệ: C!oroform-methanoỉ-nước (5:1:0^1 >...........................,...,27
Hỉnh 3 .3: sác ký đồ của vết linarin chuẩn và vết linarin thô sau khi chạy sắc ký
cột hấp phụ.......................................................................................................................30

Hình 3.4: sác

ký đồ hệ 1............................................................................................ 33


1

Việt Nam lả một trong những nước có nền y học dản tộc phát triển từ lâu dời,
có truyền thống sử dụng các thuốc nguồn gốc dược liệu. Các vị dược liêu này có thể
đựơc sử dụng trực tiếp dưới dang các bộ phận thán, rễ, lá, hoa, quả, hạt của cây
trong các thang thuốc, hoặc dưởi dạng dịch chiết, cao khô dược liệu, rồi đưa vào các
dạng bào chế hiện đại như viên nén, viên nang, dung dịch tiêm. Các thuốc có nguồn
gốc dược liệu được sử dụng với một tỷ lệ không nhỏ tại cộng đổng, cũng như trong
các cơ sở điều trị. Bên cạnh những tru điểm đã được thừa nhận về hiệu quả điều trị
đối với một số loại bệnh, về tính an toàn khi điều trị kéo dài thì vấn đề chất lượng và
độ đồng đều chất lượng giữa các liều dùng khác nhau vẫn đang là vấn đề quan tâm
của các nhà bào chế và kiểm nghiệm thuốc. Đó cũng là một trong những điểm khác
biệt cơ bản giữa thuốc tân dược và thuốc đổng dược. Vì thế, để chuẩn hoá chất lượng
thuốc, cần phải định lượng chính xác được hàm lượng các hoạt chất có trong các vị
liệu được đưa vào sử dụng.
Linarỉn là một ílavonoid có khả năng giảm đau, hạ sốt, chống viêm đặc
biệt có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyển tiền liệt khỉ kết hợp
với acid chlorogenic. Một số nguồn dược liệu chứa linarỉn là Cúc hoa vàns, cây
mương núi, cây liễu ngư, hoa mật mông ... Linarin vẫn được coi là một họp chất
thiên nhiên vỉ hiện chưa có bẩt kì tài liệu nào công bố phưcrng pháp tảng hạp linarin
theo con đường hoá học, cách duy nhát để có được linarin là chiết xuất từ dược liệu.
Do đỏ, chúng tôi đã tiến hành thực hiện khoá luận “ Nghiên cứu chiết xuất,
phân lộp, tỉnh chế lỉnarin từ cây Cúc hoa vãng” nhằm giải quyết vấn đề tạo ra
chất chuẩn linarin phục vụ công tác kiểm nghiệm các chế phẩm chứa những dược
liệu có linarin - đây cũng là một nội dung nằm trong đề tài nhảnh của đề tài cấp nhà

nước mang mã sổ KC.10.16.02/06-10: “Nghiên cửu chiết tách, tỉnh chế một $ố


2

hợp chất thiên nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẫn phục vụ kiểm
nghiệm dược iiệu”
Mục tiêu của đề tài:

1. Khảo sát và lựa chọn quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phàn từ Cúc hoa
vàng.

2. Xây dựng quy trình phân lập Hnarỉn từ ílavonoid toàn phần của Cúc hoa
vàng.

3. Xây dựng được quy trình tinh chế linarin với độ tinh khiết > 95% đạt tiêu
chuẩn làm chất chuẩn phục vụ kiểm nshiệm dược liệu.


3

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN

1.1.

Đối tượng nghiên cúu

1.1.1.

Cúc hoa vàng

1.1.1.1.

Đặc điểm thục vật 111, [2Ị, [41, |6|, |7|, |8|, [91
Tên khoa học; Chrysanthemum irtdicum L.
Tên

đồng

nghĩa:

Chrysanthemum

procumbens

Lour.
Tên khác: Kim cúc, dã cúc, cam cúc, hoàng cúc,

Hình L Cúc hoơ vàng
Ckryscmthemum ịndicum L.

Cây thảo, sống hàng năm, hay sống dai, cao khoảng lm. Thân mọc thẳng,
nhằn, có khía dọc, phân cảnh ở ngọn. Lá mọc so le, chia làm nhiều thủy, mép có
rang cưa nhọn, không đều, mặt trên màu lực đen sẫm, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn,
có tai ở gốc.
Cụm hoa hình đầu, ở nách lá hay đỉnh cành, đường kính 1 - l,5cm, cuống dài
2 - 5cm; hoa ở ngoài hình lưỡi nhỏ, màu vàng, xếp hai vòng; hoa ở giữa hình ống,
tràng dài 2mm, không có mào lông; tràng hoa hình ống ngắn hon trảng hoa hình
lưỡi, có thùy tam giác nhọn màu vảng.
Quả bế, có mào lông.

Mùa hoa, quá tháng 10-12 cho đến tháng 5 năm sau.


4

1.1.1.2.

Phân hố và sinh thái [1|, [2], Ị4|, [6], [7], [8Ị, [9]

Cúc hoa có nguồn gốc ở vùng Đông Á: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản,
Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ân Độ. Cúc hoa được trồng làm cây cảnh, và từ lâu được
trồng làm thuốc ở Trung Quốc, Nhật Bản. ỏ Việt Nam cũng vậy, cây được dùng
lảm thuốc từ rất sớm và được trồng nhiều ở các lảng Nghĩa Trai (Hưng Yên), Nhật
Tản (Hà Nội), Tế Tiêu (Hà Tây) ...
Cây ưa khí hậu mát (10° - 35°C), độ ầm trên 80%, ánh sáng vừa phải,
thường dược trồng ở vườn, công viên, hoặc trên cánh dồng với mục đích lấy hoa
làm thuốc hay ướp chè, nấu rượu. Cây ra hoa nhiều, hàng năm, hỉếm có hạt. Mùa
đông có hiện tượng rụng lá hoặc hơi tàn lụi. Chính lúc này, người ta thường cảt bỏ
phần thân, cành, giữ lại géc để tái sinh hoặc làm giống trồng vào mùa xuân năm
sau.

1.1.1.3.

Trồng trọt và thu háỉ [2J, |6Ị, [7|, [8j, J9|

Được trồng bẳng mẩu thân, dài chừng 20cm. Mửa trồng tốt nhất là các tháng
5-6. Sau 4-5 tháng hắt đầu thu hoạch (trồng cuối tháng 5, thu hoạch tháng 9; trồng
tháng 6, thu hoạch tháng lữ - 11). Có thể trồng ngay từ tháng 3, đến tháng 6 phát
trụi bằng đi, sau đó cây lại nảy mầm, tháng 10 thu hoạch hoa nhiều và tốt hon.
Bộ phận dùng lả cụm hoa, hoa được hái vảo lúc trời khô ráo, đem xông lưu

huỳnh kỹ, xong nén chặt khoảng một đêm, khi nước chảy ra đen là dược, sau đó
phơi nắng nhẹ (khoảng 3—4 nấng) hay sáv ở 40° - 50ũ c đến khô. Nếu trời râm thì
ban đẽm phải sấv lưu huỳnh, Bâo quản ở chỗ khô ráo.

1.1.1.4.

Thành phần hóa học Ị4Ị

Trong Cúc Hoa có chứa tinh dầu, carotenoỉd, các acỉd amin, vỉtamin A,
Aavonoìd và một số loại sesquiterpen.


5

-Tinh dầu:
bomeoỉ,

a- pinen, P- pinen, sabinen, myeren, cineo], chrysanthenon,

chrysanthetriol,

linalyl

acetat,

germacren

D,

nerolidol,

Ỵ-

cadinen,a-

selinen, caryophyllen, mourolol.
-Carotenoid: chrysanthemoxanthin
-Sesqiũterpen:

arteglasin A, yejuhua lacton, handẹlin, chrysetunon,

cumambrin A, angeloyỉajadin, tuncíulin.
-Flavonoid:

linarin,

luteolin-7-Obeta-D-glucopyranosid,

acacetin-7-O-ỊTD-

galactopyranosid, chrysanthemin. Chrysanthemin là sắc tố của hoa C21H20O11. Khi
thủy phân sẽ được glucose và cyanidin C15H1ỊƠ6.
-Thành phần khác: indicumenon, sitosteroỊ a- amyrín, friedelin, sesamin,
adenin, cholin, stachydrin và vitamin A.
1.1*1.5.

Tác

dụng,

công

dụng

ỉ.1.1.5.1. Tác dụng
Cúc hoa có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải
cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [4].
Cúc hoa có nhiều tác dụng được lý như tác dụng chổng viêm, chổng oxy hóa,
chống gốc tự do, kháng khuẩn, hạ huyết áp và có hoạt tính gây phản vệ.
Cúc hoa có tác dụng chổng viêm thực nghiệm trên chuột cổng tráng [4]. Dịch
chiết Cúc hoa có khả năng chống viêm, ức chế miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế
bào, đồng thời còn cỏ hoạt tính của bạch cầu don nhân làm sáng mắt [10].
Theo Jiang H và cộng sự, C.inđicum có khả năng ức chế quá trình peroxy
hóa lipid, và có thê tác dụng này liên quan vóỉ chúc năng bảo vệ gan của
C.imdicum [15]. Ngoài ra trong 12 thảo dược Trung Quốc dùng để điều trị bệnh gút,
dịch chiết methanoỉ của Cúc hoa có hoạt tính ức chế xanthin oxidase mạnh thứ hai.
Như vậy, tác dụng điều trị bệnh gut phần nào là do hoạt tính ức chể Xanthin
oxida&e [16].


6

Hai

Flavanon

glycosỉde

mới

((2S)-

SL

(2R)-eriodictyol“7-0-6»D-

glucopyranosidurronic) trong Cúc hoa cố hoạt tính ức chế aldose reductase ở thủy
tinh thể chuột nhắt trắng [21],
Tinh dầu cất từ nụ Cúc hoa, đã được thử trên các chủng vi khuẩn
Dipỉococcus

pneumonia,

Streptocũceus

haeỉnọỉyticus,

Streptococcus

/aeclis,

Bacilỉm pyocyaneus, E.coỉì, Kỉebsìeĩỉa pneumonia. Kêt quả cho thây tinh dâu này
có tác dụng kháng khuẩn khá mạnh [4],
Phân đoạn etylacetat (từ dịch chiết methanol) có tác dựng ức chế sản xuất
nitơ oxyd (NO) trong đại thực bào bị hoạt hóa bởi tipopolysaccharid [34].
C.indicum gây dị ứng tiếp xúc trên chuột lang [13], có thể do sự có mặt của
các hợp chất terpenic [23], Arteglasin A có trong Cúc hoa có hoạt tính gây phản vệ
trên da chuột lang và gây viêm da dị ứng tiếp xúc ở người [4].

1.1.1.5.2. Công dụng

Cúc hoa thường được dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não, viêm
mủ da, viêm vú, chóng mặt, nhức đầu, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nước
mắt, viêm gan, kiết ly. Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rấn cắn, chấn thưcmg bầm
dập [4].

1.1.2.
1.1.2.1.

Linarin
Nguồn gỗc

Linarine là một ílavonoid, thuộc nhóm ilavon, là một sản pham tự nhiên được
phân lập chủ yểu từ cây Linarine sp.

1.1.2.2,

Tính chất


7

Công thức phản tử: C28H32OỊ4
Tên

khoa

học

theo

hệ

thống

PTL: 592,54
IUPAC;

7-((6-0-(6-Deoxy’alpha-L-

mannopyranosyl)-beta-D-glucopyranosyl)oxy)-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)“
4H-benzopyran-4-on.
Tên
rutinosiđe;
rhamnoside;

gọi

khác:

Buddleoside

linarigenin-glucoside;
buddleoílavonoloside;

(Dược

điển

Trung

Quốc),

acacetin-beta-

5,7-dihydroxy-4f-methoxyflavone-D-glucosido-L5,7-Dihydroxy-4'-methoxyílavone,

80,7-0-

Rutinoside; Acaciin; Linaric acid.
Linarin là chất kết tinh, màu trắng ngà, nhiệt độ nóng chảy từ 268°C- 270°c,
fff]D26-100° (0,07g trong 10 ml acid acetic đặc); [&]D24-870 (0,05g trong pyridin).
Thực tế không tan trọng nước vả các dung môi thông thường, tan trong nỉtrobenzen,
phenol, anilin, pyridin, methanol nóng, aciđ và base đặc [23].
Dược đỉẻn Truna Quốc quy dịnh hàm lượng linarin trong Cúc hoa không
dưới 0,8%,

1,1.2.3. Tác dụng
Linarin có tác đụng giảm dau và chống viêm. Tác dụng này phụ thuộc liều.
Nghiên cứu cho thấy linarin có tác dụng chống viêm mạnh hơn pectolinarin và
indomethacin nhưng tác dụng giảm đau lại kém pectolỉnarin (pubmed 8). Trong
nghiến cứu tác dụng của linarin trên đại thực bào của chuột, cho thấy Hnarin có thể
ức chế sự sản sinh hai loại cytokine là IL-1 và TNF-a, (cytokine là sản phẩm phỏng


8

thích của đại thực bào). ỈL-1 có tác dụng hoạt hóa tể bào nội mồ mạch máu, hoạt
hòa các tế bảo lympho, gây tản thưong tồ chức tại chỗ tạo điều kiện cho các tế bào
thực hiện miễn dịch đi vào các vùng nảy. TNF-ct có tác dụng hoạt hóa tế bào nội mỏ
mạch máu và tăng tính thấm thành mạch. Hiệu ứng này làm tăng các IgG, bổ thể và

các tế bào đi vào tổ chức gây viẽm cưc bộ. TNF-a còn có tác dụng toàn thân như
gây sốt, huy động các chất chuyển hóa và gây sốc. Linarin có thể ngăn chặn sự sản
sinh TNF-ct bởi đại thực bào ở liều nào phụ thuộc từng người. Tuy nhiên* vởi TL-1
không bị ảnh hưởng nhiều.
Linarin còn có tác dụng kìm hầm sự sản xuất nitơ (II) oxyd (NO). Sự sản
xuất NO với một lượng lớn gây ra giãn mạch và hạ huyết áp ở sốt nhiếm trùng.
LinarẼn được phát hiện là có thể ngăn cản việc sản xuất NO trong lipopolysaccharid.
Linarin giống như một thuốc mởi hữu hiệu để điều trị nội độc tó vả chứng viêm do
sản xuất dư thừa NO [12].
Một số nghiến cứu cho thấy linarin cỏ tác dụng điều hòa huyết áp. Ngoài ra,
linarin có tác dụng ức chế sự phát triển của te bảo ung thư tiền liệt tuyến khi kết hợp
với acid chlorogenic. Ba ílavonoid thuộc nhỏm ílavon là acacetin, linarin và linarin
acetat có liên quan về cấu trúc. Trong đố, acacetỉn có tác dụng ức chế tế bào ung
thư tiền liệt tuyến mạnh nhất. Tác dụng của nó sẽ giảm khi thay nhóm đisaccarid
rhamnose ở C7 (lianarin) hoặc thêm nhóm acetyl vào linarỉn (ỉinarin acetat) [14],
[28].
Linarin có tác dụng giảm đau, hạ sốt. Tác dụng này tuorng tự như
paracetamoỉ, tuy nhiên phải dùng ở liều 100 mg/kg và có tác dụng tốt hơn
paracetamol ở liều 200 mg/kg [18].
Linarine có tác dụng ức chế chọn lọc acetylcholine phụ thuộc liều [22], bảo
vệ và phục hồi những thương tổn do bức xạ mặt trởi [26]. Linarine có tác dụng
chống amip. Ngưỡng tác dụng biển thiên từ 31,25ịig/ml đến 4mg/m! [24]. Linarine


9

có tác dụng an thần và tăng cường giấc ngủ. Tác dụng này là do ức chế thần kinh
trung ương, tác động trực tiép trên receptor GABA và aglycon tương ứng sẽ không
hoạt động [11]. Linarine còn có tác dụng chống virus cúm [27].

1.2.

Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế

1.2.1,

Phương pháp chiết xuất [3].

Không cỏ một phương pháp chung nào để chiết xuất các ỉlavonoid vì chúng
rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ. Các ílavonoid
aglycon thường dễ tan trong các dung môi kém phân cực, các Aavonoid glycoside
đo có phần đường nẽn thường dề tan trong các dung mõi phân cục. Các ílavonoid
dẫn chất ílavorụ ílavonol có nhóm -OH phenoỉ nên tan được trong dung dịch kiềm
loãng, ta có thẻ dựa vào đó để chiết xuất.
Nước và con ở các nồng dộ khác nhau thường chiết được phàn lớn các
ílavonoid, Hỗn hợp chloroíbrm và cồn hay dừng để chiết các dẫn xuất methoxy
llavonoid.

Các

chất

anthocyanin

thường

kém

bền

vững,

nhất

là

các

acyl

anthocyanin do anthocyanin dược acyl hoá với các acỉd aliphtalic. Do đó người ta
thường chiết bằng methanol có mặt các acid yếu như acid acetic, acid tartaric, acid
citric thay vì acìđ ciohydrỉc. Ta cũng có thể dùng một lượng nhỏ acid mạnh nhưng
dễ bốc hơỉ là acỉd trỉluoroacetic (0,5-3%) để chiết các polyacylanthocyanin phức tạp
vì acid này dễ dàng bay hơỉ trong quá trình làm đậm dặc dịch chiết.
Thông thường để chiết các ílavonơid glycoside, người ta phải loại các chất
thân dầu bằng ether dầu hoả, sau đỏ chiết bằng nước nóng hoặc methanơl hoặc
cthanol hoặc hỗn hợp chloroform và ethanol. Dịch chiết được làm đậm dặc bằng
cách làm bay hơi dung môi dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70 °C). Đối với các
chất

dễ

bị

biến

dổi

thuộc

glvcoside thì nên làm đông khô.

nhóm

ílavan-3-ol,

anthocyanin,

llavanon,

chalcon


10

1.2.2. Phuong pháp phân lập [3], Ị27|.
Để phân lập các hợp chất tự nhiên người ta cỏ thể dùng các phương pháp: sắc
ký cột, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng điều chế. Phương pháp thông dụng nhất là
sắc kỹ cột. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay dùng là bột polyatnid, celloluse,
silicagel, magnesol, polyvinylpyrolidon.
Silicagel dùng để tách các chất ílavon, ílavanon, isoílavon, methyỉ và acetyl
ílavon và llavonol, dùng dung môi khai triển là chloroíorm vả hỗn hợp chloroíbrm
với ethvl acetat hoặc ether hoặc benzene và hồn họp benzene với ethyl acetat hay
methanol.
Polyamid dùng để tách tất cả các loại ílavonoid, dung môi khai triển dùng
ethanol hoặc mcthanol với độ cồn giảm dẩn hoặc một số hỗn hợp dung môi khác.
* Lựa chọn dung môi rửa giải dựa vào sắc ký lớp mỏng. Cụ thể khi muốn tách
một chất A ra khỏi hỗn họp, ta tiến hồnh chạy sắc ký lớp mỏng, một hệ dung mỏi
được dùng làm làm pha động khi chúng có khả năng phân tách vết chất A ra khỏỉ

các vét chất khác trong hỗn họp llavonoid toàn phan,
Ngoài điều kiện trẽn là điều kiện quyết dinh, ta lựa chọn hệ dung môi làm pha
động còn dựa trên khả năng hoà tan chất A của hệ dung môi và hệ số Rf
+ Khi hệ duns, môi hoả tan tốt chất A, chất A sẽ dễ dàng được phân tách
thành lớp chất riêng và được rửa giải ra khỏi cột. Nếu khả năng hoà tan chất A của
hệ dung môi kém, ta sẻ phải tốn nhiều dung môi mới có thể phân lập được nó ra
khỏi ílavonoid toàn phần, đồng thời trong quá trinh phân tách, chất A được làm
giàu thành lớp riêng trong cột dễ dẫn tới hiện tượng quá bão hoà và dễ bị kết rủa
trong cột, không thể tách ra khỏi cột.
+ Hệ số Rf được coi là tối ưu ỉ à khoảng từ 0,25 đến 0,3


11

Nếu Rf quá lán, tức A sẽ [à một trong những chất ra khỏi cột đầu tiên, khi đỏ
các chât trong ílavonoid toàn phân chưa kịp phân tách thảnh từng lớp riêng biệt,
phân đoạn chất thu được thường bị ỉẫn nhiều tạp.
Nếu Rf quá nhỏ, tức A sẽ là một trong những chất ra khỏi cột cuối cùng. Do
vậy, để rửa giải thu phân đoạn chất A, ta sẽ phảỉ tốn rất nhiều dung môi.

* Nhồi hạt lên cột: Có 2 cách nhồi cột là nhồi cột khô và nhồi cột ướt
- Nhồỉ cột khô: chất hấp phụ được đưa trực tiép lên cột, sau đó mới cho dung
môi chạy qua và đợi cho cột ổn định. Cách nhồi cột như vậy ít được dùng trong sắc
ký cột vì với cách nhồi như vậy, các hạt chất hấp phụ khó phân tán đều trong dung
môi, cột sẽ khó đạt trạng thải ổn định. Cách nhồi cột này thường chỉ dùng trong loại
cột nhôi săn như cột dùng trong săc kv lòng hiệu năng cao (HPLC).

- Nhồi cột ướt: chất hếp phụ được phân tán đèu trong hệ dung môi pha động
sau đó mới đưa lên cột, như vậy cột dễ dàng đạt trạng thái ồn định. Cách nhồi cột
này thường được dùng trong sắc ký cột.

* Đưa hỗn hợp chất cần phân lập lên cột
Có 2 cách đưa hỗn hợp chất cần phân lập lên cột. Với cách thứ nhất, hỗn hợp
chất cần phân lập được hoà tan trong hệ dung môi pha dộng và đổ từ tử lên cột. Rõ
ràng cách nảy chỉ dùng được khi hệ dung mồã cố khả năng hoà tan các chất trong
hỗn hợp cần phân lập, Trong trường hợp hỗn họp chất cần phân lập tan kém trong
hệ dung môi, ta cần hấp phụ chủng lên các hạt chất hấp phụ sau đó mới đưa lên cột.
1.2.3. Phưoìig pháp tinh chế [3], [20Ị.
Cò nhiều phương pháp để nâng cao độ sạch của chất sau khi phân lập.

- Với chất có khả năng kết tinh, ta cỏ thể dùng phưong pháp kết tinh nhiều
lần trong các dung môi và diều kiện về nhiệt độ hay pH khác nhau.

- Giống như trong quá trình phân lập, ta có thể tinh chế bằng cách cho chạy
nhiều lần qua các cột sác ký hấp phụ.


12

- Ta cùng có thể tinh chế bằng sắc ký phân loại theo kích cỡ (SEC), còn gọỉ
là sắc kỷ rây phân tử hay sẳc ký ỉọc qua gel. Cách tỉnh chế này dựa trên sự khác
nhau vè kích cỡ của các phân tử các chất đe tách riêng chúng bằng cách sử dụng các
chất có kích thước ỉỗ xốp xác định làm pha tĩnh. Các phân tử có kích thước nhỏ hom
sẽ đi sâu vào trong các lỗ xốp, do đỏ bị giữ lại trong cột, chậm được rửa giải ra khỏi
cột, trong khi các chất có kích thước phân tử lớn hơn sẽ được rửa giải ra khỏi cột
nhanh hơn. Vì vậy sắc ký lọc qua gel hay dược dùng trong quá trình tinh chế.


13

CHƯƠNG 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1.

Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 2 mẫu Cúc hoa:

- Mầu 1: Mau Cúc hoa được tho hái tại Văn Lâm, Hưng Yên, theo hình thái
và theo Dược điển III là loài Chrysanthemum indicum.

- Mầu 2: Mau Cúc hoa được đặt mua, được trồng tại vùng Nộỉ Mông, Trung
Quốc.
Cả 2 mẫu đều được phơi sấy khỏ và say thô.
Nguyên lỉệu để phân lập là Bavonoid toàn phần thu được từ quy trình chiết
xuất Cúc hoa. Nguyên liệu để tinh chế là cắn linarin thô thu được từ quy trình phân
lập ỉinarỉn.

2.2.

Phuoìig tiện nghiên cứu

- Cân phân tích Mettỉer Toledo AB 204 (Viện Kỉếm Nghiệm thuốc Trung
ương)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Aeilent 1200
- Máy cất thu hồi dung môi Rotavapor của hãng Buchi
- Dụng cụ thủy tinh các loại

- Cột thiiy tinh các cỡ

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254
- Chảt chuân ỉirtarin có hàm lương: 98,3%, do Viện Kiêm nghiệm thuốc và


Mầu 1

STT

Phản ứng định tính

Kết quả

1

Phản ứng Cyanỉdin

2

Phản ứng với kiềm

+++

3

Phản ứng với FeCl3 5%

+-H-

16
15
14

Kct

-HH-

luân
■
Có

4- Định
Phảntính
ứngnhóm
với H2SO4
đặc 3: KÉT
chất Aavonoid
bầng QUẢ
phản+++
ứng
ho á học.
CHƯƠNG
NGHIÊN
cửu
Mau 2

bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng. Có
1- Định

Phảntính
ứnglinarin
Cyanidin
+-H-

linarin
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),
2- Định
Phảnlượng
ứng với
kiểmbàng phương pháp sẳc
+-H3.L Định tính nhóm chất ílavonoỉd và linarin
“ Phương
xuất1 và
ílavonoid
toàn
phẩn: khảo sát phương pháp chiết
Kết
luận: Cảpháp
2 mẫuchiết
Cúc hoa
2 đều chứa
tlavonoid.
+++
3 Phản ứng với FCC13 5%
nóng
và chiết lạnh
cáclinarin
dung môi
khác

nhau. pháp sắc ký lóp mỏng (TLC)
3.1.2.
Địnhvói
tính
bằng
phương
4 -• Phương
Phản ửng
với
H2SO4
đặc
+++ toàn phần: sắc ký cột.
pháp phân lập ỉinarỉn ra khỏi ílavonoid
*Định tính linarin tròng cả 2 mẫu Cúc hoa bẳn£ phưcmg pháp sắc ký lớp
hú ý:- +++:
Phảnpháp
ứng
dưong
rẩt rõkết
Phưong
chếtính
linarin:
tinh
nhiều
lần trong dung môi phân cực.
Định
tínhtinh
ílavonoid
trong
Cúc

hoa
vàng
c 3.1.1.
mỏng, tiến hành song song với mẫu linarin chuẩn. Điều kiện sắc ký cụ thẻ như sau:
Định tính ílavonoid trong Cúc hoa bàng các phản ứng đặc trưng của nhóm
+ Bình chạy sắc ký lóp mỏng kích thước 10 X 10 cm
chất ílavonoid: phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phán ứng với FeCỈ3 5%,
+ Bản mỏng silicagcl GF254
phản ứng với H2SO4 đặc.
+ Pha động khai triển: Cloroform - methanol - nước (5: 1: 0,1)
Tiến hành; Lắc 2g bột Cúc hoa (tiến hành với cả 2 mẫu) với khoảng lOOml
+ Thể tích chấm 10 \ú
methanol, sau dỏ đem lọc và tiến hành các phản ứng:
+ Phát hiện màu bằng hơi amoniac
- Phản ứng Cyanidin: Lấy lOml dịch lọc ở trên, thêm 5mg bột Mg, nhỏ từ từ
* Ch uẩn bị dung dịch chấm sắc ký:
ỈIC1 đặm đặc. Sau 1 đến 2 phút, duna dịch sẽ chuyển thảnh màu đỏ cam.
- Dung dịch chuẩn: pha dung dịch linarin chuẳn trong methanol có nồng độ
- Phản ứng với kiềm: Nhở 3-4 gỉọt dịch lọc ở trên lên tờ giấy thấm, rồi hơ
khoảng lmg/ml.
trên miệng lọ ammơniac, màu vàng sáng sẽ xuất hiện trên giấy thấm.
- Dung dịch thử: cân khoảng 20g bột dược liệu bình càu, cho thêm ỈOOml
- Phản ứng với FeCl3 5%: Lấy lOml dịch lọc ở trên, thêm 2- 3 giọt dung dịch
methanol. Đun hỗi lưu cách thuý trong 3 giờ, s.au đó lấy ra đem lọc ta được dịch lọc,
PeCb 5%, dung dịch sẽ chuyền thành màu xanh đen.
cất quay thu hồi dung môi thu
r được cắn. Cân khoảng ỈOmg cắn, đem hoà tan trong
- Phản ứng
với3.1:
H2SO4

đặc:định
Lấytính
1 flavonoid
Oml dịch trong
lọc ởdược
trên,liệu
thêm 2- 3 giọt dung dịch
Bảng
Kêt quả
lượng tối thiểu methanol để cẳn được hoả tan hoản toản, có thể đun nóng cách thuỷ
nhẹ dể cho tăng tốc độ tan. Tiến hành đồng thời với cả 2 mẫu Cúc hoa ta lần lượt
thu được dung dịch thử 1 vả dung dịch thử 2.
*Tiển hành sắc ký:

- Chuẩn bị 2 bản mỏng kích thước khoảng 4 X 15cm.
- Mỗi bản mỏng chấm 2 vết: bản thứ nhất chấm 1 vết linarin chuẩn và 1 vết
dung dịch thử mẫu 1, bản thứ 2 chấm Ị vết linarin chuẩn và 1 vết dung dịch thử
mẫu 2, chú ỷ đánh dấu các vết.


Dung môi

Lần

Dược liệu
(8)

Ethanol

1

109,3454

2

103.4579

Flavonoid

toàn Hàm lượng tlavonoid toàn

phần (g)
18
20
17
19
2,2637
2,1003

phần trong dưực liệu (%)
2,07
2,03

3 khoảng
105.5433
2,2002
2,08
iOQg
dược
cho

bình cầu
-Cân
Chuẩn
bị
pha
động
chạyliệu
sẩc
ký: vào
lấy chính
xác đáy
50nilbàng,
etliyl thêm
acetat,300ml
lOml dung
acid
môi.
lưu
cách
thuỷsắctrong
3 giở.
Sau dógiấy
lấy
ra sát
đemthành
lọc lấy
íormic,Tiến
lmlhành
nướcđun
chohồi

vào
bình
chạy
ký, Đê
1 miếng
lọc
binhdịch
và
70%
Trung
bình
2,06
3.2. Nghiên cứu xãy dựng quy trình chiết xuất
lọc.
Phần
tiếp
tục
được
bỉnh đun hồi lưu cách thuỷ
đợi cho
bình
hoà
dung
môi.cho vào2,2539
Ethanol
1bãbão
110,4322
2,04như vậy thêm 2 lần
90%
3.2.1.

xuất
tlavonoid
phần
nữa:
lần- Chiết
2Sau
2bình
giở,đãlầnbão
3toàn
trong
2 giờ;
300ml
Gộp cho
tất
khi
hoà
dưng
mòi,mỗi
ta lần
cho đều
bản với
mỏng
vào dung
bỉnh, môi.
theo dồi
2 trong
108,4539
2,3459
2,16
Flavonoỉd

là một
nhóm
chất
lớn,
trong
dược
lả mỏi,
hỗn
hợp
gồm
cả
dịch
lọc
thu 1107,4587
được.
Đem
cất12quav
thu
hồi
dung
môi
thu thường
được
cắn.
Cho đem
cắn hiện
vào
dung
môi
đoạn

khoảng
cm
thì lấy
ra,
đẽ
bayliệu
hơi
hết
3chay
2,3488
2,19dung
nhiều
ílavonoid
Các
ílavonoid
khác
có thu
tínhđược
chất đem
lý hoá
bình
Sohxlet
chiếtkhác
với nhau.
ether bình
dầu hoả
đẻ loại
hét nhau
chất thường
béo. cắn

sấy rất
ở
màu
bằng
hơi ammoniac.
Trung
2,13
khác trong
nhau,
do vậy
một
phương pháp chung nào để chiết xuất Aavonoid từ
60c*C
3105,5673
giờkhông
sau đócó
đem
cân.2,2310
*Kếf
quả;
Ethanol
1 vòng
2,11
100% dược
Bảngliệu.
Ke
chiết
xuất
(lovonoid
toàntỉm

phần
theo
phương
Quaí quả
tham
khảo
các
tảivếtliệu,
hiểu
về
độ tanphớp
của chiết
các nóng
Aavonoid, chúng
-3.3:
Mấu
chưân
cho
một
tròn,
màu
vàna
nhạt,
2 linarin
109,4634
2,5422
2,32
tôi nhận
thấythử
2 1dung

dùng
để ứng
chiết
nhómchuẩn.
chất ílavonoid đồng
- Mau
khôngmôi
thấyhay
xuấtđược
hiện vết
tương
với xuất
vết linarin
3
110,2402
2,4399
2,21
thời ít- độc,
tiền2 và
kiếmmột
là ethanol
Do sắc
vậy, và
chúng
tôi tiếntự hành
Mầu rẻthử
xuấtdễ hiện
vết có vả
hìnhmethanol.
dạng, màu

Rf tương
vết
Trung bình
2,21
lianrin
khảo chuẩn.
sát với 2 loại dung mõi lả ethanol và methanol ở các nồng độ và điều kiện
Methanol
1
100,3465
Hình 3. ỉ :Sắc ký đồ2,3109
cua vêt ỉìnarin chuẩn vờ mẫu2,30
thứ 2
chiết khác nhau.
2
103,4510
2,3100
2,23
70%
Khảo sát với cả 2 loại dung môi ethanol và methanol ở nồng độ 70%, 90% và
3
108,5432
2,5439
2,34
100% ở 2 điều kiện chiết xuất khác nhau là chiết lạnh và chiết nóng.
Trung bình
2,29
3.2.1.1. PhuoTig pháp chiết lạnh
Methanol
1

105,6735
2,0421
1,93
*Tỉến
hành
90%
2
104,4390
2,2544
2,16
Cân khoảng lOOg dược liệu cho vào bỉnh cẩu đáy bằng, thêm 300ml dung
3
107,4522
2,3611
2,20
môi. Đẻ yên ngâm trong vòng 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem lọc lấy dịch lọc.
Trung bình
2,10
Đem cất quay thu hồi dung môỉ thu được cắn. cẳn dược cho vầo bình Sohxlet chiết
Methanoỉ
1
103,3427
2,4980
2,42
vởi
ether
dầu
hoả
dể
loại

hết
chất
béo.
cản
thu
được
dem
sấy
cắn ờ ó0°c trong vòng
100% Bàng 3.2: Kết quả chiết xuất ịlavonoid toàn phần theo phương pháp
chiết lạnh
2
107,6734
2,5911
2,41
3 luận: 105,6544
*KÌt

2,5345

- Mầu Cúc hoa ỉ Trung
khỏngbỉnh
có linarin.

2,40
2,41

Phuoììg pháp chiết nóng
Dung 3*2*L2.-Lần
Mầu Cúc hoa 2 cô linarin.

toàn Hàm lượng tlavonoíđ toàn
liệu Flavonoid
môỉ
*TiếnDược
hành
Do vậy từ đây về sau chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu với mẫu Cúc hòa 2
phần (g)
phần trong dược liệu (%)
(g)
vá gọi chung
hoa.
Ethanol
1 ỉà Cúc
102,5231
3,4532
3,37
I' J 1
70%
2
106,3451
3,4122
3,21
3

110,3468

4,6533

Trưng bình
Ethanol

1

112,4333

4,22
3,60

3,8467

3,42

mr
AV UƯ


90%

2

109,5621

4,0053

3

109,6234

4,2122

1

3,66
23
22
24
21

Trung bình
Ethanol
100%

1

3,84
3,64

110,4376

3,4356

3,11

2- Tốc độ
109,4566
dòng: Iml/ phút.

3,7658

3,44

3,4311

3,19

3 mẫu107,6754
*Pha

Trung bình
- Dung dịch linarin
chuẩn: Linarin chuản được sấy ở3,25
50°c trong 2 giờ, dưới
Methanol
100,3233
3,6214
3,61 độ khoảng 25 pg/ml
áp suất 1giảm trước
khi dùng. Pha
dung dịch chuẩn có nồng
2
105,4222
70%trong methanol.

3,9219

3,72

3,8389
- 3Dưng 106,7623
dịch thử: Cân chính

xác khoảng 12 mg cắn 3,60
llavonoid toàn phẩn (sau
bình
3,64
khi sáy*Nhận
ờ 60°c
2 giờ)
này ílavonoid
trong 30ml
xét:trong
Từ Trung
bảng
3.2vàovàcốc
3.3 cóta mò.
thấy Hòa
hiệutan
suấtcánchiết
toànmethanol
phần
(có 2thểloại
đun
cách
thủy để
độ3,8377
tan),
vào bình
định
mức
lOOml,
tráng3.4

rửa
Methanoí
1 môi
102,3487
3,75
bằng
ethanol
và tăng
methanol
khácchuyển
nhau không
nhiều.
Tuy
nhiên,
từ bảng
90%
lần, rằng
thêmquy
methanol
vừa
đủ,dụng
lọc dung
qua mảng
lọc 0,45pm.
106,6549
4,0532
3,80 100%Tiến
tacốc
thấynhiều
rõ2 ràng

trình chiết
sử
môi methanol
cho hành
hiệu với
suất 6
mẫu được
cắn ílavonoid
ta
đượchẳn
6 dung
dịch
3 línarin103,4577
3,55suất chiết linarin của
chiết
caothuhon
các 3,6744
quy thử.
trình khác: cụ thể hiệu
thử
1,bình
2, 3,lồ4,0,25%,
5, 6 là0,27%,
mẫu Aavonoid
toàn phần
ứngDo
thu
quy trinhKý
ỉ, hiệu:
2, xdt:

3, Mau
4, 5,Trung
6 lần
lượt
0,27%, 0,30%,
0,34%,tương
0,82%.
3,70
*Nhận
được
từ
dung
môi
ethanol
70%,
ethanol
90%,
100%;
methanol
70%,
vậy
chúng
tôi
quyết
định
chọnkiện
quy
trình
sửcao
dụng

mỏikiện
methanol
và điều kiện
Methanol
110,2346
4,2761
3,88
- 1 Hiệu
suất
chiết
ở điều
chiết
nóng
hơn dung
hẳnethanol
điều
chiết lạnh.
100%
methanol
100%.suất chiết
chiết
nóng.
107,5687
4,1289
- 290%,
Nhìn methanol
chung hiệu
ílavonoid toàn phần từ3,84
Cúc hoa bằng 2 loại
Tiêm

dung
linarin
chuẩn
và
6 mẫu
dung
dịch thử vào hệ3,83
thồng sắc ký.
3.2.3.
Đánh
giá
độ
ổn định
của
quy
trình
3ethanol
103,4622
3,9622
dung
môi
vàdịch
methanol
không
khác
nhau
nhiều.
*Ketlượng
quả
*Tiến

hành ỉỉnarỉn
3.2-2. Định
trong
flavonoid toàn phần
Trung
bình

3,85

Dựa
vàokiện
diện
tích nóng,
của
các
được
ký
tính
được
hàm
Cân
khoảng
lOOg
bột
dược
liệu thu
cho
vào
bình
cầu

đáyđồ,
bàng
Lhệm
300ml
ở điều
chiết
với pic
mỗi
loại
dung
môisắc
và Hàm
nồng
độta X
khác
tiến
Mầu
m (mg)
Diện
tích trên
Sy
lượng
(%) nhau
methanol,
tiến
hành
trong
giở.
Sau
đó lấy ra

lọc gộp
lấy 3dịch
lượngchiết
ỉinarin
trong
cắn
ílavonoid
toàn
phần33theo
công
thức
hành
xuất
lặpthử
3đun
lẩnhồi
và lưu
thu
dược
mẫu
cắn
ílavonoid
toànđem
phần,
mẫu lọc.
lại.
ChuấnPhần bã tiếp tục được cho tròS lại bình cầu
và toản
đun hồi lưu như vậy thêm
2 lần nữa:

xioo
Tổng cộng ta thu 1được 6 mẫu
cán ílavonoid
1334,13 phàn tưomg ứng
6,97với 2 loại dung
X
X{%) =12,3321
m X 10
T
lần
trong
3 s~
đun trong 2 gỉờ; mỗi lần đều sử dụng 300mỉ methanol.
mô 2í ởđun
3 loại
nồng2độgiờ,
kháclần
nhau.
2
12,6321
1456,32
7,42
Trong
đó:
$r,
Sc: Diện
tích pic
của mẫu
thử và
mẫu

chuẩn
Cc =Gộp
2 2,lfig/ml
các
dịch
lọc
thu
được
ta
được
khoảng
900ml
dịch
lọc
tảng.
Dịch
lọc tổng
Ta tiến hành định lượng linarin trong các mẫu cán ílavonoid toàn
phần được
bằng
3
12,4342
1631,45
8,45
Cc: Nồng
độ thu
của được
linarinđược
chuẩn
(pg/ml)

scđem
= 3431,52
cất quay
mối. năng
cắn
cho Dược
vào
bình
chiết với
phương
pháp thu
sác hồi
ký dưng
lỏng hiệu
cao (HPLC)
theo
điển Sohxỉet
Trung Quốc
với
4
12,2308
1543,43
8,13
m: Lượng cân của ílavonoid toàn phần (mg)
ether
dầu sắc
hoảkýđể
đỉểu kiện
nhưloại
sau:hết chất béo. cắn được sấy ở 60°c trong vòng 3 giờ sau đó

12,0734
1712,09
9,13
Rp53.4:
ỉđược
8 (5Kêt
pm),
dàiđịnh
25ílavonoid
cm
quả
ìượng ỉinarin
trong/ỉavonoid
toàn phần
đem cân, từ- đóCột:
taBàỉĩg
tính
hàm
lượng
toàn phàn
chiết xuất được.
21,21
6
12,0430 - acid acetic
3965,25 46: 2)
- Pha
động:
Tiến
hành
thựcMethanol

hiện lặp- nước
quy trình trên 5(52:
lần. Độ lặp lại của quy trình được

- Bước sóng: 334 nm
ST biểu thị bàng
độ ỉệch
chuẩn toàn
tương
đối RSD. Két quả được biểu thị ở bảng 3.5.
Hàm
lượng
tlavonoid
phần
T
3.5: Kết
quả khảo sát độ ỉ ộp ỉại của quy trình chiết xuất
- ThểBang
tích tiêm:
20 fil
(%)
3,80
1
2

3,81

3

3,78

4

3,79


5

3,80

TB

3,796

s

0,0114

RS
D

0,30

*Nhận xét:
Từ kết quả khảo sát cho thấy, RSD nhỏ hau 2%, chứng tỏ quy trình chiết
xuất ílavonoid toàn phàn từ Cúc hoa vàng vừa khảo sát cỏ độ lặp lại cao.

3.2.4.

Quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phần tù’ Cúc hoa vàng

*MÔ tả quy trỉnh:
Cân khoảng lOOg bột dược liệu cho vào bình cầu đáy bàng thêm 300ml

methanoỉ, tiến hành đun hồi lưu trong 3 giờ. Sau đó ỉấy ra đem lọc lấy dịch lọc.
Phần bã tiếp tục được chọ trộ lại bình cầu và đun hồi lưu như vậy thêm 2 lần nữa:
lần 2 đun trong 2 giờ, lần 3 đun trong 2 giờ; mỗi lần đều sử dựng 300m! methanoh
Gộp các dĩch lọc thu được ta được khoảng 9O0ml dịch lọc tổng. Dịch lọc tổng được
đem cất quay thu hồi dung môi. cắn thu được được cho vào bính Sohxlet chiết với
ether dầu hoả để loại hết chất béo. sấy cắn thu được ở 60°c  trong vòng 3 giờ sau đó
đem cân, từ đó ta tĩnh được hàm lượng ílavonoid toàn phần chiết xuất được.
* Sơ đổ quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phẩn từ Cúc hoa:


25


26

3.3.

Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập

3.3.1.

Nghiên cửu lựa chọn hệ dung môi pha động

* Tiến hành
Chưng tôi đã tham khảo một số tài liệu và thấy rằng, trong phân lập các
Havonoid bàng phương pháp sắc ký cột thường sử dụng một số hệ dung môi sau

đây:

- Ethyl acetat - acid formic - nước (8:1:1)
- Ethyl acetat - acid formic - acid acetic khan - nước (100:11:11:26)
Ethyl acetat - methylethylceton - acid íòrmic - nước (5:3:1:1)

- Cloroíòrm - methanol - nước (5:1:0,1)
Tiến hành chạy sắc ký lóp mỏng với lần lượt tất cả các hệ dung môi trên với
điều kiện sắc ký cụ thể như sau:
4- Bình chạy sắc ký' lớp mỏng kích thước 10x10 cm