Xây dựng phương pháp xác định một số kháng sinh β lactam trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ VÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM
TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ VÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM
TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 60720410

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015



LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh - Bộ môn Hóa phân tích - Trường đại học Dược Hà Nội,
người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới DS. Lê Xuân Kỳ, các cán bộ Phòng phân
tích kiểm nghiệm - Viện công nghệ dược phẩm quốc gia, các thầy cô và cán bộ kỹ
thuật viên của Bộ môn Hóa phân tích- Trường đại học Dược Hà Nội, những người
đã giúp đỡ để tôi có thể tiến hành đề tài với kết quả chính xác, kịp thời.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia Bộ Khoa học và Công nghệ đã tài trợ giúp tôi hoàn thành luận văn trong khuôn khổ
đề tài số 105.08-2014.24 theo quyết định số 122/QĐ-HĐQL-NAFOSTED.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội đã
tạo điều kiện cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận văn đúng thời hạn quy
định. Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn tới toàn thể anh chị em đồng nghiệp tại Trung
tâm kiểm nghiệm Hà Nội đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ với những khó khăn
trong công việc.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và
động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 31 tháng 8 năm 2015
Học viên
Dương Thị Vân

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………...1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN…………………………………………………….3
1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu……………………………………3
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng……………………...3
1.1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu…………………………….5
1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu………………………………..7
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)…………………………………7
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ……………………………………………….9
1.3. Một số nghiên cứu về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh có trong nƣớc ở Việt
Nam và trên thế giới……………………………………………………….14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………...18
2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu………………………………...18
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn…………………………………………….18
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị…………………………………………..19
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………….20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………......20
2.2.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết
tách……………………………………………………………………….20
2.2.2. Phương pháp chiết tách β-lactam từ nước thải………………….20
2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LCMS/MS……………20
2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng……………………..21
2.2.5. Lấy mẫu, phân tích một số β-lactam trong thực tế………………..21
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu……………………………………………22
i

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………..23
3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng thời các kháng sinh β-lactam
trong nƣớc thải công nghiệp dƣợc…………………………………………23
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ…………………….23
3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu…………………………33
3.2. Thẩm định quy trình phân tích các kháng sinh β-lactam trong các nƣớc
thải nhà máy dƣợc phẩm………………………………………………….38
3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống…………………………………………..38
3.2.2. Độ đặc hiệu……………………………………………………......39
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng………………………..41
3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định………………………………..43
3.2.5. Độ đúng và độ lặp lại…………………………………………….45
3.3. Áp dụng quy trình xây dựng đƣợc để xác định dƣ lƣợng các kháng sinh
β-lactam nghiên cứu trong mẫu nƣớc thải từ cơ sở sản xuất dƣợc………...46
Chƣơng 4: BÀN LUẬN……………………………………………………..49
4.1. Về lựa chọn kháng sinh nghiên cứu…………………………………49
4.2. Về phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ……………...49
4.3. Về kết quả thẩm định phƣơng pháp…………………………………51
4.4. Về dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc
phẩm……………………………………………………………………….52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A6AP

Acid 6-amino penicillanic

A7AC

Acid 7-aminocephalosporanic

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống
(Association of Official Analytical Chemists)

APCI

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

CE

Năng lƣợng bắn phá (Collision energy)

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

ESI

Ion hóa phun điện tử

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High-performance liquid chromatography)

IS

Chất chuẩn nội (internal standard)

KS

Kháng sinh

LCMS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ khối phổ
(Liquid chromatography-mass spectrometry)

MRM/SRM

Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần

MS/MS

Khối phổ hai lần

MW

Khối lƣợng phân tử

SCAN

Chế độ thu tín hiệu toàn phổ

SIM

Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion

SPE

Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

tR

Thời gian lƣu

Spic

Diện tích pic

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các β-lactam nghiên cứu
Bảng 1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
Bảng 3.1. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên
cứu
Bảng 3.2. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa
Bảng 3.3. Điều kiện khảo sát pha động và kết quả
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết SPE của các kháng sinh
Bảng 3.5. Tổng hợp điều kiện phân tích và xử lý mẫu của các kháng
sinh nghiên cứu
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LCMS/MS
Bảng 3.7. Kết quả xác định LOD và LOQ của các kháng sinh
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của các kháng sinh nghiên
cứu
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp
Bảng 3.10. Kết quả phân tích xác định nồng độ kháng sinh trong các
mẫu thử

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức chung của Penicilin
Hình 1.2. Công thức chung của cephalosporin
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
Hình 3.1. Phổ đồ của các kháng sinh ở điều kiện nghiên cứu
Hình 3.2. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát cột
Hình 3.3. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát chƣơng trình pha
động
Hình 3.4. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát tốc độ dòng pha động
Hình 3.5. Sắc ký đồ các 6 kháng sinh β-lactam khảo sát thể tích tiêm
Hình 3.6. Độ thu hồi của các 6 kháng sinh β-lactam sử dụng với các dung

môi rửa giải khác nhau
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu tự tạo thể tích 100ml (a) và 200ml (b)
Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn
của các kháng sinh nghiên cứu
Hình 3.9. Sắc ký đồ của các kháng sinh phân tích ở nồng độ LOQ

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng kháng sinh luôn là một vấn đề đƣợc nhiều ngƣời quan tâm và
cũng là một thực trạng mà xã hội hiện nay đang phải đối mặt. Có nhiều
nguyên nhân gây ra tình trạng trên và một trong những lý do đó là sự tồn dƣ
của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trƣờng. Vì chỉ
một lƣợng rất nhỏ kháng sinh có mặt trong môi trƣờng sống cũng giúp vi
khuẩn sinh ra những gen kháng thuốc. Hƣớng nghiên cứu về dƣ lƣợng thuốc
kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng nhƣ tác động của chúng trong
môi trƣờng đƣợc bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20 và rất
đƣợc quan tâm tại các nƣớc phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng
sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trƣờng
nƣớc đã trở nên phổ biến [8], [28].
Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát
nồng độ kháng sinh thải ra môi trƣờng tại các cơ sở sản xuất dƣợc phẩm
cũng cần đƣợc quan tâm. Hiện cả nƣớc có khoảng gần 200 doanh nghiệp có
sản xuất dƣợc phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại: kháng
sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và vitamin… Trong đó,
kháng sinh nhóm β-lactam rất đa dạng và có phổ kháng khuẩn rộng trên cả
vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang đƣợc chỉ định rộng rãi trong việc điều
trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nƣớc ta. Theo thống kê của Cục quản lý dƣợc,
từ tháng 1 năm 2010 đến tháng 4 năm 2015, cả nƣớc có khoảng trên 1000 số

đăng ký của các kháng sinh β-lactam với khoảng 50 nhà máy sản xuất [7].
Các chế phẩm kháng sinh β-lactam hiện đang đƣợc sản xuất ở nƣớc ta có
nhiều dạng bào chế khác nhau nhƣ: thuốc tiêm, viên nén, viên nang, bột pha
hỗn dịch uống…. Có thể nói, đây là nhóm kháng sinh đƣợc sản xuất với số
lƣợng và đa dạng nhất hiện nay ở nƣớc ta. Các nhà máy sản xuất các kháng
sinh này đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nƣớc thải
1


sau sản xuất. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dƣ kháng sinh nhóm β-lactam
vẫn chƣa đƣợc quan tâm và chƣa có yêu cầu của cơ quan Nhà nƣớc về giới
hạn nồng độ của các kháng sinh trong nƣớc thải của các nhà máy sản xuất
này. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam mới có một vài nghiên cứu xác
định dƣ lƣợng một số kháng sinh trong nƣớc thải bệnh viện và nƣớc thải từ
cơ sở sản xuất dƣợc.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng
phƣơng pháp xác định một số kháng sinh β-lactam trong nƣớc thải nhà
máy dƣợc phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu nhƣ sau:
1. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định đồng thời dƣ lƣợng một số
kháng sinh nhóm β-lactam (06 kháng sinh: amoxicilin, cefaclor, cephalexin,
cefadroxil, cefotaxim và cefixim) trong nƣớc thải từ cơ sở sản xuất Dƣợc
bằng LCMS/MS ở nồng độ ppb.
2. Ứng dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để đánh giá dƣ lƣợng một
số kháng sinh nhóm β-lactam có trong nƣớc thải từ cơ sở sản xuất Dƣợc
trong nƣớc.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
Kháng sinh β-lactam gồm 2 nhóm lớn là Penicilin và Cephalosporin.
a. Kháng sinh Penicilin:
 Công thức chung của Penicilin:

Hình 1.1. Công thức chung của Penicilin
Penicilin là dẫn chất acyl hóa của acid 6-amino penicillanic (A6AP),
cacbon bất đối C(2) có cấu hình S, trong khi C(5), C(6) đều có cấu hình R.
Cấu hình này đóng vai trò quan trọng cho hoạt tính của các Penicilin [9].
b. Kháng sinh Cephalosporin:
 Công thức chung của cephalosporin
R2 H

R1

NH

H

S

H

O

N
R3

O

HO

O

Hình 1.2. Công thức chung của cephalosporin
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), dạng cấu trúc

3

-cephem,

3

mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –

lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.

3


Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và
hầu nhƣ là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá
mạnh [9].
c. Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nghiên cứu:
Các kháng sinh β-lactam nghiên cứu đƣợc phân loại dựa trên nguồn
gốc và phổ tác dụng của chúng. Đặc điểm của từng nhóm đƣợc thể hiện ở
bảng 1.1
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các β-lactam nghiên cứu [6], [9], [11]
Thế hệ

Penicilin

Tên đại diện
Amoxicilin

nhóm III

Phổ tác dụng
- Nguồn gốc bán tổng hợp. Phổ tác dụng rộng
trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém
Penicilin và hầu nhƣ không có tác dụng với các
vi khuẩn tiết ra β-penicilinase.
- Trên vi khuẩn Gram (-), có tác dụng trên cả vi
khuẩn ƣa khí và kị khí nhƣ: Escherichia coli,
Enterococci, Salmonella, Shigella

Cephalos Cephalexin,

- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi

porin thế

khuẩn Gram (+) nhƣ tụ cầu, liên cầu, phế cầu

Cefadroxil

hệ I

(trừ liên cầu kháng methicillin).

- Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn
Gram (-) nhƣ E.coli, Kebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis và Shigella.

Cephalos Cefaclor

- Phổ tác dụng tƣơng tự nhƣ thế hệ I. Tuy nhiên

porin thế

tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn

hệ II

tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) (Klebsiella, H.
influenza…) mạnh hơn thế hệ I.

4


Cephalos Cefixim,

- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-)

porin thế

- Thuốc bền vững với β-lactamase và đạt đƣợc

Cefotaxim

nồng độ diệt khuẩn trong dịch não tủy, tác dụng

hệ III

trên cả P. aeruginosa.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém
Penicilin và cephalosporin thế hệ I.
1.1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu
Bảng 1.2. Đặc tính của các β-lactam nghiên cứu [5],[9],[14]
Tên chất

CTCT, CTPT, MW

1. Amoxicilin

Tính chất vật lí
- Bột tinh thể màu trắng
- Khó tan trong nƣớc, alcol,
thực tế không tan trong ether,
chloroform, dầu

CTPT: C16H19N3O5S

- Tan trong các dung dịch acid

MW: 365,4

hoặc hydroxyd kiềm loãng
- Bị phân hủy nhanh ở độ ẩm
cao và nhiệt độ trên 37oC

- pKa lần lƣợt là 2,4; 7,4 và 9,6
- Bột kết tinh trắng, hơi có

2. Cephalexin

mùi lƣu huỳnh
- Ít tan trong nƣớc, không tan
trong ethanol 96%, ether
CTPT: C16H17N3O4S

- Tan trong các dung dịch

MW: 347,4

kiềm loãng
- pKa1 = 5,3 và pKa2 = 7,3

5


- Bột màu trắng hoặc gần nhƣ

3. Cefadroxil

trắng.
- Khó tan trong nƣớc, rất khó
tan trong ethanol 96%.
CTPT: C16H17N3O5S

- Độ tan trong nƣớc: 0,339 g/l.

MW: 363,4

- pKa1 = 3,45; pKa2 = 7,43

4. Cefaclor

- Bột kết tinh màu trắng hoặc
hơi vàng
- Khó tan trong nƣớc, thực tế
không tan trong methanol và
dicloromethan

CTPT: C15H14ClN3O4S

- pKa = 8,03

MW: 367,8

5. Cefotaxim

- Bột màu trắng hoặc trắng ngà

natri

- Dễ tan trong nƣớc, ít tan
trong methanol, thực tế không
CTPT: C16H16N5NaO7S2

tan trong ether

MW: 478,5

- pKa = 3,75
- Bột trắng hoặc gần nhƣ

6. Cefixim

trắng. Ít tan trong nƣớc,
aceton, glycerin, tan trong
methanol, propylen glycol, hơi
tan trong ethanol, thực tế
CTPT: C16H15N5O7S2

không tan trong ether, ethyl

MW: 453,5

acetat và hexan.
- Độ tan trong nƣớc: 0,104 g/l.
- pKa1 = 2,92; pKa2 = 3,45

6


1.2. Tổng quan về phƣơng pháp nghiên cứu
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
Là quá trình tách dựa vào sự phân bố các chất phân tích giữa hai pha
lỏng và rắn, trong đó chất phân tích đƣợc chiết từ pha lỏng vào pha rắn, sau
đó rửa giải bằng dung môi thích hợp. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE

tƣơng tự nhƣ trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo
pha liên kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. Tùy theo đặc tính của
pha rắn mà có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm:
pha thuận, pha đảo hay trao đổi ion.
Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bƣớc nhƣ sau:
Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha
rắn có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân
tích mà lựa chọn cột có lƣợng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau. Lƣợng
pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền từ 125 µL đến 20
mL.
Qui trình chiết đối với nhằm mục đích làm giàu mẫu gồm 4 giai đoạn:
1. Hoạt hóa cột chiết pha rắn: cho dung môi hoặc dung dịch đệm
thích hợp đi qua cột để loại bỏ khí trong cột và chuyển pha rắn
sang trạng thái có thể lƣu giữ chất phân tích trong mẫu.
2. Nạp mẫu: Mẫu đƣợc xử lý sơ bộ trong dung môi thích hợp và cho
qua cột. Chất phân tích và một số chất khác đƣợc giữ lại trên cột.
Các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh làm ảnh
hƣởng đến tƣơng tác của chất phân tích và pha rắn.
3. Loại tạp chất: Sau khi đƣa mẫu qua cột, dùng dung môi hoặc
dung dịch đệm cho qua cột để loại một số tạp chất đã đƣợc giữ
trên pha rắn. Dung môi sử dụng phải đảm bảo loại đƣợc tạp chất
mà không kéo theo chất phân tích.

7


4. Rửa giải: Dùng dung môi thích hợp kéo chất phân tích ra khỏi
pha rắn. Cần tối ƣu hóa loại dung môi, lƣợng dung môi, pH dung
môi rửa giải và tốc độ rửa giải để đảm bảo rửa đƣợc tối đa lƣợng
chất phân tích và tối thiểu tạp chất có trên cột.

Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của
chiết lỏng- lỏng: lƣợng dung môi sử dụng ít, thiết bị và sản phẩm quá trình
chiết dễ dàng kết nối GC, HPLC, khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ƣu
điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt
hơn. Tuy nhiên, có nhƣợc điểm là khó lƣu giữ chất phân cực mạnh, khó xây
dựng đƣợc quy trình chiết tối ƣu, lƣợng dung môi đã giảm nhiều nhƣng hãy
còn lớn, giá thành của phƣơng pháp còn cao.
Hiệu quả của quá trình chiết pha rắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
- Loại cột chiết sử dụng: mỗi loại cột chiết chỉ phù hợp để chiết những
hoạt chất nhất định, tùy thuộc vào loại nguyên liệu tạo pha rắn (là pha
thuận, pha đảo, trao đổi ion hay pha không liên kết).
- Lƣợng chất tạo pha rắn: ảnh hƣởng trực tiếp đến dung lƣợng của cột
chiết pha rắn. Thông thƣờng, lƣợng chất nhồi càng lớn thì dung lƣợng
chiết của cột càng lớn, đồng thời yêu cầu lƣợng dung môi rửa giải
càng nhiều.
- Dung môi rửa giải: loại và số lƣợng dung môi rửa giải sử dụng phải
đảm bảo chiết đƣợc hoàn toàn chất phân tích đang đƣợc lƣu giữ trong
cột, và hạn chế tối đa các tạp chất.
- Lƣợng mẫu phân tích đƣa qua cột chiết: ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu
suất của quy trình chiết. Nếu lƣợng mẫu qua cột quá lớn, vƣợt quá
dung lƣợng cột sẽ làm giảm hiệu suất chiết và ngƣợc lại.

8


1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ là kĩ thuật phân tích dựa trên việc ghép nối hai
hệ thống: sắc ký lỏng và khối phổ. Về cơ bản, có thể coi sắc ký lỏng khối
phổ là phƣơng pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ.
a. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng
[1].
 Nguyên tắc
Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong dung môi và đƣợc cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu
sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ
số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển
qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm
cơ sở cho phân tích định tính và định lƣợng [1], [2]. Sơ đồ cấu tạo của hệ
thống HPLC đƣợc trình bày ở hình 1.3.

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
9


b. Detector khối phổ
 Nguyên tắc
Khối phổ là kỹ thuật phân tích dựa trên việc ion hóa chất phân tích và đo
trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z) đƣợc tạo thành từ phân
tử chất phân tích. Các ion tạo thành này đƣợc tách ra và phát hiện theo trị số
m/z, từ đó cung cấp thông tin định tính, xác định cấu trúc và định lƣợng của
các chất.
 Cấu tạo
Cấu tạo của thiết bị khối phổ bao gồm các phần chính: bộ phận nạp mẫu,
bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector và bộ phận xử lý dữ liệu. Mẫu
đƣợc đƣa vào qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hóa,

đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối để tách các ion theo trị số
m/z trƣớc khi đến detector. Tất cả quá trình này diễn ra trong điều kiện chân
không với áp suất dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa.
- Bộ phận nạp mẫu: Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu
chính là đầu ra của cột sắc ký. Cách chuyển mẫu : mẫu từ đầu ra của
LC đi qua bộ giao diện để tạo thành dạng hơi và tách loại dung môi.
- Bộ nguồn ion: Chất phân tích sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đƣợc dẫn
tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa. Một số kĩ
thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa
phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất
khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI).
Ion hóa phun điện tử (ESI) đƣợc thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu thử
trong dung dịch đƣợc đƣa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu
ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời, các dung dịch
mẫu này đƣợc phun sƣơng dƣới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo
ra các hạt mang điện tích và đƣợc gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù
hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử
10


sinh học có khối lƣợng tới 100 000 Da. Có thể dùng trong ghép nối với sắc
ký lỏng hay điện di mao quản.
Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) đƣợc thực hiện ở áp suất khí
quyển nhờ tác động của một điện cực có điện thế cao; pha động đƣợc phun
sƣơng bằng hiệu ứng nhiệt. Các ion hình thành có một điện tích và là ion
kiểu (M+H)+ trong chế độ phân cực dƣơng và kiểu (M-H)- trong phân cực
âm. Kỹ thuật này chỉ phù hợp cho việc ghép nối khối phổ với sắc ký lỏng.
- Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác
nhau thành từng phần riêng biệt.
Một số bộ phân tích khối phổ thƣờng dùng:

Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Bộ phân tích này gồm có bốn thanh kim loại song song hình trụ.
Chúng đƣợc đặt đối xứng hai bên đƣờng đi của các ion; các cặp đối diện với
nhau qua trục đối xứng của các thanh điện cực thì đƣợc nối điện với nhau.
Điện thế của hai cặp thanh điện cực là đối nhau. Điện thế này là tổ hợp của
một thành phần một chiều và một thành phần xoay chiều. Các tứ cực đóng
vai trò nhƣ một bộ lọc khối. Các ion hình thành trong nguồn ion đƣợc
truyền đi và tách bằng cách thay đổi thế đặt trên các điện cực. Chỉ những
ion có trị số m/z phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1,
Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ
phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion
mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thƣờng là khí argon. Kỹ thuật phân
tích khối phổ kiểu này đƣợc gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thƣờng đƣợc
dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều
thành phần.
Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

11


Bộ phân tích bẫy ion cũng hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích
khối tứ cực, chỉ có một điểm khác là các ion đƣợc lƣu giữ và đƣa dần ra
khỏi bẫy. Các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn định đƣợc
bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion lúc
này trở lên không ổn định, dao động có hƣớng đi về phía detector. Do điện
áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy
đủ. Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự
khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn
phá để thu đƣợc các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của

ion con (khối phổ hai lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy
thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế
thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.
Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Các ion đƣợc gia tốc nhờ điện thế bay qua một ống phân tích đến
detector. Thời gian bay của chất phân tích qua ống tỷ lệ thuận với trị số m/z
của chúng. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn
hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn. Thời gian bay của một ion tới
detector phụ thuộc vào khối lƣợng, điện tích và năng lƣợng động học của
các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhƣng nó có ƣu
điểm là khối lƣợng ion có thể phân tích không bị hạn chế.
- Detector: Sau khi đi ra khỏi bộ phân tích khối lƣợng, các ion đƣợc
đƣa tới bộ phận phát hiện ion. Phổ biến có hai loại bộ phận phát hiện là:
Bộ phận phát hiện nhân electron: là một trong những detector phổ biến
nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt của các chất bán dẫn làm bật
ra các electron. Các electron đƣợc gia tốc, va chạm tiếp với các chất bán
dẫn khác để tạo ra các electron khác, quá trình này tiếp diễn và kết quả là
tạo thành dòng các electron. Các electron đƣợc thu nhận và số lƣợng của
chúng sẽ tỷ lệ với số lƣợng ion đến detector.
12


Bộ phận phát hiện nhân quang: cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron,
các ion ban đầu đập vào một bề mặt chất bán dẫn tạo ra dòng các electron.
Các electron sau đó sẽ va đập vào một bề mặt phát quang và tạo ra các
photon. Các photon này đƣợc thu nhận và số lƣợng của chúng tỷ lệ với số
lƣợng ion. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đặt
trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.
- Một số kiểu chế độ thu phổ:
+ Chế độ thu tín hiệu toàn phổ (SCAN)

Với chế độ SCAN, bộ phận phát hiện sẽ thu nhận đƣợc tất cả các mảnh
ion đƣợc tạo thành từ mẫu phân tích để cho khối phổ gồm tất cả các ion và
tỷ lệ tƣơng đối giữa các ion. Chế độ này thƣờng dùng để định danh hay phân
tích cấu trúc khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ
ba tƣ́ cƣ̣c, chế đô ̣ SCAN thƣờng đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n để khảo sát ion me ̣.
+ Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring - SIM)
Trong chế độ SIM, bộ phận phát hiện chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trƣng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion
đã đƣợc lựa chọn trƣớc đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh
với các thƣ viện phổ có sẵn. Ứng dụng chế độ này để định lƣợng khi đã biết
mảnh ion đặc trƣng của chất phân tích.
+

Chế độ thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần (Selected Reaction

Monitoring - SRM và Multiple Reaction Monitoring - MRM): Đối với máy
khối phổ hai lần, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thƣờng đƣợc sử dụng là
SRM và MRM.
Chế độ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó,
trong các mảnh ion sinh ra , cô lập 1 mảnh ion con cầ n quan tâm và đƣa vào
bộ phận phát hiện.
Chế độ MRM: trên thƣ̣c tế , do yêu cầ u về mă ̣t kỹ thuâ ̣t đố i với phân
tích vi lƣợng nên các ion con cần qu an tâm thƣờng tƣ̀ 2 trở lên, do vâ ̣y kỹ
13


thuâ ̣t ghi phổ MRM thông du ̣ng hơn SRM . Đầu tiên , cô lâ ̣p ion cầ n cho ̣n
(ion me ̣) ở tứ cực thứ nhất , phân mảnh ion cô lâ ̣p đó ta ̣i tƣ́ cƣ̣c thƣ́ 2 để thu
đƣơ ̣c các ion con, cô lâ ̣p 2 (hoă ̣c nhiề u) ion con cầ n quan tâm ở tứ cực thứ 3
và đƣa vào bộ phận phát hiện.

 Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ:
Do sắc ký lỏng khối phổ có độ chọn lọc và độ nhạy cao, nên nó
thƣờng đƣợc sử dụng để xác định hoạt chất lƣợng siêu vết trong các mẫu có
thành phần phức tạp. Một số ứng dụng đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ:
- Định tính, định lƣợng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh
học.
- Định lƣợng dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo
quản, chất cấm trong mỹ phẩm, thực phẩm, môi trƣờng.
- Ngoài ra, còn nhiều ứng dụng khác đang đƣợc nghiên cứu sử dụng…
1.3. Một số nghiên cứu về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh có trong nƣớc ở
Việt Nam và trên thế giới
Nghiên cứu của Dƣơng Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng
đƣợc phƣơng pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floroquinolon
trong nƣớc thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha
rắn dùng cột silicagel tự chế tạo và định lƣợng đƣợc các kháng sinh
ciprofloxacin, norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt
trong nƣớc thải bệnh viện bằng HPLC với detector huỳnh quang. Điều kiện
sắc ký: cột C16, nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7ml/phút, bƣớc sóng kích
thích 278nm và bƣớc sóng phát xạ 445nm. Hiệu suất thu hồi trong nền nƣớc
thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0
µg/L. Tuy nhiên, do sử dụng detector huỳnh quang, phƣơng pháp yêu cầu
phải tách riêng từng chất bằng sắc ký lỏng [3].

14


Tác giả Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phƣơng pháp xác
định dƣ lƣợng Cefixim có trong nƣớc thải từ cơ sở sản xuất Dƣợc. Nghiên
cứu trên sử dụng kỹ thuật HPLC, chiết với cloroform và acid hóa bằng HCl
đến pH 3. Điều kiện sắc ký: Cột Luna C18, detector DAD: λ = 285 nm, thể

tích tiêm mẫu: 200 µl, nhiệt độ cột: 32ºC, pha động: methanol - dung dịch
đệm phosphat pH = 3,2 (dung dịch NaH2PO4 40 mM, chỉnh pH bằng
H3PO4). Lƣợng mẫu tiêm lớn 200 µl nên yêu cầu cột tách có hiệu lực cao
(>7000 đĩa lý thuyết) và khả năng phân tách hoàn toàn các chất nghiên cứu,
giới hạn phát hiện đạt đƣợc là 6,68 ng/ml [10].
Tác giả Nguyễn Văn Thuận (2014) đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp
xác định dƣ lƣợng 03 kháng sinh: Cefixim, Cefuroxim và Cephalexin trong
nƣớc thải. Tác giả sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ và phƣơng pháp
chiết pha rắn, sử dụng chuẩn nội là Terbutalin. Giới hạn phát hiện của các
kháng sinh từ 0,58 – 1,22 ng/ml. Phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để phân tích
các kháng sinh này trong mẫu nƣớc thải nhà máy sản xuất dƣợc. Phƣơng
pháp đã xây dựng có khả năng định lƣợng đƣợc đồng thời dƣ lƣợng các
kháng sinh nghiên cứu với LOD thấp, phù hợp để xác định các kháng sinh
nghiên cứu ở dạng dƣ lƣợng, chuẩn nội sử dụng có giá thành thấp và có
nhiều trên thị trƣờng. Tuy nhiên, việc sử dụng chuẩn nội là Terbutalin có
nhƣợc điểm do có thể dẫn tới sai số vì chất chuẩn nội có thể tồn tại trong
nền mẫu thực (khi cơ sở cũng sản xuất cả hoạt chất này) [12].
Một nghiên cứu của Dennis McQuellan và cộng sự (2002) tại New
Mexico đã phát hiện ra một số chất nhƣ: chống trầm cảm, chống dị ứng,
viêm, kháng sinh và hoóc môn... trong nƣớc ở nồng độ nanogam/lít. Các
nhà nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp HPLC-MS để phát hiện sự tồn tại
các kháng sinh Tetracyclin và nhóm Macrolid có trong các nguồn nƣớc tự
nhiên [19].

15


Nghiên cứu khác của J.M. Cha và cộng sự (2006) tại Hoa Kỳ đã xây
dựng phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 5 kháng sinh β-lactam: Amoxicilin,
Ampicilin, Oxacilin, cloxacilin và cephapirin. Tác giả đã sử dụng chiết pha

rắn và phƣơng pháp LCMS/MS để định lƣợng các kháng sinh này với LOD
từ 8 ng/L đến 18ng/L tùy từng loại nƣớc. Phƣơng pháp xây dựng đƣợc đã
đƣợc sử dụng để xác định dƣ lƣợng các kháng sinh β-lactam trên trong nƣớc
sông và nƣớc thải ở các thời điểm khác nhau [23].
Nghiên cứu của Từ Bình Minh và cộng sự (2009) đã xây dựng
phƣơng pháp và đánh giá dƣ lƣợng của 4 nhóm kháng sinh, trong đó gồm 3
kháng sinh β-lactam: Amoxicilin, Cephalexin và Cefotaxim. Nghiên cứu đã
xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn và xác định dƣ lƣợng kháng sinh
bằng LCMS/MS. Nhóm tác giả đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp với LOD
của các kháng sinh β-lactam từ 0,7 - 20 ng/L. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử
dụng để đánh giá sự có mặt của các kháng sinh này trong các mẫu nƣớc từ
một số nhà máy xử lý nƣớc sông và nƣớc biển tại Hồng Kông [26].
Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và
đánh giá dƣ lƣợng của 7 kháng sinh: Amoxicilin, ceftriaxon, amikacin,
ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin trong nƣớc thải tại một
bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và
phƣơng pháp LCMS/MS. Kết quả đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp với LOD
từ 0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh. Phƣơng pháp này đã đƣợc
ứng dụng để phân tích sự có mặt các kháng sinh trên ở trong nƣớc thải bệnh
viện tại một số thời điểm khác nhau [27].
Trong nghiên cứu của Haomin Xu ở Trƣờng Đại học California,
Irvine (2010), tác giả cũng đã xây dựng phƣơng pháp và đánh giá hàm
lƣợng kháng sinh Amoxicilin, thuốc chẹn Beta, trimetroprim và cimetidin
có trong nguồn nƣớc tự nhiên tại châu Âu và Mỹ. Trong đó, điều kiện phân
tích Amoxicilin nhƣ sau: máy HPLC Agilent 1200 với 2 detector là UV-VIS
16