Nghiên cứu sinh tổng hợp magnesi lactat từ lactobacillus acidophilus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP
MAGNESI LACTAT
TỪ Lactobacillus acidophilus
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP
MAGNESI LACTAT
TỪ Lactobacillus acidophilus
CHUYÊN NGÀNH
MÃ SỐ: 607.204.02
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. Đàm Thanh Xuân

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô
giáo TS. Đàm Thanh Xuân đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức
quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PSG. TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn
Văn Hải đã cho tôi những bài học giá trị, nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi từ
những ngày đầu nghiên cứu cho tới nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn
Công nghiệp dược đã nhiệt tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học cùng các
thầy cô, cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu trường
Cao đẳng Dược TW Hải Dương đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, cho tôi gửi lời biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích
lệ và giúp đỡ tôi trong mọi mặt để có kết quả như ngày hôm nay.
Hà Nội, tháng 8 năm 2015
Học viên

Nguyễn Minh Ngọc


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1.

TỔNG QUAN ................................................................................. 3

1.1. Magnesi lactat ............................................................................................. 3
1.1.1. Đặc điểm ............................................................................................... 3
1.1.2. Công dụng ............................................................................................. 4
1.1.3. Một số sản phẩm lƣu hành trên thị trƣờng ............................................ 6
1.2. Các phƣơng pháp sản xuất Magnesi lactat.................................................. 7
1.2.1. Phƣơng pháp tổng hợp hóa học ............................................................ 7
1.2.2. Phƣơng pháp sinh học ........................................................................... 8
1.3. Vi khuẩn sinh acid lactic ........................................................................ 10
1.3.1. Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ........................................ 10
1.3.2. Chi Lactobacillus ............................................................................. 11
1.3.3. Loài Lactobacillus acidophilus ........................................................ 11
1.3.4. Acid lactic ........................................................................................... 13
1.3.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men sản xuất acid lactic...... 15
1.4. Các nghiên cứu về điều chế Magnesi lactat bằng phƣơng pháp sinh tổng
hợp lên men vi sinh vật .................................................................................... 15
Chƣơng 2.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................ 22
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 22
2.1.2. Thiết bị sử dụng .................................................................................. 24
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 24
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 26

2.3.1. Phƣơng pháp nhân giống và nuôi cấy ................................................. 26
2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết Magnesi lactat từ dịch lên men .................... 26


2.3.3. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào vi sinh vật ................................ 27
2.3.4. Phƣơng pháp tính hiệu suất tạo sản phẩm Magnesi lactat .................. 29
2.3.5. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của sản phẩm ...................... 30
2.3.6. Phƣơng pháp kiểm nghiệm Magnesi lactat ......................................... 31
2.3.7. Phƣơng pháp định lƣợng acid lactic ................................................... 33
2.3.8. Phƣơng pháp Schoorl – Regenbogen định lƣợng đƣờng .................... 33
2.3.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 34
Chƣơng 3.

KẾT QUẢ ..................................................................................... 35

3.1. Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hƣởng đến quá trình lên men L.
acidophilus sinh tổng hợp Magnesi lactat........................................................ 35
3.1.1. Xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật
độ tế bào ........................................................................................................ 35
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đối với quá trình nuôi cấy L.
acidophilus .................................................................................................... 36
3.1.3. Lựa chọn pH thích hợp cho quá trình nuôi cấy L. acidophilus .......... 39
3.1.4. Lựa chọn cách bổ sung Magnesi carbonat vào môi trƣờng nuôi cấy L.
acidophilus .................................................................................................... 40
3.1.5. Khảo sát ảnh hƣởng của pH duy trì môi trƣờng nuôi cấy đến hiệu suất
thu sản phẩm. ................................................................................................ 41
3.1.6. Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn hydratcacbon tới hiệu suất thu sản
phẩm. ............................................................................................................. 43
3.1.7. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ glucose tới hiệu suất thu sản phẩm
....................................................................................................................... 45

3.1.8. Lựa chọn thời điểm thu sản phẩm....................................................... 47
3.2. Khảo sát và lựa chọn một số phƣơng pháp và điều kiện kết tinh thu sản
phẩm Magnesi lactat ........................................................................................ 50
3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp kết tinh .................................. 50
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh .......................................... 52
3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian kết tinh ......................................... 53
3.2.4. Đề xuất quy trình xử lý dịch lên men quy mô phòng thí nghiệm ....... 54
3.3. Xác định cấu trúc và kiểm nghiệm sản phẩm thu đƣợc ............................ 57


3.3.1. Định tính Magnesi lactat bằng sắc ký lớp mỏng ................................ 57
3.3.2. Xác định cấu trúc ................................................................................ 57
3.3.4. Kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat. ............................................. 58
Chƣơng 4.

BÀN LUẬN .................................................................................. 59

4.1. Về phƣơng pháp đo OD600 để xác định mật độ tế bào VSV ..................... 59
4.2. Về ảnh hƣởng của ion Mg2+ trong môi trƣờng nuôi cấy ........................... 60
4.3. Về điều kiện lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat. ................................ 62
4.3.1. Về ảnh hƣởng của pH ......................................................................... 62
4.3.2. Về phƣơng pháp bổ sung MgCO3 ....................................................... 63
4.3.3. Về các loại hydratcarbon .................................................................... 64
4.3.4. Về nồng độ đƣờng glucose ................................................................. 65
4.3.5. Về thời gian lên men ........................................................................... 67
4.4. Bàn luận về phƣơng pháp tinh chế............................................................ 68
4.4.1. Về phƣơng pháp kết tinh ..................................................................... 68
4.4.2. Về nhiệt độ kết tinh ............................................................................. 69
4.4.3. Về thời gian kết tinh............................................................................ 69
4.5. Về định tính, xác định cấu trúc và kiểm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat

sinh tổng hợp .................................................................................................... 70
4.5.1.Về định tính.......................................................................................... 70
4.5.2. Về cấu trúc của sản phẩm Magnesi lactat sinh tổng hợp .................... 71
4.5.3. Về kiểm nghiệm .................................................................................. 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

American Type Culture Collection
(Trung tâm giữ giống Quốc gia Mỹ)

BP

Bristish Pharmacopoeia (Dƣợc Điển Anh)

DĐVN

Dƣợc Điển Việt Nam

h

Giờ

1

1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

H-NMR

(Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton)
IR

Infrared Radiation (Phổ hồng ngoại)

kl

Khối lƣợng

MRS

de Man, Rogosa, Sharpe
(Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lactic)

L.acidophilus Lactobacillus acidophilus
MS

Mass spectrometry (Phổ khối lƣợng)

OD600

Optical density (Mật độ quang tại bƣớc sóng 600 nm)

PLA

Poly acid lactic

tt

Thể tích

USP

United States Pharmacopoeia (Dƣợc điển Mỹ)

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình
(heterolactic) [7] .................................................................................................... 8
Hình 1.2. L. acidophilus dƣới kính hiển vi quang học (a), kính hiển vi điện tử
(b)[5] .................................................................................................................... 11
Hình 3.1. Đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa độ OD600 và mật độ tế bào ........... 36
Hình 3.2. Đồ thị ảnh hƣởng của Mg2+ trong dịch nuôi cấy đến OD600 và nồng độ
acid lactic............................................................................................................. 38
Hình 3.3. Biến thiên mật độ vi sinh vật (OD600) theo pH của môi trƣờng nuôi cấy
............................................................................................................................. 39
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hiệu suất tạo Magnesi lactat ở các pH duy trì môi
trƣờng nuôi cấy khác nhau .................................................................................. 42
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh Magnesi lactat khi sử dụng các nguồn
hydratcacbon khác nhau ...................................................................................... 44
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh hiệu suất tạo Magnesi lactat ở các nồng độ glucose
khác nhau ............................................................................................................. 46
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn các thông số theo thời gian lên men ......................... 48

Hình 3.8. Hình dạng tinh thể Magnesi lactat ở các thí nghiệm chụp ở vật kính
10x ....................................................................................................................... 51
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lí dịch lên men ...................................................... 55
Hình 4.1. Hình ảnh tinh thể Magnesi lactat chụp qua kính hiển vi quang học 10x
............................................................................................................................. 70


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat trên thị trƣờng ......................... 6
Bảng 1.2. Khả năng sinh acid L – lactic và D – L lactic sau 48 giờ lên men của
chủng vi khuẩn L. acidophilus DSM 20079 [41] ................................................ 12
Bảng 2.1. Các nguyên liệu và hóa chất ............................................................... 22
Bảng 2.2. Môi trƣờng nhân giống MRS và lên men ........................................... 23
Bảng 2.3. Các thiết bị sử dụng ............................................................................ 24
Bảng 2.4. Các nồng độ pha loãng để xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính
giữa độ đục và mật độ tế bào............................................................................... 29
Bảng 3.1. Kết quả xác định mật độ tế bào VSV sống bằng phƣơng pháp đo
quang và đĩa thạch ............................................................................................... 35
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của ion Mg2+ đến OD600 và khả năng tạo
acid lactic của vi sinh vật .................................................................................... 37
Bảng 3.3. So sánh hai phƣơng pháp bổ sung MgCO3 vào môi trƣờng nuôi cấy. 40
Bảng 3.4. Hiệu suất thu Magnesi lactat khi nuôi cấy L. acidophilus ở các pH
khác nhau ............................................................................................................. 42
Bảng 3.5. Hiệu suất tạo Magnesi lactat khi lên men với các loại hydratcacbon
khác nhau ............................................................................................................. 43
Bảng 3.6. Kết quả hiệu suất Magnesi lactat khi lên men với các nồng độ glucose
khác nhau ............................................................................................................. 45
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát lƣợng sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc theo thời
gian ...................................................................................................................... 47
Bảng 3.8. So sánh các điều kiện của phản ứng hóa học và phản ứng trong điều

kiện lên men tạo sản phẩm Magnesi lactat ......................................................... 49
Bảng 3.9. So sánh các điều kiện kết tinh khác nhau ........................................... 51
Bảng 3.10. Lƣợng sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc trong các điều kiện nhiệt
độ kết tinh khác nhau .......................................................................................... 53


Bảng 3.11. Lƣợng sản phẩm Magnesi lactat thu đƣợc trong các điều kiện thời
gian kết tinh khác nhau........................................................................................ 54


ĐẶT VẤN ĐỀ
Magnesi đóng một vai trò thiết yếu trong cơ thể, thiếu Magnesi có thể dẫn
đến những thay đổi sinh hóa nghiêm trọng [57], [71], [72] liên quan đến các
bệnh tim mạch, loãng xƣơng và bệnh hen suyễn [39]. Ngày nay, việc cung
cấp Magnesi từ thức ăn hằng ngày đã giảm nhiều [60], [62]. Tăng tiêu thụ các
loại rau và các sản phẩm ngũ cốc góp phần cải thiện lƣợng Magnesi [24],
[46]. Tuy nhiên, đối với một số bệnh cần phải bổ sung Magnesi dƣới dạng
thuốc. Hiệu quả của các dạng thuốc còn phụ thuộc nhiều vào sinh khả dụng
của các dạng muối Magnesi [20], [52]. Các dạng muối Magnesi vô cơ có sinh
khả dụng dao động từ 2% (Magnesi oxyd) đến 20% (Magnesi clorua) [29],
[47], [53], Magnesi hữu cơ nhƣ Magnesi L lactat có sinh khả dụng cao hơn
(41%) [58]. Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat còn là nguyên liệu sản
xuất Calci lactat, acid lactic, polylactid (nhựa sinh học PLA) là những sản
phẩm thông dụng ứng dụng rộng rãi trong các ngành: dƣợc, thực phẩm, chất
dẻo.
Phƣơng pháp tổng hợp hóa học Magnesi lactat thƣờng tạo ra dạng racemic.
Trong khi đó, phƣơng pháp vi sinh có thể tạo sản phẩm dạng L với hiệu suất
cao và thân thiện với môi trƣờng. Với các ƣu điểm của phƣơng pháp sinh tổng
hợp, sản xuất Magnesi lactate bằng kỹ thuật lên men chìm vẫn là những đòi
hỏi thiết yếu của xã hội hiện đại [8]. Thị trƣờng Việt Nam hiện nay có nhiều

chế phẩm chứa Magnesi lactat, tuy nhiên nguyên liệu hoàn toàn nhập khẩu từ
nƣớc ngoài. Với mong muốn đƣợc góp phần vào các nghiên cứu sản xuất
nguyên liệu trong nƣớc, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp
Magnesi lactat từ Lactobacillus acidophilus”, với các mục tiêu sau:
- Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh
tổng hợp Magnesi lactat khi nuôi cấy Lactobacillus acidophilus ở quy mô
phòng thí nghiệm.
1


- Khảo sát và lựa chọn một số phương pháp và điều kiện kết tinh thu
sản phẩm Magnesi lactat.
- Xác định cấu trúc sản phẩm Magnesi lactat và kiểm nghiệm theo tiêu
chuẩn Dược Điển Việt Nam IV và Dược Điển Anh 2010.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Magnesi lactat
1.1.1. Đặc điểm
Công thức tổng quát: C6H10MgO6.
Tên khoa học: Magnesi 2 – hydroxyl propanoat.
Thành phần: C 35,60%, H 4,98%, Mg 12,01%, O 47,42%.
Khối lƣợng phân tử: 202,45g/mol.
Công thức cấu tạo: gồm cation Mg2+ và 2 anion L – lactat hoặc D - lactat

Magnesi lactat là muối kết tinh của acid lactic với ion Mg2+, tồn tại
trong

tự

nhiên

dạng

dihydrat

(C6H10MgO6.2H2O)

và

trihydrat

(C6H10MgO6.3H2O).
Cấu trúc không gian

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của Magnesi L - lactat
Tính chất: Magnesi lactat tồn tại dạng kết tinh màu trắng, không mùi, vị
cay đắng, khó tan trong nƣớc lạnh, tan tốt trong nƣớc nóng (1g Magnesi lactat
dạng bột tan trong 25ml nƣớc lạnh; 3,5ml nƣớc nóng) và hơi tan trong cồn 960
[35].

3


1.1.2. Công dụng
Magnesi lactat đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực:
a. Trong Y học:
- Magnesi lactat tác động lên quá trình tăng trƣởng, giống nhƣ vitamin

D, nó giúp Calci và Phospho cố định trên xƣơng. Trung bình, cơ thể ngƣời
lớn chứa 25 đến 30g Magnesi, trong đó khoảng 70% đƣợc cố định ở xƣơng,
29% ở mô mềm, 1% trong huyết tƣơng. Magnesi là cation nhiều thứ hai của
nội bào, tham dự vào các chuyển hóa đặc biệt của nội bào glucid, lipid, protid,
cân bằng kiềm toan, ôxy hóa khử, và đóng vai trò sinh lý quan trọng, đƣợc
xác định bởi những rối loạn do thiếu hụt [11], [64].
- Magnesi lactat điều trị đau tử cung trong thai kỳ [26].
- Magnesi lactat có khả năng bảo vệ tim mạch, chỉ định dùng trong
bệnh nhồi máu cơ tim [12], [16], [49].
- Magnesi lactat có vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa [15],
[73].
- Magnesi lactat cũng cần thiết cho quá trình phát triển và hoạt động
bình thƣờng của tổ chức, đặc biệt liên quan đến chuyển hóa [69] và các hoạt
động của não [65], [66].
b. Trong công nghệ thực phẩm:
- Magnesi lactat là một phụ gia thực phẩm dùng để điều vị và xử lý bột
với tên thƣơng mại E329.
- Magnesi lactat thƣờng có trong các sản phẩm bổ sung nhƣ vitamin,
khoáng chất bổ sung và đồ uống [28].
c. Trong công nghiệp dƣợc phẩm:
- Magnesi lactat đƣợc sử dụng làm tá dƣợc điều chỉnh pH.
- Làm tá dƣợc trong dập viên: Magnesi lactat sản xuất bằng phƣơng pháp
sấy phun có nhiệt độ nóng chảy cao hơn, ít dính bụi, độ trơn chảy cao, góc
nghỉ thấp, cải thiện độ rã nên đƣợc sử dụng làm tá dƣợc dập viên, tá dƣợc
4


trong sản phẩm mĩ phẩm: sản phẩm chăm sóc da, chăm sóc răng miệng…
[48].
d. Trong công nghiệp khác:

- Magnesi lactat là tiền sản phẩm trong công nghiệp lên men sản xuất acid
lactic, các muối lactat khác, tiêu biểu nhƣ Calci lactat. acid lactic và các dẫn
xuất của nó (polylactid - nhựa sinh học PLA) đƣợc dùng rộng rãi trong công
nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, công nghiệp dệt, tổng hợp vecni, chất dẻo,
nhựa gia công bằng nhiệt.
- Magnesi lactat còn đƣợc sử dụng để tham gia vào chế tạo các linh kiện
điện tử, thiết bị kĩ thuật (máy tính xách tay, máy tính bảng…) [48].

5


1.1.3. Một số sản phẩm lưu hành trên thị trường
Bảng 1.1. Một số sản phẩm ch a Magnesi lactat trên thị trường
T n iệt
ƣợ

Dạng sử dụng

Th nh phần

1 Puramex MG

Nguyên liệu

Magnesi L - lactat
dihydrat

2 Mag-Tab SR

Viên bao giải

phóng kéo dài

Magnesi L - lactat
dihydrat 84 mg

STT

3

4
5
6
7
8

9

Magne B6
Stada

Magnesi lactat dihydrat
180 mg
Ống dung dịch
Magnesi pidolat
uống
936 mg
10 ml
Pyridoxin hydroclorid
10,0 mg

Magnesi B6
Magne B6
Glomed
Magnesi B6
VB
Magnesi B6
Magne B6
Corbière

Wamag

Viên nén bao
phim

ng sản uất
Corbion Purac,
Purac Biochem
Nyche
Pharmaceutical,
Southlake

Stada

Công Ty Cổ Phần
Dƣợc Hậu Giang
Magnesi lactat dihydrat
470 mg
Pyridoxin hydroclorid
5 mg

Viên nén
Viên nén bao
đƣờng

Glomed
Imexpharm
Mekophar
Sanofi-Aventis

Calci lactogluconat
29,40 g
Calci lactobionat
Viên nang mềm
6,40 g
Magnesi lactat dihydrat
5,00 g

6

Hasco


1.2. Cá phƣơng pháp sản uất Magnesi lactat
1.2.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Bằng các phƣơng pháp tổng hợp hóa học các nhà khoa học đã nghiên
cứu tổng hợp đƣợc Magnesi lactat từ acid lactic và Magnesi hydroxyd [13],
[23], [74]. Phƣơng pháp đƣợc áp dụng rộng rãi tạo Magnesi lactat cho các
ngành công nghiệp tổng hợp chất phụ gia thực phẩm, chất dẻo [48], [74].
Phƣơng pháp tổng hợp hóa học có ƣu điểm là: Dễ thu đƣợc Magnesi
lactat từ acid lactic, trong đó acid lactic lại đƣợc tổng hợp nhiều nguồn khác

nhau [7], [6]; Chi phí sản xuất thấp; Thời gian ngắn tổng hợp ngắn.
 Cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd
CH3CHO
Acetaldehyd

+

HCN

CH3CHOHCN

hydrogen cyanid

lactonitril

 Thủy phân bằng acid sulfuric
CH3CHOHCN + H2O + 1/2H2SO4

CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4

Lactonitril

acid lactic

 Ester hóa
CH3CHOHCOOH + CH3OH

CH3CHOHCOOCH3 + H2O

Acid lactic

methyl lactat

methanol

 Thủy phân bằng nƣớc
CH3CHOHCOO CH3 + H2O

CH3CHOHCOOCH3 + CH3OH

Methyl lactat

lactic acid

methanol

Tuy nhiên phƣơng pháp cũng có một số nhƣợc điểm: Tổng hợp
Magnesi lactat theo phƣơng pháp này thƣờng tạo dạng muối của Magnesi với
acid D (-) lactic và acid racemic D,L lactic. Đây là các dạng gây hại với sức
khỏe con ngƣời nên ít dùng. Việc cải tiến kỹ thuật để tạo sản phẩm tự nhiên
muối của Magnesi với acid L (+) lactic vẫn luôn đƣợc tích cực nghiên cứu
[13], [23], [54], [56], [74].
7


1.2.2. Phương pháp sinh học

Hình 1.1. Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình
(heterolactic) [7]

8


Cơ sở của phƣơng pháp sinh học là tiến hành lên men trong điều kiện
kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic. Acid lactic
đƣợc tạo thành từ sự chuyển hóa mono hoặc disaccharid bƣớc đầu đi theo con
đƣờng Embden – Mayerhoff (hình 1.1). Sau đó, dƣới điều kiện kỵ khí, acid
piruvic sinh ra sẽ đƣợc khử hóa thành acid lactic dƣới tác dụng của enzym
lactat dehydrodenase. Lactat dehydrogenase (LDH) của các vi khuẩn lactic
đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành L(+) hay D(-) acid lactic do khả
năng lập thể hóa của sản phẩm (do gen ldhD hay ldhL quy định), tùy theo
chủng vi khuẩn lactic có loại gen nào thì sẽ cho sản phẩm tƣơng ứng. Gen mã
hóa enzym L(+) lactat dehydrogenase đƣợc nghiên cứu trên Lactobacilus
platarum. Gen mã hóa enzym D(-) lactat dehydrogenase đƣợc nghiên cứu trên
Lactobacilus johnsonii [7].
Cả hai dạng lên men tạo acid lactic từ hydratcarbon là đồng hình
(homolactic) hay dị hình (heterolactic). Lên men lactic đồng hình khi lƣợng
acid lactic chiếm đại đa số do vi khuẩn lactic loại này có enzym aldolase
nhƣng không có enzym phosphoketolase. Lên men dị hình khi lƣợng acid
lactic chiếm tỷ lệ thấp, đi kèm với hỗn hợp các chất khác nhƣ acid lactic, acid
formic hoặc CO2, do vi khuẩn lactic không có enzym aldolase nhƣng có
enzym phosphoketolase [7]. Việc bổ sung các hợp chất Magnesi vào môi
trƣờng lên men sẽ tạo ra muối Magnesi lactat tan trong môi trƣờng lên men.
Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên
men, kết tinh và tinh chế để thu sản phẩm. Thực chất phƣơng pháp lên men vi
sinh vật tạo Magnesi lactat là quá trình lên men tạo acid lactic [14], [18], [19],
[38], [42], [54].
Phƣơng pháp sinh tổng hợp Magnesi lactat từ vi sinh vật có nhiều ƣu
điểm hơn so với phƣơng pháp tổng hợp hóa học [36], [51]:
- An toàn với môi trƣờng do các dƣ phẩm của quá trình đƣợc tận dụng để

làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón.
9


- Nhiệt độ sản xuất thấp, năng lƣợng sản xuất thấp, thiết bị và quy trình
sản suất đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện kinh tế Việt Nam.
- Tận dụng đƣợc các sản phẩm thừa của ngành thực phẩm, vậy nên giá
thành sản phẩm rẻ.
- Có khả năng tạo đƣợc sản phẩm tinh khiết dạng Magnesi L - lactat.
1.3.

Vi khuẩn sinh acid lactic

1.3.1. Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic
Vi khuẩn sinh Lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ
GC (guanin và cystein) thấp, chịu đƣợc acid, thƣờng không sinh nha bào, kị
khí hoặc vi hiếu khí, đƣợc phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình
trao đổi chất và các đặc tính sinh lý. Ban đầu, các vi khuẩn này đƣợc tìm thấy
trong thực vật đã phân hủy và các sản phẩm của acid lactic. Điểm chung lớn
nhất của vi khuẩn nhóm này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là
sản phẩm trao đổi chất cuối cùng [5], [43].
Vi khuẩn sinh Lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus,
Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi Rhizopus
[1]. Hình dạng và kích thƣớc của vi khuẩn sinh Lactic rất đa dạng và phức
tạp: hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc thành chuỗi.
Sinh lý của vi khuẩn Lactic khá giống nhau, chúng là các vi khuẩn Gram (+),
không tạo bào tử, hầu nhƣ không di động, ƣa nhiệt, là vi khuẩn yếm khí hoặc
vi hiếu khí, sử dụng năng lƣợng từ phân giải glucid và tiết ra acid lactic.
Chúng phát triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt độ khoảng 10 –
500C [1], [5]. Vi khuẩn Lactic là vi khuẩn dị dƣỡng nên môi trƣờng dinh

dƣỡng tƣơng đối phức tạp, giàu chất dinh dƣỡng, gồm: các vitamin, các acid
amin, các peptid ngắn… Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đƣờng:
glucose, saccarose, lactose, mantose… một vài loài cũng có khả năng sử dụng
đƣờng cao phân tử [1].

10


1.3.2. Chi Lactobacillus
Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh Lactic với đặc điểm: là trực
khuẩn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, catalase (-), không sinh
H2S, aminoacid chủ yếu của peptidoglycan là L–Lysin, m–DAP hay ormitin,
có thể sinh trƣởng ở pH 4,5, lên men glucose sinh L(+), D(-) và DL lactic. Chi
Lactobacillus đƣợc phát hiện với hơn 125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid
trong tế bào và sản phẩm tạo ra trong quá trình lên men, có 3 nhóm chính [5]:


Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của

quá trình lên men chủ yếu là acid lactic (90 - 98%), các sản phẩm khác chỉ tồn
tại dạng vết nhỏ. Đại diện: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. delbrueckii…


Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc, sản phẩm

của quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, ethanol.
Đại diện: L. plantarum, L. casei, L. leichmannii…


Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, sản phẩm cuối cùng

là acid lactic, acid acetic, carbonic, ethanol. Đại diện: L. brevis, L. fermentum,
L. buchneri…
1.3.3. Loài Lactobacillus acidophilus
Loài L. acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli,
bộ lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống Lactobacillus [5].

(a)

(b)

Hình 1.2. L. acidophilus dưới kính hiển vi quang học (a), kính hiển vi
điện tử (b)[5]
11


L. acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, hay hình cầu,
kích thƣớc 0,6 – 0,9 x 1,5 – 6,0 μm , mọc đơn, mọc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn,
không có lông roi, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm
tính, không ƣa muối, ƣa acid, phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt
thấp và có khả năng kháng lysozym, hô hấp hiếu khí và kị khí nhƣng chủ yếu
là kị khí; do đó môi trƣờng nuôi cấy thƣờng là kị khí hoặc là giảm áp oxy với
5 – 10 % CO2, là vi khuẩn có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ cao (ở 45oC), tuy
nhiên nhiệt độ tối ƣu để phát triển là 370C, không phát triển trong khoảng 20
– 22oC. Là đại diện chính của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, nó có khả năng
chịu đƣợc điều kiện môi trƣờng acid trong khoảng pH 5 - 6 trong thời gian 24
– 36 giờ [1], [5]. L. acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình có
khả năng chuyển hóa hydratcarbon: fructose, galactose, glucose, lactose,
maltose, mannose, sucrose và trehalose cho sản phẩm là L (+) Lactic [5], [31],
[32], [41] và chúng có thể lên men ở các nồng độ khác nhau của các loại

đƣờng đó [7], [33]. Bảng 1.2 sau chỉ ra khả năng sinh dạng D/L phụ thuộc vào
loại đƣờng lên men.
Bảng 1.2. Khả năng sinh acid L – lactic và D – L lactic sau 48 giờ lên
men của chủng vi khuẩn L. acidophilus DSM 20079 [41]
Môi trƣờng
MRS không

Nồng độ a i la ti (%) Dạng L (%)

Dạng D (%)

0,200 ± 0,02

90,46

9,54

Glucose

0,860 ± 0,05

68,53

31,50

Fructose

0,587 ± 0,05

61,53

38,47

Lactose

0,748 ± 0,03

68,19

31,81

Saccarose

0,968 ± 0,02

70,97

29,03

Raftilose

0,800 ± 0,04

71,03

28,79

Raftiline

0,264 ± 0,02

79,20

20,80

hydrat carbon

12


Bảng trên cho thấy môi trƣờng MSR không chứa carbonhydrat sinh
nhiều acid L - lactic nhất rồi đến inulin, saccarose, lactose, glucose (68% dạng
L, thời gian nuôi cấy 48h, pH 6,6) và cuối cùng là frutose [41]. Bên cạnh đó
thời gian nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đến khả năng sinh acid L - lactic. Thời
gian nuôi cấy 13,5 giờ sinh 91% acid L - lactic, thời gian càng kéo dài thì thì
L - lactic giảm còn 58% nếu duy trì pH = 6. VSV phát triển tốt ở pH 6 đến
6,6. Tuy nhiên ở pH 6,6 lại cho nhiều dạng L - lactic hơn [31].
L. acidophilus là “probiotic”, chúng là các vi khuẩn có lợi trong hệ
thống tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh, góp phần duy trì hệ vi
khuẩn có lợi. L. acidophilus đƣợc phân lập từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê.
Hiện nay, L. acidophilus đƣợc sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu
hóa nhƣ: Antibio, Lactomin… để điều trị các trƣờng hợp rối loạn tiêu hóa ở
trẻ mới ăn dặm hoặc do dùng kháng sinh dài ngày [9].
1.3.4. Acid lactic
 Cấu trúc của acid lactic
+ Công thức tổng quát: C3H6O3.
+ Khối lƣợng phân tử: 90,08.
+ Công thức cấu tạo:

+ Các dạng của acid lactic: do trong phân tử của acid lactic có 1 carbon

bất đối nên acid lactic có 1 cặp đối quang: acid D (-) Lactic, acid L (+) Lactic.

Acid D (-) Lactic

Acid L (+) Lactic
13


Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác
nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một
sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau.
+ Cấu trúc không gian:

Acid D (-) lactic

Acid L (+) lactic

Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua, các
dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dƣới tác dụng của
enzym racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic. Nếu D-acid lactic và L-acid
lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50 ngƣời ta gọi là hỗn hợp racemic.
Hỗn hợp này đƣợc kí hiệu là DL-acid lactic. Trong quá trình lên men không
có một hỗn hợp lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc khi tiến hành tổng hợp hữu cơ.
[44].
+ Tính chất của acid lactic:
Dạng dung dịch: acid lactic là chất lỏng trong suốt, không màu, không
mùi, vị chua đặc trƣng, tan tốt trong nƣớc, không bay hơi.
Dạng tinh thể: dễ tan ở áp suất khí quyển tạo chất lỏng.
Ở pha lỏng: acid lactic dễ chuyển sang dạng dime mạch thẳng lactoyl
lactat và polyme mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân tử này

liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác. Dạng dimer mạch vòng
lactic cũng có thể đƣợc hình thành nếu đƣợc thực hiện đun nóng kéo dài.
Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao là chất lỏng sánh đặc có sẵn
trên thị trƣờng ở những dạng khác nhau về chất lƣợng; và phụ thuộc vào độ
tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dƣợc
14


phẩm và acid lactic plastic. Ở dạng đồng phần D-acid lactic hoặc L-acid lactic
lần lƣợt có nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ sôi là 28 và 103 0C. Một tiêu chuẩn
chất lƣợng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ:
không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 180oC [44].
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sản xuất acid lactic
Sản xuất công nghiệp acid lactic đƣợc bắt đầu từ cuối thế kỉ 19. Avery
là ngƣời đầu tiên tìm ra cách sản xuất acid lactic ở quy mô thƣơng mại ở
Littleton (Mỹ) vào năm 1881, nhƣng không thành công. Nhà máy đầu tiên
thực sự mang lại thành công đã đƣợc Boehringer xây dựng vào năm 1895 ở
Ingelheim thuộc nƣớc Đức [2], [7], [44].
1.3.5.1. Chủng vi khuẩn lên men
Các chủng vi khuẩn lacitc đang đƣợc sử dụng nhiều trong công nghệ vi
sinh để sản xuất acid lactic, nhất là Lactobacillus delbrueckii. Ngoài ra L.
acidophilus, L. plantarum, L. bulgarius, các giống Bacillus (B. coagulans),
Rhizopus (R. oryzae) và Streptococcus cũng đƣợc sử dụng, có thể phối hợp
các vi khuẩn lactic hoặc phối hợp với vi khuẩn khác nhƣ Streptococcus
thermophilus trong quá trình lên men. Việc lựa chọn loại vi khuẩn lactic tùy
theo khả năng sử dụng hydratcarbon của chúng. Lactobacillus delbrueckii có
thể lên men cho acid lactic từ saccarose, L.bulgarius có thể lên men cho acid
lactic từ lactose. L. helveticus, L. amylophylus thì có thể sử dụng cả hai, R.
oryaze có thể sử dụng trực tiếp tinh bột. Hiện nay, trong công nghiệp sử dụng
những chủng đột biến theo hƣớng sản xuất mạnh acid lactic nhƣng không bị

ức chế bởi nồng độ cao chất này trong môi trƣờng nuôi cấy so với chủng
hoang dại [7]. Trong phạm vi luận văn, nghiên cứu chọn loài L. acidophilus
để thực hiện quá trình lên men tổng hợp acid lactic và Magnesi lactat.
1.3.5.2. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy
Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic, thƣờng sử dụng các môi trƣờng nhƣ:
MRS, môi trƣờng cao nấm men, nƣớc chiết cà chua, môi trƣờng sữa, huyết
15