Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin oxidase của tỏa dương (balanophora laxiflora hemsl , balanophoracea)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THU HIỀN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU
THEO CON ĐƯỜNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE CỦA TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl.,Balanophoraceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THU HIỀN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU
THEO CON ĐƯỜNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE CỦA TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl.,Balanophoraceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 60720405

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thùy Dương
TS. Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI 2015


LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Nguyễn
Thùy Dương - Giảng viên Bộ môn Dược lực - Trường đại học Dược Hà Nội
và TS. Đỗ Thị Hà - Khoa hóa thực vật - Viện Dược liệu, những người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô, các anh, chị
kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực và các em sinh viên đã hỗ trợ, tạo điều kiện
cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ tôi
trong suốt thời gian qua.

HàNội, tháng 8 năm 2015
Tác giả

Phan Thị Thu Hiền


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. TĂNG ACID URIC MÁU ........................................................................... 3
1.1.1. Sinh chuyển hóa acid uric ...................................................................... 3
1.1.2. Tăng acid uric máu ................................................................................ 5
1.2. XANTHIN OXIDASE VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE .. 8
1.2.1. Xanthin oxidase ...................................................................................... 8
1.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase.......................................................... 13
1.3. TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae) ............ 15
1.3.1. Tên khoa học ........................................................................................ 15
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 15
1.3.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 16
1.3.4. Công dụng ............................................................................................ 19
1.3.5. Tác dụng dược lý .................................................................................. 19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 21
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ............................................................................ 21
2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .................................................................... 21
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................... 24
2.2.1. Động vật thí nghiệm.............................................................................. 24
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử .............................................................................. 24


2.2.3. Thiết bị .................................................................................................. 24
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 25
2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô

hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm bằng kali oxonat ............... 27
2.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao dược liệu lên hoạt độ
xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm .............................................. 28
2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên
đĩa UV 96 giếng Costar ........................................................................ 30
2.3.4. Phương pháp xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất
có tiềm năng nhất ................................................................................. 32
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 34
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 35
3.1. TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT THANH THỰC NGHIỆM CỦA
CAO TOÀN PHẦN TỎA DƯƠNG IN VIVO ........................................... 35
3.1.1. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm của cao toàn phần tỏa
dương trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat ........... 35
3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương lên hoạt độ xanthin
oxidase gan chuột thực nghiệm. .......................................................... 36
3.2. SÀNG LỌC KHẢ NĂNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO
CỦA CAO TOÀN PHẦN, CÁC PHÂN ĐOẠN, CÁC CHẤT TINH KHIẾT
CỦA TỎA DƯƠNG .................................................................................. 37
3.2.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của cao toàn phần và các cao
phân đoạn tỏa dương ........................................................................... 37
3.2.2. Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các chất tinh khiết ...... 39
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CƠ CHẾ CỦA BLE1 ........................................... 41
Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 44
4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT THANH THỰC NGHIỆM CỦA
CAO TOÀN PHẦN TỎA DƯƠNG ........................................................... 44


4.1.1. Về tác dụng hạ acid uric huyết thanh của cao toàn phần tỏa dương . 44
4.1.2. Về ảnh hưởng lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm của
cao toàn phần tỏa dương...................................................................... 45

4.2. VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA CAO
TOÀN PHẦN, CÁC PHÂN ĐOẠN, CÁC CHẤT TINH KHIẾT CỦA TỎA
DƯƠNG. ................................................................................................... 47
4.2.1. Về cao toàn phần và các phân đoạn của tỏa dương ........................... 47
4.2.2. Về các chất đã phân lập ........................................................................ 48
4.3. VỀ CƠ CHẾ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA BLE1 ..... 49
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 52
1. VỀ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT THANH THỰC NGHIỆM .... 52
2. VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO................... 52
3. VỀ CƠ CHẾ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA BLE1 ..... 52
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ABCG2

: ATP-binding cassette sub-family G member 2

AMP

: Adenosin monophosphat

ATP

: Adenosin triphosphat

BCRP

: Breast cancer resistence protein

CFGP

: 1-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranose

CMGP

: 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose

CHDGP

: 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-Dglucopyranose

DMSO

: Dimethyl sufoxid

EtOAc

: Ethyl acetat

GHDGP

: 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose

GMP

: Guanosin monophosphat

IC50

: Liều ức chế 50% hoạt độ enzym

IMP

: Inosin monophosphat

LD50

: Liều tối thiểu gây chết 50% động vật thí nghiệm

Na-CMC : Natri carboxymethyl cellulose
NF-κB

: Nuclear factor-kappa-B

OAT

: Organic anion transporter (kênh vận chuyển anion hữu cơ)

PRPP

: Phospho ribosyl pyrophosphat

SCL2A9

: Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9
protein

URAT1

: Urat transporter 1 (kênh vận chuyển urat 1)

XO

: Xanthin oxidase


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Phân loại nguyên nhân gây tăng acid uric theo sinh lý bệnh

6

1.2

Mối liên quan giữa các thông số Vmax biểu kiến, Km biểu kiến

11

1.3

Công thức hóa học và tên khoa học của 19 hợp chất đã phân lập

16

2.1

Hàm ẩm và hiệu suất của cao toàn phần và các cao phân đoạn

22

của tỏa dương
2.2

Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng

31

3.1

Ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương đến nồng độ acid uric

35

huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm
3.2

Ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương lên hoạt độ xanthin

36

oxidase gan chuột nhắt trắng thực nghiệm

3.3

Ảnh hưởng cao toàn phần, các cao phân đoạn của tỏa dương và

38

allopurinol lên hoạt độ xanthin oxidase in vitro ở các nồng độ
khác nhau
3.4

Nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của

39

allopurinol, cao toàn phần và các cao phân đoạn tỏa dương
3.5

Ảnh hưởng của các chất tinh khiết lên hoạt độ xanthin oxidase

40

in vitro ở các nồng độ khác nhau
3.6

Nồng độ ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase (IC50) của các

41

chất tinh khiết
3.7

Kết quả đo mật độ quang acid uric tạo thành ở các nồng độ

42

xanthin thay đổi
3.8

Các thông số của phương trình Lineweaver - Burk

43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của acid uric

3

1.2

Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể

4

1.3

Các kênh vận chuyển acid uric ở ống thận

5

1.4

Cơ chế phản ứng của xan thin oxidase

9

1.5

Đồ thị Lineweaver - Burk

10

1.6

Đồ thị Lineweaver - Burk đối với các cơ chế khác nhau

12

2.1

Mẫu dược liệu tỏa dương

21

2.2

Sơ đồ chiết xuất dược liệu

23

2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

26

2.4

2.5
2.6
3.1
4.1

Quy trình tiến hành thí nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric
cấp bằng kali oxonat
Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
in vitro
Quy trình xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro
Đồ thị Lineweaver - Burk của enzyme xanthin oxidase
khi có mặt và không có mặt BLE1
Sự phụ thuộc của V0 vào nồng độ cơ chất

28

32
33
42
50


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xanthin oxidase (XO) là một enzym quan trọng trong cơ thể người, có vai
trò then chốt trong điều hòa chuyển hóa purin. Chức năng chính của XO là
chuyển hypoxanthin thành xanthin và chuyển xanthin thành acid uric [22], [31].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nồng độ acid uric cao, kéo dài là nguyên nhân
gây bệnh viêm khớp, gút, bệnh thận cấp và mạn tính do lắng đọng các tinh thể
urat. Ngày càng có nhiều bằng chứng về mối liên quan giữa tăng acid uric máu
với các rối loạn chuyển hóa nghiêm trọng khác như tăng huyết áp, bệnh thận
mạn tính, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [10], [27], [64], [71].
Các chất ức chế XO thường được sử dụng để điều trị gút và tăng acid uric
máu bằng cách ngăn cản phản ứng enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid
uric, giảm sự hình thành acid uric và triệu chứng bệnh [45], [60]. Các thuốc ức
chế XO sử dụng trong y học hiện đại như là allopurinol, febuxostat có tác dụng
hạ acid uric tốt, tuy nhiên thuốc này có thể gây ra một số tác dụng không mong
muốn [24], [72]. Các tác dụng không mong muốn này là động lực thúc đẩy các
nhà khoa học nỗ lực tìm ra các chất ức chế XO mới và an toàn. Đặc biệt, một số
nghiên cứu dược liệu gần đây đã tìm ra các chất ức chế có nguồn gốc tự nhiên
[16], [29], [73].
Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào. Các nhà
khoa học Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu về tác dụng hạ acid uric máu
của dược liệu và đã có những thành công nhất định.
Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl, họ Dó đất Balanophoraceae) là

một dược liệu quý, từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhức
mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung và trĩ, làm thuốc bổ cho
người già, người mới ốm dậy, và phụ nữ sau khi sinh [2]. Một số nghiên cứu đã
cho thấy cao chiết tỏa dương có tác dụng chống oxy hóa tốt. Hơn nữa, các loài
Balanophora còn chứa một lượng lớn các tanin thủy phân và các hợp chất
phenolic [33], [35]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh một số hợp chất phenolic

1


có khả năng ức chế mạnh XO và tác dụng điều trị của các hợp chất này có thể do
khả năng chống oxy hóa và khả năng ức chế enzym này [16], [31], [45]. Gần
đây, nghiên cứu của tác giả Ho S.T và cộng sự về tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase của tỏa dương cho thấy các chất phân lập từ dược liệu này có khả năng
giảm acid uric máu [34]. Để góp phần cung cấp thêm những bằng chứng khoa
học về việc sử dụng tỏa dương như một dược liệu có tiềm năng hạ acid uric máu,
đề tài “Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin
oxidase của tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae)”
được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm của cao toàn
phần tỏa dương in vivo
2. Sàng lọc khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn
và một số hợp chất phân lập từ tỏa dương.
3. Xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất có tiềm năng
nhất.

2


Chương 1. TỔNG QUAN

1.1.

TĂNG ACID URIC MÁU

1.1.1. Sinh chuyển hóa acid uric
1.1.1.1. Chuyển hóa purin và sự hình thành acid uric trong cơ thể
Các nucleosid nhân purin được sử dụng để tạo thành các yếu tố quan
trọng trong chuyển hóa như ATP, GTP, AMP vòng, S-adenosylmethionin,
nicotinamid adenin dinucleotid (NADH), và nicotinamid adenin denucleotid
phosphat (NADPH). Các purin và chất chuyển hóa của chúng bao gồm: adenin,
guanin, isoguanin, hypoxanthin, xanthin, theobromin, caffein, và acid uric.
Quá trình chuyển hóa purin bao gồm nhiều phản ứng được xúc tác bởi các
enzym khác nhau như AMP deaminase, adenosine deaminase, 5’- nucleosidase,
purin nucleosid phosphorylase, guanin deaminase, và xanthin oxidase. Ở hầu hết
động vật có vú khác, các purin trước hết được chuyển thành sản phẩm trung gian
là acid uric, sau đó chuyển thành allantoin dưới tác dụng của enzym uricase.
Ngược lại, ở người và các loài linh trưởng, do thiếu hụt enzym uricase nên acid
uric là sản phẩm cuối cùng của chuyển hóa purin được tạo thành nhờ sự oxy hóa
xanthin bởi xanthin oxidase. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể người
được thể hiện ở hình 1.2 [37].
Acid uric (2,6,8-trihydroxypurin, C5H4N4O3) là một acid yếu với pKa1 ≈
5,4 và pKa2 ≈ 10,3. Tại pH sinh lý 7,4 ở dịch ngoại bào, 99% acid uric bị ion
hóa thành urat. Ở đường niệu pH = 5,7, acid uric dạng tự do chiếm ưu thế. Công
thức hóa học của acid uric được thể hiện ở hình 1.1 [30].

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid uric [37]
3


Hình 1.2. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [37]

1.1.1.2. Quá trình thải trừ acid uric ra khỏi cơ thể
Thận thải trừ 2/3 lượng acid uric được tạo ra hàng ngày, trong khi 1/3 còn
lại bị phân hủy bởi các vi khuẩn đường ruột và thải trừ qua phân [18], [25], [39],
[64]. Quá trình thải trừ qua thận ảnh hưởng nhiều nhất đến nồng độ acid máu,
với hơn 90% trường hợp tăng acid uric máu là do giảm bài tiết ở thận [37]. Tại
thận, acid uric được lọc qua cầu thận, sau đó được bài tiết, tuy nhiên 90% được
tái hấp thu và quay trở lại máu [21], [24], [64].
Các anion urat đi qua màng tế bào thông qua các kênh vận chuyển đặc
hiệu. SLC22A12 (URAT1) và SLC2A9 (URAT1/GLUT9) là 2 kênh đóng vai trò
chủ yếu đối với sự tái hấp thu acid uric vào máu [23], [46], [51], [77], [78].
SLC2A9 là kênh vận chuyển acid uric quan trọng nhất, có công suất vận chuyển
cao hơn URAT1 nhiều lần [63]. Các kênh SLC22A6 (OAT1), SLC22A8
(OAT3), SLC17A3 (NPT4), ABCC4 (MRP4), và ABCG2 (BCRP) tham gia vào

4


quá trình bài tiết acid uric vào nước tiểu [36], [37], [42], [52], [65]. Vai trò của
các kênh vận chuyển acid uric ở ốn thận được thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3. Các kênh vận chuyển acid uric ở ống thận [37]
1.1.2. Tăng acid uric máu
1.1.2.1. Khái niệm tăng acid uric máu
Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric máu trên 7,0
mg/dL (tức trên 0,42 mmol/L) và trên 6,0 mg/dL (tức trên 0,36 mmol/L) đối với
nữ [21], [62].
1.1.2.2. Nguyên nhân gây tăng acid uric máu
Nguyên nhân gây tăng acid uric máu có thể do tăng sản xuất, giảm thải trừ
acid uric hoặc cả hai [26].
Phân loại nguyên nhân gây tăng acid uric máu theo sinh lý bệnh được thể

hiện ở bảng 1.1.

5


Bảng 1.1. Phân loại nguyên nhân tăng acid uric theo sinh lý bệnh [26]
Tăng sản xuất acid uric
Nguyên phát

Tăng hồng cầu vô căn

Thiếu hụt HPRT

Vảy nến

Tăng PRPP synthetase

Bệnh Paget

Tan máu

Glycogenosis III, V, VII

Tăng sinh mô bạch huyết

Globin cơ niệu kịch phát

Bệnh tăng sinh tủy xương

Luyện tập nặng

Rượu

Chế độ ăn giàu purin

Béo phì
Giảm thải trừ acid uric
Nguyên phát

Nhiễm độ Berili

Tăng năng tuyến cận giáp

Bệnh sarcoid

Giảm năng tuyến giáp

Nhiễm độc chì

Thận đa u nang

Nhiễm độc thai nghén

Đái tháo đường

Hội chứng Bartter

Tăng huyết áp

Hội chứng Down

Nhiễm acid Rượu
Nhiễm keto Dùng thuốc

Kết hợp
Thiếu hụt Glucose-6-phosphatase
Thiếu hụt fructose-1-phosphat aldolase
Rượu
Sốc

6


1.1.2.3. Tăng acid uric máu và các bệnh liên quan
 Tăng acid uric máu và gút
Gút là bệnh đặc trưng bởi tăng acid uric máu và sự lắng đọng các tinh thể
urat ở các khớp nối. Bệnh ảnh hưởng đến 1- 2% người trưởng thành ở các nước
phát triển, hay gặp ở nam giới và phụ nữ lớn tuổi với mức độ ngày càng tăng
[64].
Tăng acid uric máu là yếu tố nguy cơ hàng đầu đối với sự tiến triển bệnh
gút, mặc dù có khoảng 2/3 hoặc hơn các trường hợp tăng acid uric máu không có
triệu chứng. Nguy cơ bị gút tăng theo tuổi và nồng độ acid uric máu [66].
 Tăng acid uric máu và hội chứng chuyển hóa
Tăng acid uric máu liên quan đến hội chứng chuyển hóa do kháng insulin
và tăng insulin máu vì insulin làm giảm thải trừ acid uric qua thận [10]. Kết quả
của một vài nghiên cứu cho thấy tăng acid uric máu dẫn đến béo phì, đái tháo
đường, thậm chí tăng insulin máu [12], [15]. Trên mô hình động vật, các chất ức
chế xanthin oxidase làm giảm nồng độ acid uric máu có tác dụng ngăn ngừa
hoặc đẩy lùi dấu hiệu và triệu chứng của hội chứng chuyển hóa [67].
 Tăng acid uric máu và tăng huyết áp

Các nghiên cứu trước đây hướng đến giả thuyết tăng huyết áp làm tăng
acid uric máu bằng nhiều cơ chế khác nhau, đặc biệt bằng cách tăng tái hấp thu
acid uric tại thận do giảm lượng máu đến thận. Tuy nhiên, các nghiên cứu lâm
sàng và thực nghiệm gần đây chứng minh tăng acid uric có thể dẫn đến tăng
huyết áp. Quan sát trên mô hình động vật thể hiện sự co mạch máu thận qua
trung gian acid uric, nồng độ nitric oxid nội bào giảm, sự hoạt hóa hệ
angiotensin ở thận, các tổn thương do oxy hóa quá mức dẫn đến tăng huyết áp
[53].
 Tăng acid uric máu và bệnh tim mạch
Nồng acid uric máu cao có liên quan đến các biến cố tim mạch, trong đó
acid uric đóng vai trò trung gian. Cơ chế chính xác vẫn chưa rõ ràng, song có thể
do ức chế sự sản xuất nitric oxid, sự kết tập tiểu cầu …[71].
7


1.2.

XANTHIN OXIDASE VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE

1.2.1. Xanthin oxidase
1.2.1.1. Phân bố, cấu trúc, cơ chế hoạt động, các thông số động học
 Phân bố
Ở người, XO thường được tìm thấy chủ yếu ở gan và trong máu. XO cũng
được phát hiện trong một số mô của động vật có vú, ở chim, côn trùng, và vi
khuẩn. Ở động vật, XO được tìm thấy trong tế bào gan, tế bào ruột, ngoài ra còn
thấy trong tế bào thận, dạ dày, huyết thanh và phổi, nồng độ thấp thấy ở trong
xương, cơ, tim và não [9].
 Cấu trúc
Xanthin oxidase là một homodimer, khối lượng phân tử 283 – 290 KDa,
gồm hai monomer khối lượng phân tử khoảng 150 – 155 KDa. Mỗi monomer

gồm 3 tiểu đơn vị với khối lượng 20, 40, 85 KDa, chúng có thể tách rời nhau
trong điều kiện biến tính mạnh. Mỗi monomer gồm 2 Fe2S2 ở tiểu đơn vị 20
KDa, 1 phân tử flavin adenin dinucleotid (FAD) ở tiểu đơn vị 40 KDa, và phần
phụ molybdenum (Mo) gắn với enzym như molybdopterin ở tiểu dơn vị 85 KDa
[11], [32].
 Các thông số động học của enzym
Các thông số động học của enzym bao gồm Km (hằng số Michaelis Menten) và Vmax (tốc độ phản ứng cực đại) với Km là nồng độ cơ chất khi V0 = ½
Vmax (V0 là vận tốc ban đầu của phản ứng). Giá trị Km được xác định bằng
phương pháp đo quang và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nằm
trong khoảng 5,32 - 13,8 µM [40].
 Cơ chế hoạt động
Sự xúc tác bắt đầu bằng việc phân tử Mo-OH tấn công ái nhân vào carbon
C-8 của xanthin đồng thời vận chuyển hydro từ C-8 đến Mo-S, dẫn đến Mo (VI)
bị khử thành Mo (IV). Sự oxi hóa lại trung tâm molypden diễn ra bởi sự vận
chuyển electron đến các trung tâm hoạt động oxi hóa khử khác của enzym, đồng
8


thời giải phóng proton khỏi liên kết Mo-SH và thay thế bằng OH từ dung môi,
tái tạo lại nhóm Mo-OH ban đầu [13].

Hình 1.4. Cơ chế phản ứng của xanthin oxidase [13]
1.2.1.2. Vai trò của xanthin oxidase
Chuyển hóa purin: chức năng sinh lý hàng đầu của xanthin oxidase là
enzym xúc tác cho hai phản ứng cuối cùng của chuyển hóa purin, hình thành
xanthin từ hypoxanthin và acid uric từ xanthin.
Hình thành các chất chống oxy hóa và chất oxy hóa: acid uric là chất
chống oxy hóa quan trọng, có tác dụng bảo vệ các phân tử đích sinh học khỏi sự
oxy hóa của gốc hydroxyl, acid hypochlorid và peroxynitrit. Xanthin oxidase
cũng được coi là nguồn sinh học quan trọng của các gốc superoxid. Các gốc

superoxid và các gốc chứa oxy hoạt động khác (ROS) tham gia vào quá trình
oxy hóa của cơ thể, liên quan đến nhiều quá trình bệnh sinh như: viêm, xơ vữa
động mạch, ung thư, lão hóa …
Truyền tín hiệu: một số nghiên cứu đã chứng minh XO có vai trò kích
thích đại thực bào, tăng cường hoạt hóa adenylyl cyclase, cảm ứng biểu hiện của
c-myc và c-fos ở tế bào JB6 …
9


Chuyển hóa thuốc: XO là một enzym tế bào chất, hỗ trợ cho hệ
cytochrom P450 trong chuyển hóa thuốc [61].
1.2.1.2. Cơ chế ức chế xanthin oxidase
Động học Michaelis - Menten là mô hình động học đơn giản và nổi tiếng
nhất, đưa ra công thức mô tả mối liên quan giữa tốc độ phản ứng enzym và nồng
độ cơ chất. Phương trình Michaelis - Menten như sau:
Vmax.[S]
V0 =

Km + [S]

Dạng đường thẳng của phương trình Michaelis - Menten được sử dụng để
xác định các thông số động học của enzym:
1
V0

Km
=

Vmax.[S]

1
+

Vmax

gọi là phương trình Lineweaver - Burk. Dạng đồ thị Lineweaver-Burk được thể
hiện ở hình 1.5 [44].

Hình 1.5. Đồ thị Lineweaver - Burk [44]
(Slope: độ dốc, V0: Vận tốc ban đầu, Vmax: vận tốc cực đại, Km: hằng số
Michaelis - Menten)

10


Các cơ chế ức chế enzym bao gồm cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive
inhibition), ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibiton), và ức chế hỗn
hợp (mixed inhibition). Ngoài còn có cơ chế noncompetitive inhibition là trường
hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp [44].
Mối liên quan giữa các thông số động học của enzym khi có mặt và không
có mặt chất ức chế được thể hiện ở bảng 1.2 [44].
Bảng 1.2. Mỗi liên quan giữa cơ chế ức chế và các thông số
Vmax biểu kiến, Km biểu kiến
Cơ chế ức chế

Vmax biểu kiến

Km biểu kiến

Không ức chế

Vmax

Km

Ức chế cạnh tranh (competitive)

Vmax

αKm

Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive)

Vmax/α’

Km/α’

Ức chế hỗn hợp (mixed)

Vmax/α’

αKm/α’

Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive)

Vmax/α

Km

Cơ chế ức chế được xác định thông qua đồ thị phương trình Lineweaver Burk, là đồ thị hàm số 1/V đối với 1/[S], với sự có mặt và không có mặt chất ức

chế ở các nồng độ khác nhau (ký hiệu là I). Hình 1.6 thể hiện đồ thị hàm số
Lineweaver - Burk đối với các cơ chế khác nhau.

11


Hình 1.6. Đồ
ồ thị Lineweaver - Burk đối với các cơ chếế khác nhau [44]
(A: cơ chếế ức chế cạnh tranh (competitive); B: ccơ chếế ức chế không cạnh tranh
(uncompetitive), C: cơ chế
ch ức chế hỗn hợp (mixed), slope: độộ dốc, min: phút)
phút
Trong cơ chếế ức chế cạnh tranh, các đường
đ ờng thẳng đồng quy tại một điểm
nằm trên trục
ục tung. Đối với cơ
c chếế ức chế không cạnh tranh (uncompetitive), các
đường
ờng thẳng song song với nhau. Ở cơ
c chếế ức chế hỗn hợp (mixed), các đ
đường
thẳng
ẳng giao nhau tại một điểm nằm ở góc phần tư
t thứ 4. Trường
ờng hợp đặc biệt của
cơ chếế ức chế hỗn hợp là
l cơ chếế không cạnh tranh (noncompetitive), điểm giao
nhau này nằm trên trục
ục ho
hoành.

12


1.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase
1.2.2.1. Allopurinol và Febuxostat


Allopurinol
Allopurinol có cấu trúc tương tự purin, là một chất ức chế cạnh tranh

xanthin oxidase, được FDA cấp phép phê duyệt năm 1966 để điều trị gout và là
một chất quan trọng trong điều trị tăng acid uric máu tiên phát và thứ phát [43].
Các tác dụng không mong muốn của allopurinol như: kích ứng đường tiêu
hóa, ban da, phản ứng quá mẫn, hội chứng Steven-Johnson’s. Allopurinol được
yêu cầu giảm liều ở bệnh nhân suy thận. Tương tác thuốc cũng là một giới hạn
trong việc sử dụng allopurinol. Mức độ ban da tăng khi sử dụng allopurinol cùng
với ampicillin hoặc amoxicillin. Sử dụng allopurinol cùng vơi theophillin hoặc
warfarin sẽ gây ra độc tính trên bệnh nhân [68].
 Febuxostat
Febuxostat là chất có cấu trúc không tương tự purin, được sử dụng ở bệnh
nhân bị gút không dung nạp hoặc không đáp ứng với allopurinol, được cấp phép
lần đầu tiên năm 2009 và bị chuyển hóa tại gan. Febuxostat hiệu quả hơn
allopurinol trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận nhẹ và vừa khi sử dụng ở
liều thông thường, ít tương tác thuốc hơn, dung nạp tốt hơn trên bệnh nhân quá
mẫn với allopurinol. Tuy nhiên, một số thử nghiệm lâm sàng gần đây quan sát
thấy các biến cố tim mạch gặp nhiều hơn ở các bệnh nhân sử dụng febuxostat so
với allopurinol. Giá thành cao cũng là một hạn chế trong sử dụng febuxostat
[68].
1.2.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase có nguồn gốc tự nhiên
Gupta và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế XO của dịch chiết ethanol

của các cây họ Celastraceae và Lamiaceae ở Panama. Kết quả cho thấy họ
Lamiaceae có tác dụng ức chế XO tốt. Dịch chiết ethanol của Hyptis obtusiflora
Presl. ex. Benth (Lamiaceae) và Hyptis lantanaefolia Poit. (Lamiaceae) ức chế
40% hoạt độ XO ở nồng độ 1 µg/ml [29]. Năm 1999, Owen và cộng sự đã tiến
hành sàng lọc để đánh giá tác dụng ức chế XO của nhiều loài thực vật ở miền
13


Nam Nam Mỹ thuộc các họ: Apocynaceae, Araliaceae, Asteraceae,
Berberidaceae, Caprifoliaceae …, trong đó dịch chiết methanol của Larix
laricina (Duroi) K. Koch. có tác dụng mạnh nhất. Nhiều cây khác cũng có tác
dụng ức chế XO tốt như: Achillea millifolium L., Ledum groenlandicum Oeder.,
Populus babamifera L. và Veronica officinale L. Tác dụng này đến từ các hợp
chất phenolic và tannin có trong cây [59]. Acid lithospermic, được phân lập từ rễ
của Salvia mitiorrhiza, một dược liệu phổ biến trong thuốc phương Đông có tác
dụng ức chế sự hình thành acid uric và các gốc superoxide mạnh với giá trị IC50
lần lượt là 5,2 và 1,08 µg/ml [49]. Shen và Ji đã sử dụng phương thức MDS
(molecular docking simulation) và quan sát thấy các sản phẩm thoái hóa của
curcumin

như

trans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal,

aldehyd ferulic, acid ferulic, feruloyl methan và vanillin thể hiện tác dụng ức chế
XO tốt [48]. Các phenyl propanoid là các chất ức chế cạnh tranh XO [14].
Umamaheshwari đã tiến hành thử nghiệm trên 6 loài thực vật thuộc các họ khác
nhau thường được sử dụng để điều trị gút và các triệu chứng liên quan ở Ấn Độ.
Tác dụng ức chế XO của dịch chiết methanol của Coccinia granids, Datura
metel, Strychnos nuxvomica và Vitex negundo là do thành phần polyphenol và

flavonoid trong cây [74]. Jiao và cộng sự đã phân lập được một dẫn xuất mới của
apigenin trong dịch chiết ethanol của Palhinhaea cernua, cấu trúc được xác định
là apigenin-4’-O-(2’’-O-p-coumaryl)-β-D-glucopropanosid. Chất này thể hiện
tác dụng ức chế XO tốt [38]. Wang và cộng sự đã chứng minh tác dụng ức chế
XO tốt của tinh dầu từ lá của Cinnamomum osmophloeum (Lauraceae) do
cinnamaldehyd - thành phần chính trong tinh dầu mang lại [79].
Trong các flavonoid được tìm thấy ở thực vật, apigenin có tác dụng mạnh
nhất., quercetin, myricetin, và genistein có tác dụng ức chế XO tốt theo cơ chế
cạnh tranh [47], [76]. Các nghiên cứu sâu hơn về mối liên quan giữa cấu trúc tác
dụng của các flavonoid cũng được tiến hành [19], [20]. Các dẫn xuất coumarin
được chứng minh ức chế XO mạnh, đặc biệt là esculein (IC50 = 8,2 µM) và 4methylesculein. Hai hợp chất này chứa các nhóm hydroxyl ở vị trí số 6 và 7 [28],
14


[48]. Silva và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất có tác dụng thu
dọn gốc tự do silibinin và benzadac lên hoạt tính XO. Silibinin ức chế cả 3 dạng
của enzym (XDH, XO thuận nghịch và XO không thuận nghịch), trong khi
benzadac ức chế chọn lọc XO [70]. Acid phytic - một phân tử dễ bị phosphoryl
hóa, có nhiều ở trong cây, chiếm 1 - 5% khối lượng của rau ăn, ngũ cốc, và hạt;
acid reductic - một chất có cấu trúc tương tự như acid ascorbic được chứng mình
có tác dụng ức chế XO [50], [55].
1.3. TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae)
1.3.1. Tên khoa học
Tỏa dương còn có tên khác là nấm đất (dó đất, cu chó, dó đất hoa thưa)
Tên khoa học: Balanophora laxiflora Hemsl., thuộc họ Dó đất
(Balanophoraceae) [1], [2], [3].
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây cỏ mập, sống kí sinh trên rễ, màu nâu đỏ, cao 10 - 20 cm, không có
diệp lục. “Củ” hình trứng, đường kính 2 - 2,5 cm, bề mặt sần sùi và có mụn hình
sao nổi rõ. Thân khí sinh (là cuống cụm hoa) mang 5 - 10 lá dạng vảy ở phía

gốc, phiến lá hình mũi mác, cỡ 2 - 2,5 × 1 - 1,5 cm.
Hoa đơn tính khác gốc, hợp thành cụm hoa hình bông nạc. Cụm hoa đực
hình trụ, gồm những hoa gần như không cuống, bao gồm 6 mảnh, trong đó 2
mảnh giữa (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh bên hình trái xoan tròn
đầu; khối phấn bị ép ngang. Hoa cái hình bầu dục thuôn, không có bao hoa, mọc
ở quanh chân của vảy bảo vệ, vảy hình trứng lõm ở đỉnh, 1 vòi nhụy. Mùa hoa
tháng 10 - 12.
Cây mọc rải rác trong rừng cây lá rộng, nơi ẩm, ở độ cao 600 - 2000 m,
thường kí sinh trên rễ cây gỗ và cây bụi như đỗ quyên, sồi, thông v.v… Ra hoa
vào tháng 11 - 12. Tái sinh bằng đẻ nhánh.

15


Ở Việt Nam: tỏa dương phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Ninh Bình (Cúc
Phương), Kon Tum (Ngọc Guga, Ngọc Pan).Trên thế giới: tỏa dương có ở Trung
Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào [1], [2], [3].
1.3.3. Thành phần hóa học
Năm 2009, tác giả She G.M. và cộng sự đã phân lập 19 hợp chất gồm:
balaxiflorin A và B, 3 hợp chất phenylpropanoid, 4 hợp chất Lignan, 9 hợp chất
tannin thủy phân, và acid gallic [69].
Bảng 1.3. Công thức hóa học và tên khoa học của
19 hợp chất đã phân lập [69]
STT
1

Tên hoạt chất

Công thức hóa học

(7’S, 8R, 8’R)-9-Ogalloyllariciresinol-4’-Oβ-D-glucopyranosid

2

6’-O-(E)-caffeoyl
coniferin

3

coniferin

4

Lariciresinol-4’-O-β-Dglucopyranosid

16